הערכה רב-גורמית של התנהגות מוטורית בחולדות לאחר פציעת ריסוק עצבית סיאטית חד-צדדית

Susanne Knorr; Lisa Rauschenberger; Tami Lang; Jens Volkmann; Chi Wang Ip

doi:10.3791/62606

Summary

אנו מספקים פרוטוקול להערכת התנהגות מוטורית באמצעות סוללת בדיקה התנהגותית בחולדות לאחר פציעת ריסוק עצבים סיאטית.

Abstract

אינדוקציה של פגיעה עצבית היקפית היא שיטה בשימוש נרחב במדעי המוח להערכת מנגנוני תיקון וכאב בין היתר. בנוסף, בתחום המחקר של הפרעות תנועה, פציעת מעיכה סיאטית הופעלה כדי לעורר פנוטיפ דמוי דיסטוניה במודלים מכרסמים DYT-TOR1A נטייה גנטית של דיסטוניה. כדי להשיג תוצאות עקביות, לשחזור ודומות לאחר פגיעה מעיכה עצבית סיאטית, שיטה סטנדרטית לגרימת ריסוק העצבים היא חיונית, בנוסף לאפיון פנוטיפי סטנדרטי. יש להקדיש תשומת לב לא רק למגוון הספציפי של בדיקות התנהגותיות, אלא גם לדרישות הטכניות, הביצוע הנכון וניתוח נתונים עוקבים. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבצע פציעת ריסוק עצבית סיאטית ומספק סוללת בדיקה התנהגותית להערכת ליקויים מוטוריים בחולדות הכוללת את מבחן השדה הפתוח, ניתוח ההליכה CatWalk XT, משימת ההליכה בקרן ומשימת ההליכה של שלל הסולם.

Introduction

מכרסמים הם אורגניזמים מודל מעולה להעמיק את ההבנה של מחלות אנושיות¹^,² על ידי בדיקת השערות ברמות ביולוגיות מרובות. רמה ביולוגית בסיסית אחת לאפיון מודלים של מכרסמים היא רמת הפנוטיפ, הנמדדת על ידי הערכות התנהגותיות. בהתאם למודל החי ולשאלת המחקר המדעי, הבחירה בסוללת בדיקה התנהגותית רבת עוצמה ואמינה חיונית לכיסוי מגוון רחב של היבטים התנהגותיים כגון מודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון ודיסטוניה³^,⁴^,⁵^,⁶.

העצב הסיאטי הוא העצב הגדול ביותר בגוף האדם עם מנוע, כמו גם סיבים חושיים. פציעות של העצב הסיאטי יכולות לנבוע בקלות ממגוון אירועים כגון תאונות דרכים וניתוחים⁷^,⁸. לכן, פעילויות מחקר באמצעות מודלים מכרסמים עם פציעות עצבים sciatic, הם בעלי ערך רלוונטי תרגום. למרות ההיבט התרגומי של התחדשות עצבים מעכברוש לאדם יש להתייחס באופן ביקורתי⁹, פציעת ריסוק עצבים sciatic (axonotmesis) במודלים מכרסמים היא שיטה נפוצה לניתוח ניוון ותהליכי התחדשות של עצבים היקפיים¹⁰^,¹¹. במקרה של פציעת מעיכה העצב אינו מנוכה לחלוטין. זה פוגע באקסון, וכתוצאה מכך בלוק הולכה מיד לאחר פציעת ריסוק ואחריו תהליכים רגנרטיביים ⁴^,¹²^,¹³.

יתר על כן, במחקר דיסטוניה, פגיעה חד צדדית מעיכה עצבית היא שיטה הוקמה כדי לעורר תנועות כמו דיסטוניה (DLM) במודלים מכרסמים דיסטוניה נטייה גנטית, אשר אינם מראים DLM כשלעצמה⁴^,¹⁴. ההנחה היא כי הטראומה העצבית ההיקפית מפריעה לאינטגרציה החושית על ידי השפעה על סיבי העצב הסיאטיים, האחראים לתפקודים מוטוריים וחושיים¹⁵.

אנו מספקים תיאור מפורט עבור פציעת ריסוק סטנדרטית של העצב הסיאטי וסוללה של הערכות התנהגות מוטורית המורכבת ממבחן השדה הפתוח (OFT), ניתוח הליכה CatWalk XT, משימת הליכה קרן ומשימת הליכה בסולם דרגות בחולדות סוג פראי נאיבי (n = 8-9) וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצבים סיאטית חד צדדית (n = 10). OFT מספק מידע על פעילות לוקומוטור כללית, בעוד ניתוח הליכה מפורט מושגת על ידי מערכת ניתוח הליכה אוטומטי CatWalk XT. משימת ההליכה בקרן משמשת להערכת התיאום המוטורי על ידי הערכת הזמן לחצות את הקרן ואת מספר שגיאות מיקום כף הרגל. עבור ניתוח ביצועי הליכה משימת ההליכה של סולם דרגה מספקת מידע על מיקום כף הרגל או כף הרגל ושגיאות במנגנון צלצל סולם אופקי עם תבנית צלצל קבועה אך לא סדירה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הרשויות המקומיות ב- Regierung von Unterfranken (וירצבורג, גרמניה) ובוצעו בהתאם להנחיות הבינלאומיות, הלאומיות ו/או המוסדיות הרלוונטיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. פציעת מעיכה עצבית סיאטית

הערה: לשמור על סביבה סטרילית במהלך כל ההליך הכירורגי. תארגן את שולחן הניתוחים עם הציוד הדרוש.

מאוד להרדים את החולדה בארון סגור עם isoflurane 3.0% ב O₂ (2 L / min). תוציא את החולדה מהארון. לגלח שטח נרחב של hindlimb הימני.
מקם את החולדה לתוך מסכת הרדמה ולהמשיך הרדמה עמוקה עם isoflurane 2.0% ב O₂ (2 L / min). לשלוט בעומק ההרדמה על ידי צביטת webbing interdigital של הרגליים האחוריות. היעדר רפלקסים נסיגה מצביע על הרדמה נאותה.
לתקן את פלג הגוף העליון ואת שני hindlimbs של החולדה עם קלטת. מניחים את שני הישבים בתנוחה סימטרית ומושטת על ידי הפיכת הכף שטוחה על שולחן הניתוחים.
יש למרוח משחה עיניים כדי למנוע עיניים יבשות. לחטא את העור של האזור מגולח עם חיטוי.
חפש את החריץ הסיאטי של האיליום.
הפוך חתך בעור מן חריץ sciatic לכיוון הכף עם אזמל. חתך העור צריך להיות קטן ככל האפשר (כ 1 עד 2 ס"מ).
אם הישבנים האחוריים קבועים וחתך העור מבוצע כראוי, ניתן לראות חלל במישור fascial בין שריר gluteus maximus ושריר femoris שרירי הזרוע דומה "קו לבן". הכנס מלקחיים hemostatic סופר דק סגור (מס '5) לתוך החלל ולהפיץ את המלקחיים. המטוס הקסאלי צריך להיפתח מבלי לפגוע ברקמת שריר.
מניחים את מחזר גומי מתחת לשרירים, כדי לשמור על חתך העור פתוח.
הסר בעדינות את כל הרקמות וכלי הדם שמסביב מהעצב הסיאטי עד שהעצב נחשף לחלוטין. חשוב לא למתוח או למשוך את העצב במהלך כל ההליך.
מועכים את העצב הסיאטי עם מהדק לא משונן (המוסטט דק במיוחד) עם לחץ קבוע וניתן לשחזור. בשביל זה, לפתוח את המהדק, למקם את העצב על הלסת התחתונה של המהדק ולסגור את המהדק על ידי נעילתו לתנוחה הראשונה במשך שלוש פעמים עשר שניות. המיקום של ריסוק העצב הסיאטי ממוקם קרוב לחריץ הסיאטי, קרוב לאתר החלוקה של צרור העצבים הסיאטי הראשי. לאחר פציעת הריסוק, פתח מחדש את המהדק בזהירות. אתר ההידלקות של העצב הסיאטי נראה שקוף.
הסר את מחזר גומיות.
סגור את חתך המטוס fascial עם תפר 4-0 resorbable. סגור את החתך בעור עם סיכות עור הגוף.
החל Rimadyl על פי הנחיות GV-SOLAS (5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, הזרקה תת עורית) להקלה על כאב לאחר הניתוח כל 24 שעות לאחר הניתוח במשך יומיים.
הסר את החולדה מהגדרת הניתוח. מניחים את החולדה לתוך כלוב נקי ללא מצעים על צלחת חימום (37 מעלות צלזיוס) עד החולדה ערה. תזיז את החולדה בחזרה לכלוב הבית הנקי שלהם.
הסר סיכות עור הגוף ארבעה עד שישה ימים לאחר הניתוח.

2. מבחן שדה פתוח (OFT)

הערה: פעילות לוקומוטור, כמו גם פעילות התנהגותית ניתן לנתח על ידי OFT.

ההתקנה
1. הגדר את OFT (איור 1A) בסביבה חשוכה ושקטה. הוא מורכב ממערכת מעקב וידאו אוטומטית EthoVision XT (מחשב, תוכנה עם רישיון) וזירה מדידה 58.5 ס"מ (אורך) x 58.5 ס"מ (רוחב) x 45 ס"מ (גובה) עם שריטה עמיד, משטח שחור לניקוי. פני השטח השחורים חשובים כדי להגדיל את הניגודיות בעת מעקב אחר בעלי חיים לבנים.
הערכה
1. הנח את הזירה והמצלמה במיקום הנכון. התאם את המצלמה שתיבת השדה הפתוחה כולה עם הרזולוציה הטובה ביותר מוקלטת. בצע את הניסוי בסביבה חשוכה. אם יש צורך באור להתקנה, השתמש באור קטן ומפוזר כדי למנוע כתמי אור, השתקפויות וגוונים בזירה. להבטיח תנאי תאורה שווים על ידי מדידת ההארה עם מד לוקס באזורים שונים של הזירה.
2. הגדר את תוכנת ה-XT של את'ו ויז'ן. ההגדרות החשובות ביותר מפורטות באפשרויות הבאות. בהגדרות הניסוי, בחר מעקב חי עבור מקור הווידאו וזיהוי נקודות המרכז עבור התכונות במעקב. לאמת את גודל הזירה בהגדרות ארנה. הגדר את תנאי ההתחלה של רכישת נתונים לשלוש שניות לאחר שהחולדה הוצבה במרכז הזירה ואת זמן הריצה הכולל לחמש דקות בהגדרות בקרת ניסיון. בחר חיסור סטטי עבור פעולת השירות בהגדרות זיהוי. סימן ביקורת שמור וידאו עבור פעולת שירות בהגדרות רכישה.
3. מניחים את החולדה בעדינות באמצע זירת הבדיקות (איור 1B).
4. לחץ על לחצן התחל גירסת ניסיון בבקרת רכישה כדי להתחיל בהקלטה.
5. במהלך ההקלטה, התרחקו מהגדרת OFT כדי להימנע מהסחת דעת החולדה.
6. לאחר כל משפט, להסיר את החולדה בעדינות מזירת הבדיקה ולנקות את ההתקנה עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר.
ניתוח נתונים
1. לניתוח הנתונים של OFT באמצעות תוכנת EthoVision XT, עבור אל המקטע ניתוח בסרגל הימני ובחר עקוב אחר תצוגה חזותית תחת הכרטיסיה תוצאות (איור 1C). לאחר מכן, יצא את הפרמטרים הדרושים ל- Excel. בתוך התוכנה, בחר מספר משתנים מקטגוריות שונות לניתוח נתונים. משתנים חשובים עבור מטרה מדעית ספציפית זו הם "מרחק זז" ו "מהירות" תחת הקטגוריה "מרחק וזמן". בצע ניתוח סטטיסטי של הפרמטרים שנבחרו (איור 1D).

3. ניתוח הליכה של CatWalk XT

הערה: ניתוח הליכה באמצעות מערכת CatWalk XT יכול לעזור להעריך פרמטרים רבים ושונים הנוגעים לטביעות הרגליים, העמידה וההליכה של מודלים של בעלי חיים. שביל זכוכית מואר באור ירוק והאור המפוזר על ידי עקבות בעלי החיים נלכד במצלמת וידאו מהירה, הממוקמת מתחת לשביל ההליכה. ניתן לנתח את האותות באמצעות תוכנת CatWalk XT.

ההתקנה
1. לניתוח הליכה עם CatWalk XT, השתמש במערכת CatWalk ובתוכנה המתאימה (מחשב, תוכנה עם רישיון) (איור 2A).
2. בצע את הניסוי בתנאים כהים, מכיוון שרכישת נתונים תלויה בתאורה של שביל ההליכה של מערכת CatWalk עם נורית LED ירוקה. כדי להקל על ההליך הניסיוני בתנאים כהים, להאיר את חדר הניסוי עם אור אדום.
3. השתמש במסלול הליכה מוגדר שאורכו 65 ס"מ ורוחבו 7 ס"מ; עם זאת, גודל שביל ההליכה תלוי בגודל החולדות. הגדר את שביל ההליכה גדול ככל האפשר כדי לתעד עקבות רבות ככל האפשר עבור כל כפה.
4. לכוד מספר מינימלי של שלוש עקבות לכל כף רגל עבור כל ריצה. בעת הגדרת אורך שביל ההליכה, שקול את גופו וזנבו של החולדה, שכן ייתכן שאות ההתחלה או העצירה לא יזוהה כראוי וייתכן שהריצה לא תסווג כתואמת, אם הגוף /הזנב נכנס או נשאר על שביל ההליכה המוגדר לפני או אחרי השלמת הריצה.
הדרכה
הערה: הכשרת החולדות למערכת CatWalk נחוצה כדי להרגיל את בעלי החיים למערך ולאפשר להם ללמוד לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה. הכשרה נכונה מספקת את היתרונות של חיסכון בזמן במהלך הערכה ניסיונית והשגת תוצאות טובות יותר. הפעלת רכישת הנתונים של מערכת CatWalk במהלך אימונים מאפשרת לחולדות להתרגל לתנאי ההערכה (רעש /אור).
1. התחל להגדיר את מערכת המסלול.
  1. נקו את שביל הזכוכית במים מזוקקים ובמטלית רכה ללא מוך. בהתחלה ובסוף הניסוי, או בין אם שביל הזכוכית מלוכלך, השתמשו בנוזל ניקוי זכוכית ובבד רך ללא מוך כדי לנקות את שביל הזכוכית. לאחר השימוש בנוזל ניקוי זכוכית, לנקות את השביל מכל שאריות של הנוזל, כדי למנוע את זה מסיח את דעתו של החיה.
  2. בחר את ההגדרות הניסיוניות. פרמטר חשוב הוא הפעל קריטריונים. הגדר ערכים מתאימים עבור משך הפעלה מינימלי, משך הפעלה מרביומספר מינימלי של הפעלות תואמות לרכישה, הספציפיות עבור כל פרוייקט מחקר. סמן את התיבה השתמש בווריאציה המרבית המותרת במהירות והגדר את הערך. ניתן להתעלם מקריטריוני הריצה בארבעה עד חמישה ימי האימון הראשונים.
  3. מקם את המצלמה במיקום והתאם את המוקד. מצא את מיקום המצלמה האופטימלי כדי להשיג אורך מתאים של שביל ההליכה ואת הרזולוציה הטובה ביותר של כפות הכפות המוקלטות בו זמנית. סמן את מיקום המצלמה במערכת CatWalk כדי להבטיח מיקום מצלמה זהה בין ההקלטות.
  4. הגדר את הגדרות הזיהוי באמצעות הזיהוי האוטומטי עבור ניסוי חדש. ודא כי כל העקבות ניתן לזהות עם רעש רקע מינימלי . במידת הצורך, מטב את הגדרות הזיהוי באופן ידני ושנה את סף העוצמה הירוקה. השתמש באותן הגדרות זיהוי עבור הניסוי כולו.
  5. הקם את קירות המסדרון של מערכת המסלול. קירות המסדרון צריכים להיות קרובים ככל האפשר לחולדה. ודא שקירות המסדרון נשארים מקבילים לשביל ההליכה.
  6. הגדרת אורך שביל ההליכה: לחץ/י על הסמל 'הגדר שביל'. התאם את גודל המלבן הלבן באורך וברוחב, בהתאם לפרויקט המחקר הספציפי. לחץ על אישור.
  7. כייל את שביל ההליכה: לחץ על סמל כיול שביל. מקם גיליון כיול מלבני בגודל 20x10 ס"מ באמצע שביל ההליכה. התאם את גודל המלבן הלבן לגליון הכיול. לחץ על אישור.
  8. לאחר מכן, הצמד תמונת רקע: ודא מראש שהשביל נקי וריק. לחץ על לחצן הצמד רקע כדי ליצור תמונת רקע.
2. לאמן בעלי חיים לפחות שמונה ימים לפני תחילת הניסוי בפועל. מומלץ להתאמן בימים רצופים.
  1. יום 1 של אימונים: עבור חולדות להתרגל למערכת CatWalk, לאפשר לבעל החיים לחקור בחופשיות את שביל ההליכה ואת תיבת המטרה. תן לחולדות להתאמן בחציית שביל ההליכה והזן את תיבת המטרה. להרים את החולדה בסוף השביל או בתיבת המטרה ולהחזיר את החולדה לנקודת ההתחלה של שביל ההליכה. חמש ריצות מומלצות ליום הראשון של האימונים ללא צורך בעמידה בהגדרות הניסוי.
  2. יום 2 של אימונים: חולדות יכול לחקור בחופשיות את שביל ההליכה ואת תיבת המטרה. חמש ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי.
  3. יום 3 של אימונים: שמונה ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי.
  4. יום 4 של אימון: עשר ריצות מומלצות ללא עמידה בהגדרות הניסוי.
  5. יום 5 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש לזכור את הגדרות הניסוי. להניע את החולדות לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה.
  6. יום 6 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש לזכור את הגדרות הניסוי. להניע את החולדות לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה.
  7. יום 7 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש להשיג מינימום של שלוש ריצות תואמות. הוסף ריצות נוספות לבעלי חיים, אם הם לא הצליחו להגיע למטרה זו.
  8. יום 8 של אימונים: מומלץ לעשות עשר ריצות. יש להשיג מינימום של שלוש ריצות תואמות. הוסף ריצות נוספות לבעלי חיים, אם הם לא הצליחו להגיע למטרה זו.
הערכה
1. בהתאם לקריטריוני ההפעלה המוגדרים, בצע שלוש ריצות תואמות לכל עכברוש לצורך ניתוח נתונים. להערכה, אנא בצעו את שלבים 3.2.1. - 3.2.1.8. כמתואר בסעיף האימונים. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלושת הריצות הראשונות, בצע מינימום של שש ריצות לכל מפגש / בשבוע למטרות אימון.
2. בצע לפחות מפגש אחד (אימון) עם שש ריצות בשבוע עבור תבנית הליכה יציבה לניסויים עם נקודות זמן מרובות. הגדרות הניסוי והזיהוי נשארות עקביות עבור הניסוי כולו.
ניתוח נתונים
1. עבור ניתוח נתונים, הערך רק את הריצות התואמות. מחק ריצות שאינן תואמות.
2. אמתו את סף העוצמה הירוקה והגדילו או הפחיתו את סף העוצמה הירוקה לפני סיווג הכף אם יש צורך בכך. סף העוצמה הירוקה חייב להיות עקבי עבור כל בעלי החיים וכל הריצות.
3. סיווג הדפסות כפות רגליים באופן אוטומטי באמצעות תוכנת CatWalk XT (איור 2B).
4. סקור תוויות הדפסת כפות רגליים באופן ידני. תקן תוויות הדפסה שגויות של כפות רגליים, הוסף תוויות של הדפסות כפות רגליים שלא זוהו ומחק רעש ותוויות שגויות באופן ידני. העבר את הווידאו למיקום, שיש לסקור באופן ידני. לתיקון הדפסות כפות רגליים עם תווית שגויה, בחר את המלבן של הדפסת הכפות הספציפית, לחץ על איפוס, בחר שוב באותו מלבן והקצה את התווית הנכונה מהרשימה. לתיוג הדפסות כפות רגליים שאינן מזוהות, צייר מלבן סביב הכף שאינה מזוהה, לחץ על הוסף הדפסה, בחר את המלבן החדש שנוצר והקצה את התווית הנכונה מהרשימה. במקרה שהתוכנה הנקראת אף או גוף מדפיסה באופן אוטומטי, בחר את המלבן של התווית הספציפית ולחץ על הסר הדפסה.
5. סקור את התוצאות המספריות. התוצאות המספריות מוצגות בגיליון Excel ומציגות מספר פרמטרים בסיסיים. בחרו פרמטרים ספציפיים מוגדרים מראש, בהתאם לעניין המחקרי ובצעו ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 2D).
6. לקבלת מידע מפורט יותר על כל טביעת רגל, לסווג את בהונות הכפות האחוריות. ניתוח זה דורש מודול מדידות טביעת רגל אינטראקטיבית.
  1. התאימו את סף העוצמה הירוקה לניתוח מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית במידת הצורך. סף העוצמה הירוקה חייב להיות עקבי עבור כל בעלי החיים וכל הריצות.
  2. הגדר את הסמנים לניתוח טביעת הרגל באופן ידני. לנתח כל טביעת כפה אחורית בכל שלוש הריצות התואמות. צייר קו ממרכז בוהן הראשונה למרכז בוהן החמישית כדי למדוד "התפשטות בוהן". צייר קו ממרכז בוהן שנייה למרכז בוהן הרביעית כדי למדוד "התפשטות בוהן ביניים". צייר קו ממרכז הבהונות השלישית לעקב הכף האחורית כדי למדוד "אורך הדפסה ידני"(איור 2C).
  3. סקור את התוצאות המספריות של "מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית" המוצגות בגיליון נפרד. בחר פרמטרים ספציפיים של "מדידות טביעת הרגל האינטראקטיבית" ובצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 2E).

4. משימת הליכה קרן

הערה: גירעונות הליכה ניתן לקבוע על ידי משימת הליכה קרן. המוקד של משימת ההליכה קרן בנושא מחקר ספציפי זה יהיה ניתוח של תיאום מוטורי, המוגדר כיכולת לתאם הפעלת שרירים מחלקי גוף מרובים, ולא הערכה של איזון מוטורי, המוגדר כיכולת לשליטה יציבה במהלך תנועות הגוף.

ההתקנה
1. למשימת ההליכה של הקרן, השתמשו בקרן, במרווח, בטבלה, ברקע אחיד ובמצלמת וידאו(איור 3A).
2. השתמשו בקורת עץ באורך 90 ס"מ, ברוחב 1.7 ס"מ ובגובה 2 ס"מ. מומלץ פלטפורמה באורך 20.5 ס"מ, רוחב 15 ס"מ וגובה 2 ס"מ בשני קצות הקרן. השתמש באותו חומר עבור הפלטפורמות ואת הקרן, למנוע כל מחסומים בין הפלטפורמות לבין הקרן.
3. יש את המרחק בין הקרן לשולחן להיות לפחות 44 ס"מ. סביבה מוכרת כגון כלוב ביתי מניעה את החולדות לחצות את הקרן, אשר ניתן להציב בסוף פלטפורמת הקרן.
הדרכה
1. הניחו את הקרן עם מרווח וכלוב ביתי על השולחן.
2. לאמן חיות במשך שבעה ימים. מומלץ להתאמן בימים רצופים.
  1. יום 1 של אימונים
    1. מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על פלטפורמת ההתחלה של הקרן.
    2. תן לחולדות לחקור את הסביבה (פלטפורמה / קרן).
    3. החזק חולדה אחת בזהירות על ידי הזנב ולהוביל את החולדה אל הקרן על ידי דחיפת החולדה בעדינות על הקרן.
    4. לסייע לחולדה לחצות את הקרן על ידי החזקת החולדה בזנבה לפחות שתי ריצות.
    5. תן לחולדה לחצות את הקרן לעוד שלוש ריצות ללא עזרה. שימו לב לחולדה וספקו סיוע במידת הצורך. אם החולדה לא מצליחה לחצות את הקרן, ליירט את הנפילה על מנת למנוע פציעות ופיתוח של פחד לחצות את הקרן.
    6. המשך עם הליך זה עבור כל החולדות.
      הערה: לפעמים חולדות עוקבות זו אחר זו כדי לחצות את הקרן, ובמקרה זה אין צורך בסיוע. עם זאת, חשוב להתבונן בחולדות, ליירט נופל ולספק סיוע במידת הצורך.
  2. יום 2 של אימונים
    1. מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על פלטפורמת ההתחלה של הקרן.
    2. תן לחולדות לחצות את הקרן שש פעמים.
    3. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל.
  3. יום 3 של אימונים
    1. מניחים חולדה אחת על פלטפורמת ההתחלה של הקרן.
    2. תן לחולדה לחצות את הקרן שש פעמים.
    3. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל.
  4. יום 4-7 של אימונים
    1. מניחים חולדה אחת על פלטפורמת ההתחלה של הקרן.
    2. תן לחולדה לחצות את הקרן עשר פעמים.
    3. במידת הצורך, לספק סיוע וליירט נופל.
    4. בסוף האימון, החולדה צריכה לחצות את הקרן ללא כל הפרעה לפחות שלוש ריצות. מותר לדחוף בעדינות את החולדה על פלטפורמת ההתחלה כדי לעורר ייזום של תנועה.
הערכה
1. הניחו את הקרן עם מרווח וכלוב ביתי על השולחן.
2. מניחים את מצלמת הווידאו בעמדה, מיושר במקביל לקורה עם החיה בפוקוס. המיקום של מצלמת וידאו צריך להיות קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של התנועות המוקלטות. הקרן וחלקים משתי הפלטפורמות צריכים להיתפס על ידי ההקלטה.
3. התחל את ההקלטה וזהה תחילה את הפגישה ואת החיה.
4. מניחים את החולדה על פלטפורמת ההתחלה של הקרן.
5. החולדה צריכה לחצות את הקרן שלוש פעמים ללא כל הפרעה. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלושת הריצות הראשונות, בצע מינימום של שש עד עשר ריצות לביצועי משימה רציפים.
6. תמיד, להתבונן החיה וליירט נופל, במידת הצורך.
7. לאחר המשימה, לנקות את הקרן ואת השולחן עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר.
  הערה: בשבועיים הראשונים לאחר פציעת ריסוק עצבי, החולדות אינן מסוגלות לחצות את הקרן ללא סיוע. לכן, סיוע צריך להינתן עבור שש עד שמונה ריצות בשבועיים הראשונים לאחר פציעת מעיכה עצבית. משבוע שלישי לשבוע החמישי מבוצעות חמש ריצות בסיוע ועשר ריצות נוספות בוצעו ללא סיוע.
ניתוח נתונים
1. השתמש בתוכנת ניתוח וידאו חינם Kinovea לניתוח נתונים.
2. בחר את רצפי הווידאו של שלוש ריצות תואמות מההקלטה. לצורך כך, בחר את שלושת הריצות הראשונות שבוצעו ללא סיוע של החיה. היה עקבי בבחירת ההפעלה התואמת עבור כל החולדות.
3. הגדר את נקודת שעת ההתחלה ואת נקודת שעת הסיום של שלוש הריצות התואמות שנבחרו (איור 3D-E). בהגדרה זו, נקודת ההתחלה תויגה על ידי קו שחור על הקרן ואת המיקום של hindlimb הראשון מאחורי הקו השחור הגדיר את נקודת זמן ההתחלה של הריצה. המיקום של hindlimb הראשון על הפלטפורמה בסוף הקרן מגדיר את נקודת זמן הסיום.
4. לאחר מכן, לחשב את הזמן הדרוש לחולדה לחצות את הקרן. דווח על נתונים כזמן השהיה כדי לחצות את הקרן בשניות ולבצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 3B).
5. ניקוד מספר השלבים והשגיאות משלוש ריצות תואמות עבור שני hindlimbs בנפרד באמצעות זום ופונקציה בהילוך איטי של התוכנה. השגיאות כוללות סה"כ החלקות רגל וגלישות של חצי רגל. החלקת רגל כוללת מוגדרת כמיקום רגל ואחריו החלקה עמוקה הגורמת לאובדן מגע של הכף המושפעת עם הקרן (איור 3F). חצי החלקה מוגדרת ככף רגל המחליקה מהקירות הצדדיות של הקרן מבלי לאבד מגע מלא עם הקרן (איור 3G).
6. לחשב את אחוז החלקות רגל ביחס למספר הצעדים לחצות את הקרן ((מספר החלקות רגל של האיבר x 100%)/ מספר צעדים של אותו איבר). הצג נתונים כאחוזים מחליקים ובצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 3C).

5. משימת הליכה סולם צלצל

הערה: משימת ההליכה של דרגת הסולם יכולה להעריך את התפקוד המוטורי, את המיקום של שני החלק הקדמי וההינדסים, ואת קואורדינציית interlimb.

ההתקנה
1. השתמש במנגנון סולם, מרווח, שולחן, רקע אחיד ומצלמת וידאו לבדיקה התנהגותית זו (איור 4A). מנגנון שלב הסולם האופקי מורכב שלבים מתכת ו קירות צדדיים פוליקרבונט ברור. אורכו של המנגנון 119.5 ס"מ והרוחב מותאם ל-7.4 ס"מ. אורך שביל ההליכה שיש לנתח הוא 100 ס"מ.
2. סמן את נקודת ההתחלה והסיום עם קו שחור בצד. מקם מצייני מיקום עבור שלבים במנגנון במרווחים של 1 ס"מ. מסדרים תבנית לא סדירה של שלבים עבור שביל 100 ס"מ עם מרחק בין 1 ל 5 ס"מ בין שלבים. הראשון 10 ס"מ בהתחלה האחרון 9.5 ס"מ בסוף המנגנון, אשר אינם נכללים בניתוח, יש דפוס קבוע של שלבים עם מרחק של 1 ס"מ.
3. יש להשתמש במרחק בין שביל ההליכה לשולחן של כ-30 ס"מ(איור 4A-B). קופסת מטרה או סביבה מוכרת בסוף המנגנון, כמו כלוב ביתי, מניעה את החולדות לחצות את מנגנון דרגת הסולם.
הדרכה
1. הגדר את מנגנון צלצל הסולם עם מרווח ותיבת מטרה על השולחן.
2. לאמן חיות במשך שמונה ימים. מומלץ להתאמן בימים רצופים.
  1. יום 1 של אימונים
    1. מניחים את כל החולדות מכלוב ביתי אחד על מנגנון דרגת הסולם.
    2. תן לחולדות לחקור את הסביבה (מנגנון צלצל סולם / תיבת מטרה).
    3. בעדינות לדחוף את החולדות לכיוון תיבת המטרה. לסייע לחולדות בהזנת תיבת המטרה. תן לחולדות לחקור את תיבת המטרה לזמן מה.
    4. אחרי שכל החולדות נכנסו לתיבת השער. קח את החולדה הראשונה מתיבת המטרה והנח את החולדה על אזור ההתחלה של המנגנון שוב. המשך עם אותו הליך עבור כל החולדות של כלוב בית אחד. בעדינות לדחוף את החולדות לכיוון תיבת המטרה ולתת סיוע להיכנס לתיבת המטרה, במידת הצורך.
    5. תן לחולדה לחצות את המנגנון ארבע פעמים.
  2. יום 2 של אימונים
    1. בצע את אותו פרוטוקול כמפורט ליום הראשון של האימון.
    2. תן לחולדה לחצות את המנגנון שש פעמים.
  3. יום 3 של אימונים
    1. בצע את אותו פרוטוקול כמפורט ליום הראשון של האימון.
    2. תן לחולדה לחצות את המנגנון שמונה פעמים.
  4. יום 4 של אימונים
    1. מניחים חולדה אחת על תחילת מנגנון דרגת הסולם.
    2. אם החולדה אינה חוצה את המנגנון ונכנסת לתיבת המטרה בהתנדבות, תן סיוע על ידי דחיפת החולדה בעדינות מאחור.
    3. תן לחולדה לחצות את המנגנון שמונה פעמים.
  5. יום 5-8 של אימונים
    1. מניחים חולדה אחת על תחילת מנגנון דרגת הסולם.
    2. אם החולדה אינה חוצה את המנגנון ונכנסת לתיבת המטרה בהתנדבות, תן סיוע על ידי דחיפת החולדה בעדינות מאחור.
    3. תן לחולדה לחצות את המנגנון עשר פעמים.
    4. בסוף האימון, החולדה אמורה להיות מסוגלת לחצות את שביל ההליכה ללא כל הפרעה וסיוע למינימום של שלוש ריצות. מותר לתת לחולדה דחיפה עדינה באזור ההתחלה כדי לעורר ייזום תנועה.
הערכה
1. הגדר את מנגנון צלצל הסולם עם מרווח ותיבת מטרה על השולחן.
2. מניחים את מצלמת הווידאו בעמדה, מיושר במקביל למנגנון עם החיה בפוקוס. מקם את מצלמת הווידאו קרוב ככל האפשר לבעל החיים כדי להשיג רזולוציה אופטימלית של התנועות המוקלטות ולהבטיח כי מנגנון סולם שלם נתפס בהקלטה.
3. התחל את ההקלטה וזהה תחילה את הפגישה ואת החיה.
4. מניחים את החולדה על אזור ההתחלה של מנגנון צלצל הסולם.
5. החולדה צריכה לחצות את שביל 100 ס"מ של מנגנון שלב הסולם שלוש פעמים ללא כל הפרעה על מנת שזה יהיה זכאי כמו ריצה תואמת. גם אם החולדה מגיעה לשלוש ריצות תואמות בשלוש הריצות הראשונות, יש לבצע לפחות עשר ריצות לביצועי משימה רציפים.
6. לאחר המשימה, לנקות את המנגנון ואת השולחן עם 0.1% חומצה אצטית, כדי למנוע הסחת דעת על ידי הריח של החולדה שתועדה בעבר.
ניתוח נתונים
1. השתמש בתוכנת ניתוח וידאו חינם Kinovea לניתוח נתונים.
2. בחר את רצפי הווידאו של שלוש ריצות תואמות מההקלטה. בחר את שלוש הריצות הראשונות התואמות לניתוח נתונים.
3. הגדר את נקודת שעת ההתחלה ואת נקודת שעת הסיום של שלוש הריצות התואמות שנבחרו. המיקום של hindlimb הראשון מאחורי הקו השחור הראשון על הצד של המנגנון, אשר מתייג את נקודת זמן ההתחלה של שביל 100 ס"מ, מגדיר את נקודת זמן ההתחלה של הריצה. המיקום של החזית הראשונה מאחורי הקו השחור השני על הצד של המנגנון, אשר מתייג את נקודת הסיום של שביל 100 ס"מ, מגדיר את נקודת זמן הסיום של הריצה.
4. זהה את נקודת שעת ההתחלה והסיום. לאחר מכן, חשב את משך הריצה לאורך שביל ההליכה. דווח על נתונים כזמן השהיה כדי לחצות את שביל ההליכה בשניות ולבצע ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 4C).
5. ניקוד שלוש ריצות תואמות עם סולם 7 קטגוריות מ Metz ואח 'באמצעות ההילוך האיטי או פונקציית מסגרת אחר מסגרת של התוכנה (איור 5)¹⁶^,¹⁷. קבע את מספר השלבים ואת מספר השגיאות בהתאם לקטגוריות הסולם עבור כל איבר בנפרד. קנה המידה מבחין בין הקטגוריות הבאות: (0) החטאה כוללת (1) החלקה עמוקה (2) החלקה קלה (3) החלפה (4) תיקון (5) מיקום חלקי, ו-(6) מיקום נכון. רק השגיאה של האיבר היוזם דורגה. שגיאות נוספות, המופעלות על-ידי השגיאה הראשונית, אינן צריכות להיות מדורגות.
6. חשב את השגיאות/שלב על-ידי התחשבות בדרישות הבאות. הקטגוריות (0) החטאה כוללת (1) החלקה עמוקה (2) ספירה קלה של החלקה כשגיאה. חלק את מספר השגיאות במספר השלבים עבור כל hindlimb וכל הפעלה בנפרד. קבעו את הערך הממוצע של כל שלוש הריצות התואמות לכל בעל חיים ולכל אחת מהן בנפרד ובצעו ניתוח סטטיסטי כרגיל (איור 4D).

תוצאות

התוצאות הייצוגיות של חמש הדקות של OFT מראות כי לפציעה במחיצת העצבים חמישה שבועות לאחר הניתוח אין השפעה על פעילות הלוקומוטור (איור 1).

ניתוח הליכה עם מערכת CatWalk XT (איור 2) יוצר פרמטרים רבים ושונים. פרמטרים סלקטיביים נותחו סטטיסטית על ידי השוואת חולדות נאיביות wt עם חולדות wt פגושי עצבים חמישה שבועות לאחר ריסוק העצבים (איור 2D). ניתן לזהות שינויים משמעותיים במהירות הממוצעת של הריצה, באורך הצעד ובאזור ההדפסה של הכף האחורית (הימנית) הפגועה עצבית. ניתוח מפורט יותר של הכף האחורית פגועת העצבים בוצע עם מודול "מדידות טביעת רגל אינטראקטיבית". הפחתה משמעותית של התפשטות בוהן הפרמטרים, התפשטות בוהן ביניים ואורך ההדפסה נצפו בחולדות wt פגושי עצבים בהשוואה לחולדות נאיביות wt. בנוסף, ציר הגוף של זווית הכפות וקטור תנועת זווית הכפות שונים באופן משמעותי בעת השוואת חולדות wt פגועות עצבים עם חולדות נאיביות(איור 2E).

איור 3 מציג נתונים של תיאום מוטורי המתקבלים באמצעות הערכת משימות הליכה קרן. חולדות WT פגושי עצבים הראו זמן השהיה מוגבר משמעותית כדי לחצות את הקרן בהשוואה לחולדות נאיביות של WT חמישה שבועות לאחר הפציעה (איור 3B). כקריאה נוספת מתוך משימת הליכה קרן, החלקות מלאות וחצי החלקות של hindlimb פגוע עצב נספרו ונחשבו כטעות לניתוח סטטיסטי. אחוז הטעויות בכל שלב של העצבים הפצועים (מימין) hindlimb גדל באופן משמעותי בחולדות wt פגושי עצבים בהשוואה לחולדות נאיביות wt.

נתונים מייצגים של משימת ההליכה בסולם הרצים (איור 4)אינם מראים שינויים משמעותיים בזמן ההשהיה כדי לחצות את שביל מנגנון שלב הסולם (איור 4C) או באחוז השגיאות בכל שלב של הינדלימב (מימין) הפגוע עצבים (איור 4D). הניתוח של אחוז השגיאה לכל שלב של hindlimb פגוע עצבים נחשב רק את הציון מ 0 עד 2 של סולם 7 קטגוריות מ Metz ואח '. ההתפלגות של כל קטגוריות הניקוד לצעד מהסקאלה בת 7 הקטגוריות של הינדלימב הפגוע עצבי והישב האחורי (משמאל) שאינו פצוע עצבים מודגמת באיור 4E.

figure-results-2196
איור 1: הערכת פעילות לוקומוטור במהלך בדיקת שטח פתוח. (א) תמונה של כיוונון בדיקת השדה הפתוח. תמונה שנבחרה הוחסרה מסרטון מוקלט במהלך בדיקת שדה פתוח המציג חולדה בזירת השדה הפתוח ללא (B) ועם (ג) מעקב. (ד) המהירות במהלך חמש דקות של הקלטת מבחן שדה פתוח נחקרה בחולדות תמימות וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת מעיכה עצבית. הנתונים מוצגים כ ממוצעים ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות הבדיקה t unpaired של הנתונים המפוזרים בדרך כלל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2954
איור 2: ניתוח הליכה עם מערכת CatWalk XT. (A) תמונה של מנגנון XT של CatWalk. (ב) דוגמאות לתצוגת ההדפסה המציגה את הדפסי הכפות המסומנים במצב צבע כוזב ודוגמאות לתצוגת התזמון המציגה דיאגרמת הליכה מבוססת זמן של חולדות נאיביות של wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצבים. (ג) דוגמאות לסיווג בוהן המציג את התפשטות בוהן (TS), התפשטות בוהן ביניים (ITS) ואורך ההדפסה (PL) כמו גם דוגמאות של תצוגת ציר הגוף המציגה את ציר הגוף (קו לבן) ואת וקטור התנועה (קו אדום) של חולדות נאיביות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פגיעה מעיכה עצבית. (ד) נתונים של פרמטרים נבחרים מהסיווג "הסטנדרטי" המשווים חולדות תמימות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצבי. (ה) נתונים של פרמטרים נבחרים ממודול "מדידות טביעת רגל אינטראקטיבית" המשווים חולדות נאיביות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצבי. הנתונים מוצגים כמשמעותיים ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת t לא משועבדת של הנתונים המופצים בדרך כלל, בדיקת t לא משועבדת עם התיקון של וולש של נתונים המופצים בדרך כלל עם שונות לא שוויונית ומבחן מאן-ויטני U של הנתונים המבוזרים הלא נורמליים. P-value < 0.05 הוגדר כמשמעותי סטטיסטית שכותרתו *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4421
איור 3: ניתוח הליכה עם משימת ההליכה של הקרן. (א) ציורים תמונה ושרטוטים של הגדרת משימת ההליכה של הקרן. זמן ההשהיה לחצות את הקרן (B) ואת טעויות להחליק רגל אחוזים לכל שלב של hindlimb העצב פצוע במהלך משימת הליכה קרן (C) נותח חולדות נאיביות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצב. תמונה מייצגת עבור מיקום שעת ההתחלה (D) ומיקום שעת הסיום (E) של משימת ההליכה של הקרן. רצף תמונה מייצג של שגיאת החלקה מלאה (F) ושגיאת החלקה למחצה (G) של משימת ההליכה של הקרן. הנתונים מוצגים כמשמעותיים ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת מאן-ויטני U של הנתונים המבוזרים שאינם נורמליים. P-value < 0.05 הוגדר כמשמעותי סטטיסטית שכותרתו *p < 0.05, **p < 0.01. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5398
איור 4: ניתוח הליכה באמצעות משימת הליכה בסולם. תמונה (A) וציורים סכמטיים (B) של הגדרת משימת ההליכה של דרגת הסולם. זמן ההשהיה של חציית מנגנון שלב הסולם (C) ושגיאות החלקה ברגל אחוזים לכל שלב של hindlimb העצב פצוע במהלך משימת הליכה שלב הסולם (D) הוערך חולדות נאיביות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת מעיכה עצבית. (ה) התפלגות האחוזים של קטגוריית הניקוד לכל צעד לפי סולם של 7 קטגוריות מ- Metz et al. עבור החלק האחורי השמאלי והימני של חולדות נאיביות wt וחולדות wt חמישה שבועות לאחר פציעת ריסוק עצבים. הנתונים מוצגים כמשמעותיים ± SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת t לא משועבדת של הנתונים המבוזרים בדרך כלל ומבחן Mann-Whitney U של הנתונים המבוזרים שאינם נורמליים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6407
איור 5: ייצוג למופת של כל קטגוריה לפי סולם של 7 קטגוריות ממץ ואח'. במהלך משימת ההליכה של סולם צלצל. רצף תמונה מייצג מהחלק האחורי הימני של קטגוריה 0 - פספוס סה"כ, קטגוריה 1 - החלקה עמוקה, קטגוריה 2 - החלקה קלה, קטגוריה 3 - החלפה, קטגוריה 4 - תיקון, במהלך משימת ההליכה של דרגת הסולם. תמונות מייצגות עבור קטגוריה 5 - מיקום חלקי וקטגוריה 6 - מיקום נכון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול הערכה התנהגותי זה מספק סקירה של יתרונות וחסרונות, כמו גם קריאות אפשריות של סוללת הבדיקה ההתנהגותית שנבחרה במודל מכרסמים לאחר פגיעה במכת עצבית סיאטית.

כדי להשיג תוצאה השוואתית של פציעת ריסוק העצבים הסיאטית, טכניקת ריסוק עקבית היא חובה. השימוש מהדק לא משונן (אולטרה עדין Hemostat) במקום מלקחיים יכול לשפר את העקביות של למחוץ. השתמש באותו מלחציים, כמו גם את אותה תנוחת ריסוק כדי להבטיח דחיסה עצבית שווה. השימוש הבלעדי של המהדק עבור פציעת ריסוק וטיפול של מהדק עם טיפול משפר את העקביות. כמו כן, לבצע את ההליך של פציעת למחוץ בזהירות. נזק נוסף לעצב במהלך ניתוח כגון מתיחה לא רצויה של העצב יכול להוביל לתופעות לוואי לא רצויות כמו automutilation. לכן, הכנת עצב זהיר, כמו גם ממשל של משכך כאבים במשך מינימום של יומיים מומלץ.

הערכה רב-גורמית של התנהגות מוטורית יכולה לאפיין את הפנוטיפ לאחר פגיעה במחץ עצבי בחולדות ברמות שונות. השתמשנו ב- OFT, ניתוח הליכה של CatWalk XT, משימת הליכה קרן ומשימת הליכה בסולם. הליך ניסיוני עיוור וניתוח נתונים לקבוצות ניסיוניות חיוניים לניסויים אלה. לפני הערכת התנהגות, בעלי חיים התאקלמו בחדר הבדיקות בתנאי בדיקה במשך 30 דקות לפחות. כל הבדיקות ההתנהגותיות המיושמות בזאת יש את היתרון כי מזון או מחסור במים אינם נדרשים. באותה קבוצה של בעלי חיים נעשה שימוש בכל הבדיקות ההתנהגותיות המתוארות. לכל היותר בוצעו שני מבחנים התנהגותיים שונים ביום עבור כל בעל חיים. אם בדיקות התנהגותיות מבוצעות במרווחי זמן קבועים, לשים לב להליך דומה, כמו ביצוע הבדיקה באותו סדר בעלי חיים ובאותו זמן של היום. היבט חשוב נוסף לניתוח התנהגותי הוא מחזור הלילה של חולדות. שקול מחזור יום-לילה הפוך כדי להשיג רמות טבעיות וגבוהות יותר של פעילות במחזור היום (מחזור כהה). זה צריך להיחשב במיוחד למדידה של התנהגות ספונטנית, כמו OFT. בניסוי זה לא ניתן היה ליישם מחזור יום-לילה הפוך, אך הובטחה התאקלמות נאותה לתנאי הבדיקה. תאורה מושלמת חיונית לסרטונים ברזולוציה גבוהה למשימת ההליכה של הקרן ולתפקיד ההליכה בסולם. לא ניתן להגיע לאיכות וידאו גבוהה זו בעת ביצוע ניסויים בחושך.

הערכת ההליכה דורשת ביצועי משימה רציפים. ההיבט החשוב הראשון בביצועי משימה רציפים הוא לשכנע את בעלי החיים לחצות את ההתקנה. כדי להגביר את המוטיבציה, במקום כדורי מזון קטנים (45 מ"ג) בסוף ההתקנה. על מנת שבעלי חיים יכירו את כדורי המזון, יש להאכיל אותם בכדורים לפני הבדיקה. כמו כן, תיבת מטרה בסוף ההתקנה יכולה להיות שימושית. ההתקנה של CatWalk כבר כולל תיבת מטרה, אבל חולדות לפעמים מהססים להיכנס לתיבת המטרה. לחלופין, אתה יכול להוסיף כלוב קטן לתוך תיבת המטרה, אבל הכלוב הביתי של חולדות אינו מתאים לתיבת המטרה. תן לחולדה להתמקם בכלוב כמה דקות לפני הרכישה. בנוסף, חולדה נוספת מאותו כלוב ביתי עשויה להיות ממוקמת בתיבת המטרה או לתוך הכלוב בתוך תיבת המטרה. ודא כי החולדה השנייה נשארת בתיבה ואינה חוסמת את הכניסה לתיבת המטרה. יתר על כן, ניתן גם להסיר את תיבת המטרה ממערכת CatWalk ולהניח את כלוב בית החולדה בסוף השביל, המאפשר לחולדה להיכנס ל"טריטוריה הביתית "שלהם לאחר כל ריצה. להגדרה של משימת ההליכה קרן ומשימת הליכה שלב הסולם, אנו ממליצים להוסיף תיבת מטרה או הכלוב הביתי בסוף ההתקנה. כדי להבטיח עקביות, מסלול הדוגמנות, משימת ההליכה של הקרן ומשימת ההליכה של דרגת הסולם צריכים להתבצע לפחות פעם בשבוע עם שש עד עשר ריצות.

למרות שלא כל ניתוח הניב הבדלים משמעותיים במחקר זה, קחו בחשבון כי הכללה של בעלי חיים מהונדסים גנטית או קבוצות טיפול יכולה לייצר נתונים בעלי ערך שיכולים להבחין בין קבוצות מאותן בדיקות התנהגותיות.

הפציעה במחץ העצבים לא השפיעה על פעילות הלוקונוטור של החולדה, שנמדדה בחמש דקות של נת"ט. ניתוח הליכה Catwalk XT הוא כלי אובייקטיבי ורגיש יותר לניתוח מיקום הליכה, כפות רגליים ובהונות. לאחר אימון אינטנסיבי, החולדות לומדות לחצות את שביל ההליכה של מכשיר CatWalk XT להגדרות ברירת המחדל. הפגיעה העצבית אינה מפחיתה את יכולתם של החולדות לחצות את שביל ההליכה. החישוב האוטומטי של פרמטרים שונים מציג את הנתונים באופן אובייקטיבי. מידע נוסף ניתן להשיג באמצעות מודול "מדידות טביעת רגל אינטראקטיבית" ואכן, ניתוחים אלה הניבו הבדלים משמעותיים בפרמטרים שונים של התפשטות בוהן, אורך ההדפסה וזווית כף היד לציר הגוף המשווה חולדות עם וללא פגיעה עצבית.

חולדות ניתן לאמן בקלות למשימת הליכה קרן. הבדלים בזמן ההשהיה לחצות את הקרן ובמספר החלקות הרגליים לכל שלב של ההחלקה האחורית הפגועה עצבית התגלו על ידי השוואת נאיביות עם חולדות פצועות מעיכה. חיסרון בניתוח חולדות פגושי עצבים עם משימת ההליכה של הקרן הוא גודל הקרן. בשבועיים הראשונים לאחר פציעת ריסוק העצבים הסיאטית, החולדות זקוקות לסיוע כדי לחצות את הקרן מכיוון שיווי המשקל שלהן לקוי. למרות שחולדות מסוימות עשויות להיות מסוגלות לחצות את הקרן, הסיכון לפציעות הנגרמות על ידי נפילה הוא גבוה. לכן יש לסייע לבעלי חיים מרוסקי עצבים לחצות את הקרן בשבועיים הראשונים לאחר פציעת ריסוק עצבי סיאטי או יותר, במידת הצורך. עם זאת, קשה להשוות ריצות עם וללא סיוע. כמו כן, האיזון המוטורי הוא פרמטר חשוב המוערך על ידי משימת ההליכה של הקרן. שקלנו את הפרמטר הזה לא להיות רלוונטי למודל עכברוש ריסוק העצבים שלנו. לכן, ציונים המתוארים על ידי Ohwatashi ואח 'וג'והנסון & Ohlsson לא ניתן להשתמש ורץ עם מעבר קרן שלם לא נכללו לניתוח נתונים¹⁸^,¹⁹.

סולם 7 קטגוריות מ Metz et al. יכול לנתח הן את הקידם והן את hindlimbs ולהבחין בין רמות חומרה שונות של טעויות של כל הגפיים במהלך המשימה הליכה סולם¹⁶^,¹⁷. על ידי ניתוח השגיאות הבולטות ביותר, הכוללות את הקטגוריות מ 0 עד 2, לא ניתן היה לזהות הבדלים של שגיאות בכל צעד ב hindlimb בעת השוואת חולדות wt פגושי עצב עם חולדות wt נאיביות. יתר על כן, זמן ההשהיה של חציית מנגנון שלב הסולם לא היה שונה בין חולדות wt פגועות עצבים וחולדות נאיביות wt. מודלים של למידה עמוקה יכולים לשפר ולהאיץ את ניתוח הנתונים של משימת ההליכה בסולם באמצעות גישה אוטומטית.

חשוב לציין כי הפציעה מעיכה עצבית, כמו גם כל הבדיקות ההתנהגותיות המתוארות ניתן לתרגם בקלות לעכברים, על ידי התאמת ההגדרות והגדלים של ההגדרות. השימוש בעכברים כאורגניזם מודל יש את ההשפעה החיובית כי מודלים מהונדסים עבור מחלות אנושיות רבות קיימות.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF DysTract ל- C.W.I.) ועל ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) באוניברסיטת וירצבורג (N-362 עד C.W.I.; Z2-CSP3 ללוס אנג'לס). בנוסף, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover ל- J.V.), וקרן VERUM. יתר על כן C.W.I. ממומן על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן Reseach הגרמנית) פרויקט-ID 424778381-TRR 295, על ידי דויטשה Stiftung נוירולוגיה ו parkinsonFonds. L.R. נתמך בנוסף על ידי קרן Reseach הרפואית של דיסטוניה.

המחברים מודים לקאלי רם, ורוניקה סנגר, הייקה מנזל ולואיזה פריז על הסיוע הטכני שלהם, כמו גם להלגה ברונר על הטיפול בבעלי חיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Appose ULC skin stapler 35W	Covidien	8886803712
Beam	self made
Bepanthen eye cream	Bayer Vital GmbH	81552983
Box for OFT	self made
Camcorder GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		setup and software
Chamber for isofluran	GT-Labortechnik		custom made
Disposable scalpel No. 11	Feather	20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 isoflurane system	Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - laminectomy forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	super-fine
Dustless precision pellets 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		setup and software
Forceps 160 mm	Hartenstein	PZ09
Gas anesthesia mask, rat	Dr. Wilfried Müller GmbH
Goal box for ladder rung walking task apparatus	self made
Hair clipper Magnum 5000	Wahl GmbH
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11
Heating table	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	prescription needed
Kinovea	www.kinovea.org
Ladder rung walking task apparatus	self made
Needleholder	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schülke	118211
Rimadyl 50 mg/ml, injectable	Zoetis		Carprofen, prescription needed
Rubber band retractors	self made
Spacer for beam	self made
Spacer for ladder rung walking task apparatus	self made
Suture Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra fine hemostats (non-serrated clamp)	Fine Science Tools	13020-12

References

Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108(2016).
Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109(2020).
Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226(2015).
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606(2012).
Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337(2021).
Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 CatWalk XT DYT TOR1A

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: