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  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este artículo describe los procedimientos utilizados para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas en una línea celular primaria e inmortalizada.

Resumen

Este artículo describe los métodos para medir la toxicidad de la radiación ultravioleta (UV) y las toxinas oculares en cultivos primarios (pHCEC) e inmortalizados (iHCEC) de células epiteliales corneales humanas. Las células fueron expuestas a radiación UV y dosis tóxicas de cloruro de benzalconio (BAK), peróxido de hidrógeno (H2O2) y dodecil sulfato de sodio (SDS). La actividad metabólica se midió mediante un ensayo metabólico. La liberación de citoquinas inflamatorias se midió mediante un ensayo de interleucina múltiple (IL)-1β, IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y se evaluó la viabilidad de las células utilizando tintes fluorescentes.

Los efectos dañinos de los rayos UV sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas ocurrieron a los 5 min de exposición UV para iHCEC y 20 min para pHCEC. Caídas porcentuales similares en la actividad metabólica de iHCEC y pHCEC ocurrieron después de la exposición a BAK,H2O2 o SDS, y los cambios más significativos en la liberación de citoquinas ocurrieron para IL-6 e IL-8. La microscopía de células expuestas a iHCEC y pHCEC BIC teñidas con fluorescencia mostró muerte celular al 0,005% de exposición a BAK, aunque el grado de tinción de etidio fue mayor en los iHCEC que en los pHCEC. Utilizando múltiples métodos para evaluar los efectos tóxicos utilizando microscopía, evaluaciones de la actividad metabólica y producción de citoquinas, se pudo determinar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas químicas tanto para las líneas celulares primarias como para las inmortalizadas.

Introducción

Los estudios de toxicología in vitro se realizan para predecir los efectos tóxicos de los productos químicos y otros agentes que pueden causar daño a las células. En la evaluación de la toxicidad para la córnea, se han utilizado células epiteliales corneales humanas (HCEC) en modelos para evaluar estos efectos 1,2,3,4. Estos modelos generalmente evalúan los efectos fisiológicos, como los cambios en la actividad metabólica de la célula, la proliferación celular y otras funciones celulares, como la producción y liberación de citoquinas inflamatorias. Para estos estudios toxicológicos, se han seleccionado células de diversas fuentes para evaluar los efectos nocivos de los productos químicos y la radiación UV sobre los HCEC 2,3. Las líneas pHCEC están disponibles en compañías que proporcionan estas células a partir de tejidos de donantes de adultos. Las células primarias pueden tratarse con dispasa y raspar suavemente la córnea para el cultivo5. Luego, las células se analizan para detectar virus y contaminación y luego se envían criopreservadas en dimetilsulfóxido al 10%.

La ventaja de las líneas celulares primarias es que las células son genéticamente idénticas a las células del donante. Esto es ideal, ya que un modelo in vitro debe imitar el tejido in vivo tanto como sea posible. La desventaja de las líneas celulares primarias es que tienen un número limitado de divisiones celulares o pasajes6. El número limitado de células disponibles restringe el número de experimentos que se pueden realizar con un solo cultivo primario, lo que aumenta el costo de los experimentos.

Las líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado en modelos de toxicidad por cultivo celular. Sin embargo, a diferencia de la línea celular primaria obtenida del tejido in vivo, la línea celular inmortalizada ha sido alterada genéticamente. Las células inmortalizadas se crean incorporando los genes de un virus en el ADN de las células primarias 6,7,8. Las células con incorporación exitosa de genes virales se seleccionan para la línea celular inmortalizada. La ventaja de la inmortalización es que permite una proliferación rápida indefinida, proporcionando un número ilimitado de células para realizar múltiples experimentos utilizando la misma línea celular. Esto permite la consistencia entre los experimentos y reduce el costo.

Además de los cambios en los genes que limitaron la proliferación celular, también podrían ocurrir cambios en la expresión de genes de funcionalidad crítica9. Por lo tanto, la desventaja de utilizar células inmortalizadas es que ya no pueden representar las células originales in vivo en términos de su respuesta a diversos estímulos externos10. Las comparaciones han implicado observar los efectos tóxicos de los productos químicos sobre los queratocitos corneales humanos primarios e inmortalizados11, así como sobre los HCEC inmortalizados y las células primarias epiteliales corneales del conejo12. La comparación entre los efectos de las toxinas sobre los queratocitos humanos primarios y los queratocitos inmortalizados no mostró diferencias significativas11. Utilizando los métodos detallados en este artículo, se determinará la efectividad de estos ensayos para evaluar la toxicidad de la radiación UV y las toxinas oculares en pHCEC e iHCEC.

Se seleccionaron tres toxinas oculares comúnmente utilizadas en ensayos in vitro: BAK,H2O2y SDS. BAK es un conservante catiónico comúnmente utilizado en soluciones oftálmicas 13,14,H2O2se usa comúnmente para desinfectar lentes de contacto 15, y SDS es un tensioactivo aniónico que se encuentra en detergentes y champús 14. Al igual que las toxinas oculares, la radiación UV también puede causar daños significativos a los HCEC3. Además, la sobreexposición a los rayos UV puede causar una condición ocular conocida como fotoqueratitis caracterizada por síntomas de lagrimeo, sensibilidad a la luz y una sensación de arenilla16.

Hay un número ilimitado de cultivos celulares primarios que se pueden utilizar y varias líneas celulares inmortalizadas que se han desarrollado. Por lo tanto, se realizó una investigación para comparar los HCEC primarios con una línea de HCEC inmortalizada para determinar similitudes y diferencias entre los modelos que incorporan este tipo de células.

Esta investigación utilizó microscopía para evaluar las posibles diferencias entre pHCEC e iHCEC en la respuesta fisiológica celular a los rayos UV y las toxinas. También se evaluaron los efectos de la radiación UV y los productos químicos sobre la actividad metabólica celular y la liberación de citoquinas inflamatorias para las dos líneas celulares. La importancia de determinar las diferencias entre las dos líneas celulares es comprender el uso óptimo de estas líneas celulares para evaluar: 1) el efecto de la radiación UV en las células, 2) los efectos de las toxinas en las células y 3) los cambios resultantes en el metabolismo, la viabilidad celular y la liberación de citoquinas celulares para estudios futuros.

Protocolo

1. Cultivo de pHCECs e iHCECs

  1. Cultivar los pHCEC e iHCEC en medio epitelial ocular humano (HOEM) con los siguientes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de medios celulares O (tabla de materiales), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% suplemento de medios celulares P (tabla de materiales), 5 μg/ml de insulina rh, 5 μg/ml de apotransferrina y 100 ng/ml de hemisuccinato de hidrocortisona en matraces de cultivo recubiertos de colágeno-1 (18 ml en un matraz de cultivo de 75 cm2 ).
  2. Cambie el medio en los matraces cada 2-3 días eliminando el medio después de que las células crezcan a ~ 80% de confluencia. Añadir la solución de disociación sin rojo fenol e incubar el matraz a 37 °C hasta que las células estén completamente separadas. Neutralizar la solución de disociación con DMEM/F12 con suero y luego centrifugar las células a 500 × g. Retire el medio sobrenadante y resuspenda las células en medio HEM.

2. Determinación del tamaño celular mediante microscopía confocal

  1. Sembrar tanto pHCEC como iHCEC en placas de Petri recubiertas de colágeno con cubreobjetos con fondo de vidrio a una concentración de 1 × 105 con 1 ml de HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs, un conjunto de cultivos durante 24 horas y otro conjunto de cultivos durante 48 h, en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
  2. Después del período de incubación, teñir las células con 500 μL de solución tampón de tinción de anexina que contenga calceína (4 μM), etidio homodímero-1 (8 μM) y anexina V (5 μL en 500 μL tampón-Alexa Fluor 647 conjugado) durante 20 min a 37 °C. Después de teñir las células, ajuste el microscopio para capturar las longitudes de onda de excitación/emisión de 488/515 nm para calceína-AM, 543/600 nm para el homodímero etidio-1 y 633/665 nm para la anexina V utilizando un microscopio de barrido láser confocal.
  3. Obtenga las imágenes y tome pilas Z para evaluar el tamaño de la celda en tres dimensiones.
    1. Para adquirir las imágenes bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D), encuentre el área a obtener la imagen con un objetivo de agua apocromático 40x/1.2. Con los láseres Argon (488) (primer escaneo), HeNe1 (543) (segundo escaneo) y HeNe2 (633) (tercer escaneo), escanee en tres canales separados utilizando los divisores de haz, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis y NFT 545 LP560, LP505.
    2. Utilice el escaneo secuencial multipista para reducir la diafonía.
      NOTA: LP505 se utiliza para el canal 2 con el láser 488 para capturar la emisión del colorante de calceína. LP560 se utiliza en el canal 3 con el láser 543 para capturar la emisión del homodímero etidio 1. NFT 635 se utiliza con el láser 633 para capturar la emisión de la anexina V. El propósito del HFT es separar la luz de excitación y emisión. NFT divide la luz reflejando la luz < longitud de onda especificada a un canal separado mientras permite que la luz > una longitud de onda específica a través de un segundo canal. Los filtros LP bloquean longitudes de onda más cortas que la longitud de onda especificada y dejan pasar las longitudes de onda más largas.
    3. Para crear una imagen en 3D, establezca la confocal en Z-stack y escanee al menos 20 fotogramas.

3. Exposición de las células a la radiación UV

  1. Sembrar las células a 5 × 104/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 h. Después del período de incubación, reducir el volumen del medio en los pocillos a 300 μL. A continuación, exponga las células a la radiación UV (tanto UVA a 6,48 W / m 2 como UVB a 1,82 W / m2, ya que los tubos UVA y UVB se encienden en la incubadora al mismo tiempo) en una incubadora de 37 ° C durante 5 y 20 minutos en experimentos separados.
  2. Después de la radiación UV, añadir 200 μL de HOEM fresco a cada pocillo e incubar durante 20 h a 37 °C con 5% deCO2.
  3. Después de la incubación, recoja el sobrenadante celular en cada pocillo y transfiéralo a tubos estériles de polipropileno de 2 ml. Congelar a -80 °C. Para determinar los niveles de citoquinas liberados por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los rayos UV, utilice un ensayo de citoquinas multiplex y siga las instrucciones del kit para cuantificar las siguientes cuatro citocinas: IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α.
  4. Agregue reactivo de ensayo metabólico a las células en los pocillos.
  5. Preparar un reactivo de ensayo metabólico al 10% en DMEM/F12. Sustituir el medio de cultivo de cada pocillo por 1 ml de la solución de ensayo metabólico al 10% e incubar a 37 °C conCO2 al 5% durante 4 h.
  6. Mida la fluorescencia de cada solución utilizando un lector de placas fluorescentes a longitudes de onda de excitación/emisión de 530/590 nm.

4. Exposición de las células a toxinas químicas

  1. Sembrar células a 5 × 104/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 h. Después del período de incubación, retire el medio y exponga las células a 1 ml de toxinas químicas (BAK 0.001%,H2O2 0.01% y SDS 0.0025% en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) durante 5 y 15 min.
  2. Después de la exposición a las toxinas químicas, retire las toxinas de los pozos, enjuague con 1 ml de PBS y agregue 1 ml de HOEM a cada pozo. Después de 20 h de incubación, realizar un ensayo metabólico reemplazando el medio con 1 ml de una solución de ensayo metabólico al 10% e incubando a 37 °C con 5% deCO2 durante 4 h. Mida la fluorescencia utilizando un lector de placas de fluorescencia de pocillos múltiples a longitudes de onda de excitación/emisión de 530/590 nm.
  3. Transfiera los sobrenadantes celulares de los pocillos después de la incubación de 20 h a tubos de polipropileno estériles separados de 2 ml y congele a -80 °C. Cuantificar las citoquinas liberadas por los pHCEC e iHCEC después de la exposición a los productos químicos. Utilice la misma plataforma multiplex utilizada para evaluar las citoquinas de las células tratadas con UV. Use un ensayo de citoquinas multiplex siguiendo las instrucciones del kit para cuantificar las siguientes cuatro citocinas: IL-6, IL-8, IL-1β y TNF-α.

5. Examen de células expuestas a diversas concentraciones de BAK

  1. Sembrar células a 1 × 10 5/mL de HOEM en cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno-1 de 24 pocillos e incubar a 37 °C con5% deCO2 durante 24 h. Después del período de incubación, retire el medio y exponga las células a 1 ml de toxinas químicas (BAK 0.001%, BAK 0.005% y BAK 0.01% en PBS) durante 5 min.
  2. Después de la exposición, elimine las toxinas químicas, enjuague los pocillos con 1 ml de PBS y agregue 1 ml de HOEM a cada pocillo. Después de 20 h de incubación, teñir las células con 500 μL de solución tampón de tinción de anexina que contenga calceína (4 μM), etidio homodímero-1 (8 μM) y anexina V (5 μL en 500 μL tampón-Alexa Fluor 647 conjugado) durante 20 min a 37 °C. Ajuste el microscopio para medir las intensidades de la tinción de anexina V, calceína AM y etidio-1 en longitudes de onda de excitación/emisión de 630/675 nm, 495/515 nm y 528/617 nm, respectivamente. Obtener imágenes de las células con el microscopio de fluorescencia

6. Análisis de datos

  1. Realice una prueba de normalidad y una prueba de varianzas iguales antes de realizar un análisis de varianza (ANOVA), ANOVA de Welch o prueba de Kruskal-Wallis. Utilice la prueba post-hoc adecuada para comparar cada grupo probado. Establezca p < 0.05.

Resultados

Tamaño de la celda
Los HCEC primarios e inmortalizados se visualizaron con tres colorantes fluorescentes, que reflejan tres etapas diferentes de viabilidad celular. Las células vivas son verdes (calceína-AM), las células muertas son rojas (ethidium homodimer-1) y las células apoptóticas son amarillas (anexina V-color ajustado por computadora para una mejor visualización de la señal de fluorescencia). Las células vivas contienen esterasas en el citoplasma celular y convierten la calceína-AM e...

Discusión

Se evaluaron las diferencias potenciales en el uso de dos tipos de HCEC. Las células se colocaron en el mismo medio (HOEM) en concentraciones idénticas de células y luego se expusieron a períodos cortos y largos de radiación UV y tres toxinas oculares. Las dosis de radiación UV y productos químicos se seleccionaron en función de sus efectos fisiológicos, que eran lo suficientemente dañinos para las células como para producir respuestas intermedias que pudieran compararse. Los tiempos de exposición de 5 y 20 m...

Divulgaciones

El autor, Lyndon W. Jones, durante los últimos 3 años, a través de CORE, ha recibido apoyo de investigación o honorarios de conferencias de las siguientes compañías: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage y Visioneering. Lyndon Jones también es consultor y/o miembro de un consejo asesor de Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis y Ophtecs. Los otros autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores no recibieron fondos para este trabajo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
75 cm2 Vented FlaskCorning354485This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well platecostar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Annexin Staining buffer solutionInvitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin VInvitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 systemCarl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well platesCorning354505This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5BioTekCYT5MPVCan read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine SerumHyconeSH30396.03
glass bottom coverslipsMatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial CellsUniversity of OttawaN/ASV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:Millipore, Billerica, MA, USASCMC001Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimerInvitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrumentRockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assayRockville, MD, USA
Penicillin StreptomycinGibco15140-122100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial CellsMillipore, Billerica, MA, USASCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate readerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)Fisher Scientific12605036

Referencias

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