קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית

Summary

מאמר זה מתאר את ההליכים המשמשים להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים בקו תאים ראשוני ואימורטלי.

Abstract

מאמר זה מתאר את השיטות למדידת הרעילות של קרינה אולטרה סגולה (UV) ורעלנים עיניים על תרביות תאי אפיתל ראשוניים (pHCEC) ומונצחים (iHCEC). התאים נחשפו לקרינת UV ולמינונים רעילים של בנזלקוניום כלוריד (BAK), מי חמצן (H 2 O₂) וסודיום דודציל סולפט (SDS). הפעילות המטבולית נמדדה באמצעות בדיקה מטבולית. שחרור ציטוקינים דלקתיים נמדד באמצעות אינטרלוקין רב-תכליתי (IL)-1β, IL-6, IL-8 ובדיקת גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), והתאים הוערכו לכדאיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.

ההשפעות המזיקות של UV על פעילות מטבולית של תאים ושחרור ציטוקינים התרחשו ב -5 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCEC ו -20 דקות עבור pHCEC. ירידות באחוזים דומים בפעילות המטבולית של iHCEC ו-pHCEC התרחשו לאחר חשיפה ל-BAK, H 2O₂ או SDS, והשינויים המשמעותיים ביותר בשחרור ציטוקינים התרחשו עבור IL-6 ו-IL-8. מיקרוסקופיה של תאים שנחשפו ל-iHCEC ו-pHCEC שנחשפו ל-BAK עם כתמים פלואורסצנטיים הראתה מוות תאי בחשיפה של 0.005% ל-BAK, אם כי מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCECs. באמצעות שיטות מרובות להערכת השפעות רעילות באמצעות מיקרוסקופיה, הערכות של פעילות מטבולית וייצור ציטוקינים, ניתן לקבוע את הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים הן עבור קווי תאים ראשוניים והן עבור קווי תאים אימורטליים.

Introduction

מחקרי טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוצעים כדי לחזות את ההשפעות הרעילות של כימיקלים וחומרים אחרים שיכולים לגרום נזק לתאים. בהערכת רעילות לקרנית, תאי אפיתל של הקרנית האנושית (HCECs) שימשו במודלים להערכת השפעות אלה 1,2,3,4. מודלים אלה בדרך כלל מעריכים השפעות פיזיולוגיות כגון שינויים בפעילות המטבולית של התא, התפשטות תאים, ותפקודי תאים אחרים כגון ייצור ושחרור של ציטוקינים דלקתיים. עבור מחקרים טוקסיקולוגיים אלה, תאים ממקורות שונים נבחרו כדי להעריך את ההשפעות המזיקות של כימיקלים וקרינת UV על HCECs ^2,3. קווי pHCEC זמינים מחברות המספקות תאים אלה מרקמות תורם של מבוגרים. תאים ראשוניים ניתן לטפל עם dispase בעדינות לגרד את הקרנית עבור תרבית⁵. התאים נבדקים לאחר מכן עבור וירוסים וזיהום ולאחר מכן נשלח cryopreserved ב 10% dimethyl sulfoxide.

היתרון של קווי תאים ראשוניים הוא שהתאים זהים גנטית לתאי התורם. זה אידיאלי, כמו מודל in vitro צריך לחקות את רקמת in vivo ככל האפשר. החיסרון של קווי תאים ראשוניים הוא שיש להם מספר מוגבל של חלוקות תאים או מעברים⁶. מספר התאים המוגבל הזמין מגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע בתרבית ראשונית אחת, ומייקר את עלות הניסויים.

קווי תאים אימורטליים שימשו גם במודלים של רעילות תרביות תאים. עם זאת, בניגוד לקו התאים הראשוני המתקבל מרקמת in vivo, קו התאים האימורטלי השתנה גנטית. תאים אימורטליים נוצרים על ידי שילוב גנים של וירוס בדנ"א של תאים ראשוניים ^6,7,8. תאים עם שילוב מוצלח של גנים נגיפיים נבחרים לקו התאים האימורטלי. היתרון של אימורטליזציה הוא שהיא מאפשרת התפשטות מהירה ללא הגבלת זמן, ומספקת מספר בלתי מוגבל של תאים לביצוע ניסויים מרובים באמצעות אותו קו תאים. זה מאפשר עקביות בין ניסויים ומפחית את העלות.

בנוסף לשינויים בגנים שהגבילו את התפשטות התאים, שינויים בביטוי גנים בעלי פונקציונליות קריטית יכולים להתרחש גם⁹. לכן, החיסרון בשימוש בתאים אימורטליים הוא שהם עשויים כבר לא לייצג את תאי in vivo המקוריים מבחינת התגובה שלהם לגירויים חיצוניים שונים¹⁰. ההשוואות כללו התבוננות בהשפעות הרעילות של כימיקלים על קרטוציטים ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית¹¹, כמו גם HCECs אימורטליים ותאים ראשוניים של אפיתל קרנית ארנבת¹². ההשוואה בין ההשפעות של רעלים על קרטוציטים אנושיים ראשוניים לבין קרטוציטים אלמותיים לא הראתה הבדלים משמעותיים¹¹. באמצעות השיטות המפורטות במאמר זה, תיקבע היעילות של בדיקות אלה להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלני עיניים על pHCECs ו- iHCECs.

נבחרו שלושה רעלנים עיניים הנפוצים בבדיקות מבחנה: BAK, H 2 O₂ו- SDS. BAK הוא חומר משמר קטיוני הנפוץ בתמיסות עיניים 13,14, H 2 O₂משמש בדרך כלל לחיטוי עדשות מגע 15^, ו-SDS הוא חומר פעילי שטח אניוני המצוי בדטרגנטים ושמפו ¹⁴. בדומה לרעלני עיניים, קרינת UV יכולה גם לגרום נזק משמעותי ל- HCECs³. בנוסף, חשיפת יתר לקרינת UV עלולה לגרום למצב עיני המכונה פוטוקרטיטיס המאופיין בתסמינים של קריעה, רגישות לאור ותחושת גרגריות¹⁶.

יש מספר בלתי מוגבל של תרביות תאים ראשוניות שניתן להשתמש בהן וקווי תאים אימורטליים שונים שפותחו. לכן, נערך מחקר כדי להשוות HCEC ראשוניים לקו HCEC אימורטלי כדי לקבוע דמיון והבדלים בין מודלים המשלבים סוגים אלה של תאים.

מחקר זה השתמש במיקרוסקופ כדי להעריך הבדלים אפשריים בין pHCECs ו- iHCECs על התגובה הפיזיולוגית של התא לקרינת UV ורעלנים. כמו כן נבדקו ההשפעות של קרינת UV וכימיקלים על הפעילות המטבולית של התא ושחרור ציטוקינים דלקתיים עבור שני קווי התא. החשיבות של קביעת ההבדלים בין שני קווי התאים היא להבין את השימוש המיטבי בקווי תאים אלה להערכה: 1) ההשפעה של קרינת UV על תאים, 2) ההשפעות של רעלים על תאים, 3) השינויים הנובעים מכך בחילוף החומרים, בכדאיות התא ובשחרור ציטוקינים בתאים למחקרים עתידיים.

Protocol

1. תרבות של pHCECs ו- iHCECs

1. לגדל את pHCECs ו- iHCECs בתווך אפיתל עיני אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: 6 mM L-גלוטמין, 0.002% תוסף מדיה התאית O (טבלה של חומרים), 1.0 μM אפינפרין, 0.4% תוסף מדיה התאית P (טבלה של חומרים), 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין rh, 5 מיקרוגרם / מ"ל apo-transferrin, ו 100 ng / mL הידרוקורטיזון hemisuccinate ב collagen-1 מצופה צלוחיות תרבית (18 מ"ל ב 75 ס"מ² צלוחיות תרבית).
2. שנה את התווך בצלוחיות כל 2-3 ימים על ידי הסרת התווך לאחר שהתאים גדלים ל~ 80% מפגש. מוסיפים תמיסת דיסוציאציה ללא פנול אדום ודוגרים על הבקבוק בטמפרטורה של 37°C עד לניתוק מלא של התאים. נטרל את תמיסת הדיסוציאציה עם DMEM/F12 עם סרום ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 500 × גרם. הסר את המדיום supernatant והשהה מחדש את התאים בתווך HOEM.

2. קביעת גודל התא באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

1. זרעו הן pHCEC והן iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסויים בתחתית זכוכית בריכוז של 1 × 10⁵ עם 1 מ"ל של HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs, קבוצה אחת של תרבויות במשך 24 שעות וקבוצה אחרת של תרבויות במשך 48 שעות, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. לאחר תקופת הדגירה, יש להכתים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 μL המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומדימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. לאחר צביעת התאים, התאימו את המיקרוסקופ ללכידת אורכי גל עירור/פליטה של 488/515 ננומטר עבור calcein-AM, 543/600 ננומטר עבור ethidium homodimer-1, ו-633/665 ננומטר עבור annexin V באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
3. השג את התמונות וצלם ערימות Z כדי להעריך את גודל התא בשלושה ממדים.
   1. כדי לקבל את התמונות הדו-ממדיות (2D) והתלת-ממדיות (3D), מצא את האזור לתמונה עם מטרת מים apochromat 40x/1.2. באמצעות לייזרים Argon (488) (סריקה ראשונה), HeNe1 (543) (סריקה שנייה ו-HeNe2 (633) (סריקה שלישית), סרוק בשלושה ערוצים נפרדים באמצעות מפצלי האלומה, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis ו-NFT 545 LP560, LP505.
   2. השתמש בסריקה רציפה מרובת רצועות כדי להפחית את הדיבור הצולב.
      הערה: LP505 משמש עבור ערוץ 2 עם לייזר 488 כדי ללכוד את הפליטה של צבע calcein. LP560 משמש בערוץ 3 עם לייזר 543 כדי ללכוד את הפליטה של אתידיום הומודימר 1. NFT 635 משמש עם לייזר 633 כדי ללכוד את הפליטה של נספח V. מטרת ה- HFT היא להפריד את אור העירור והפליטה. NFT מפצל אור על ידי החזרת אור < אורך גל מסוים לערוץ נפרד, תוך מתן אפשרות לאור > אורך גל מסוים עד לערוץ שני. מסנני LP חוסמים אורכי גל קצרים יותר מאורך הגל שצוין ומאפשרים לאורכי הגל הארוכים יותר לעבור.
   3. לתמונה בתלת-ממד, הגדירו את הקונפוקל ל-Z-stack וסרקו לפחות 20 מסגרות.

3. חשיפת תאים לקרינת UV

1. זרעו את התאים ב 5 × 10⁴/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות ודגרו ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 μL. לאחר מכן, חשוף את התאים לקרינת UV (הן UVA ב 6.48 W/m 2 והן UVB ב 1.82 W/m² כאשר צינורות UVA ו- UVB מופעלים באינקובטור בו זמנית) באינקובטור 37 ° C למשך 5 ו -20 דקות בניסויים נפרדים.
2. לאחר קרינת UV, להוסיף 200 μL של HOEM טרי לכל באר לדגור במשך 20 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
3. לאחר הדגירה, לאסוף את התא supernatant בכל באר ולהעביר אותו לתוך סטרילי 2 מ"ל צינורות פוליפרופילן. להקפיא ב -80 ° C. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו-TNF-α.
4. הוסף מגיב בדיקה מטבולית לתאים בבארות.
5. הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM/F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר עם 1 מ"ל של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 4 שעות.
6. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.

4. חשיפה של תאים לרעלים כימיים

1. תאי זרע ב 5 × 10⁴/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, H 2 O₂0.01%, ו- SDS 0.0025% במי מלח חוצצי פוספט (PBS)) למשך 5 ו -15 דקות.
2. לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, להסיר את הרעלים מן הבארות, לשטוף עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מ"ל של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות רב-באר פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.
3. מעבירים את הסופרנאטנטים של התא מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מ"ל ומקפיאים ב -80 מעלות צלזיוס. כמת ציטוקינים ששוחררו על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לכימיקלים. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV. השתמש בבדיקת ציטוקינים מרובים בהתאם להוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו- TNF-α.

5. בדיקת תאים שנחשפו לריכוזים שונים של BAK

1. זרע תאים ב 1 × 10 5/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם⁵% CO₂ במשך 24 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, BAK 0.005% ו- BAK 0.01% ב- PBS) למשך 5 דקות.
2. לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 μL של תמיסת חיץ צביעת אנקסין המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומודימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות של צביעת נספח V, calcein AM ו-ethidium-1 באורכי גל עירור/פליטה של 630/675 ננומטר, 495/515 ננומטר ו-528/617 ננומטר, בהתאמה. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

6. ניתוח נתונים

1. בצע בדיקת נורמליות ובדיקה לשונות שווה לפני ביצוע ניתוח שונות (ANOVA), Welch ANOVA או מבחן Kruskal-Wallis. השתמש במבחן הפוסט-הוק המתאים להשוואה בין כל קבוצה שנבדקה. הגדר p < 0.05.

תוצאות

גודל תא
HCECs הראשוניים והמונצחים הודגמו באמצעות שלושה צבעים פלואורסצנטיים, המשקפים שלושה שלבים שונים של קיום התא. תאים חיים הם ירוקים (calcein-AM), תאים מתים הם אדומים (ethidium homodimer-1), ותאים אפופטוטיים הם צהובים (annexin V-מחשב מותאם צבע עבור הדמיה טובה יותר של אות פלואורסצנטי). תאים חיים מכיל?...

Discussion

הוערכו הבדלים פוטנציאליים בשימוש בשני סוגים של HCEC. התאים מוקמו באותו תווך (HOEM) בריכוזים זהים של תאים ולאחר מכן נחשפו לפרקי זמן קצרים וארוכים של קרינת UV ושלושה רעלנים עיניים. מינונים של קרינת UV וכימיקלים נבחרו על סמך ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם, שהיו מזיקות מספיק לתאים כדי לייצר תגובות ביניי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036