Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

Resumo

Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.

Resumo

Este artigo descreve os métodos de medição da toxicidade da radiação ultravioleta (UV) e toxinas oculares em culturas de células epiteliais primárias (pHCEC) e imortalizadas (iHCEC). As células foram expostas à radiação UV e a doses tóxicas de cloreto de benzalcônio (BAK), peróxido de hidrogênio (H 2O₂) e dodecil sulfato de sódio (SDS). A atividade metabólica foi medida por meio de um ensaio metabólico. A liberação de citocinas inflamatórias foi medida usando um ensaio multiplex de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e as células foram avaliadas quanto à viabilidade usando corantes fluorescentes.

Os efeitos prejudiciais dos UV sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas ocorreram em 5 min de exposição UV para iHCEC e 20 min para pHCEC. Quedas percentuais semelhantes na atividade metabólica do iHCEC e pHCEC ocorreram após a exposição a BAK, H 2 O₂ou SDS, e as mudanças mais significativas na liberação de citocinas ocorreram para IL-6 e IL-8. A microscopia das células iHCEC e pHCEC expostas a BAK, coradas fluorescentemente, mostrou morte celular com 0,005% de exposição a BAK, embora o grau de coloração de etídio tenha sido maior nos iHCECs do que nos pHCECs. Utilizando múltiplos métodos de avaliação de efeitos tóxicos usando microscopia, avaliações da atividade metabólica e produção de citocinas, a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas pôde ser determinada tanto para linhagens celulares primárias quanto imortalizadas.

Introdução

Estudos toxicológicos in vitro são realizados para prever os efeitos tóxicos de produtos químicos e outros agentes que podem causar danos às células. Na avaliação da toxicidade para a córnea, células epiteliais corneanas humanas (HCECs) têm sido utilizadas em modelos para avaliação desses efeitos 1,2,3,4. Esses modelos tipicamente avaliam efeitos fisiológicos, como alterações na atividade metabólica da célula, proliferação celular e outras funções celulares, como a produção e liberação de citocinas inflamatórias. Para esses estudos toxicológicos, células de várias fontes foram selecionadas para avaliar os efeitos nocivos de produtos químicos e radiação UV sobre HCECs ^2,3. As linhas pHCEC estão disponíveis em empresas que fornecem essas células a partir de tecidos de doadores de adultos. As células primárias podem ser tratadas com dispase e raspadas suavemente da córnea para cultura⁵. As células são então testadas para vírus e contaminação e, em seguida, enviadas criopreservadas em 10% de dimetil sulfóxido.

A vantagem das linhagens celulares primárias é que as células são geneticamente idênticas às células do doador. Isso é ideal, pois um modelo in vitro deve mimetizar o tecido in vivo tanto quanto possível. A desvantagem das linhagens celulares primárias é que elas têm um número limitado de divisões ou passagens celulares⁶. O número limitado de células disponíveis restringe o número de experimentos que podem ser conduzidos com uma única cultura primária, aumentando o custo dos experimentos.

Linhagens celulares imortalizadas também têm sido utilizadas em modelos de toxicidade em cultura celular. No entanto, ao contrário da linhagem celular primária obtida do tecido in vivo, a linhagem celular imortalizada foi geneticamente alterada. As células imortalizadas são criadas pela incorporação dos genes de um vírus ao DNA das células primárias6,7,8. Células com incorporação gênica viral bem-sucedida são selecionadas para a linhagem celular imortalizada. A vantagem da imortalização é que ela permite uma proliferação rápida indefinida, fornecendo um número ilimitado de células para realizar vários experimentos usando a mesma linhagem celular. Isso permite a consistência entre os experimentos e reduz o custo.

Além de alterações nos genes que limitavam a proliferação celular, alterações na expressão de genes de funcionalidade crítica também poderiam^ocorrer9. Portanto, a desvantagem do uso de células imortalizadas é que elas podem não mais representar as células originais in vivo em termos de resposta a vários estímulos externos¹⁰. Comparações envolveram a observação dos efeitos tóxicos de substâncias químicas sobre queratócitos corneanos humanos primários e imortalizados¹¹, bem como HCECs imortalizados e células primárias epiteliais da córnea de coelhos¹². A comparação entre os efeitos das toxinas sobre queratócitos humanos primários e queratócitos imortalizados não mostrou diferenças^{significativas11}. Usando os métodos detalhados neste artigo, a eficácia destes ensaios para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas oculares sobre pHCECs e iHCECs será determinada.

Três toxinas oculares comumente utilizadas em ensaios in vitro foram selecionadas: BAK, H 2 O₂e SDS. O BAK é um conservante catiônico comumente usado em soluções oftálmicas^13,14, o H 2 O₂ é comumente usado para desinfetar lentes de contato 15 e o SDS é um surfactante aniônico encontrado em detergentes e xampus ¹⁴. Assim como as toxinas oculares, a radiação UV também pode causar danos significativos aos HCECs³. Além disso, a superexposição aos raios UV pode causar uma condição ocular conhecida como fotoceratite, caracterizada por sintomas de lacrimejamento, sensibilidade à luz e sensação de arenosidade¹⁶.

Há um número ilimitado de culturas de células primárias que podem ser usadas e várias linhagens celulares imortalizadas que foram desenvolvidas. Portanto, uma investigação foi realizada para comparar HCECs primários com uma linhagem imortalizada de HCEC para determinar semelhanças e diferenças entre modelos que incorporam esses tipos de células.

Esta investigação utilizou microscopia para avaliar possíveis diferenças entre pHCECs e iHCECs na resposta fisiológica celular a UV e toxinas. Os efeitos da radiação UV e de produtos químicos sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas inflamatórias para as duas linhagens celulares também foram avaliados. A importância de determinar as diferenças entre as duas linhagens celulares é entender o uso ideal dessas linhagens celulares para avaliar: 1) o efeito da radiação UV nas células, 2) os efeitos das toxinas nas células e 3) as alterações resultantes no metabolismo, viabilidade celular e liberação de citocinas celulares para estudos futuros.

Protocolo

1. Cultura de pHCECs e iHCECs

1. Cultivar os pHCECs e iHCECs em meio epitelial ocular humano (HOEM) com os seguintes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de meio celular O (Tabela de Materiais), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% de suplemento de mídia celular P (Tabela de Materiais), 5 μg/mL de insulina rh, 5 μg/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de hidrocortisona hemisuccinato em frascos de cultura revestidos com colágeno-1 (18 mL em um frasco de cultura de 75 cm² ).
2. Troque o meio nos frascos a cada 2-3 dias, removendo o meio depois que as células crescerem até ~80% de confluência. Adicionar solução de dissociação sem vermelho de fenol e incubar o balão a 37 °C até que as células estejam completamente separadas. Neutralizar a solução de dissociação com DMEM/F12 com soro e, em seguida, centrifugar as células a 500 × g. Remova o meio sobrenadante e ressuspenda as células em meio HOEM.

2. Determinação do tamanho celular por microscopia confocal

1. Semeando tanto pHCECs quanto iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com lamínulas de fundo de vidro na concentração de 1 × 10⁵ com 1 mL de HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs, um conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto de culturas por 48 h, em estufa a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Após o período de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Após a coloração das células, ajustar o microscópio para capturar os comprimentos de onda de excitação/emissão de 488/515 nm para calceína-AM, 543/600 nm para homodímero de etídio-1 e 633/665 nm para anexina V usando um microscópio confocal de varredura a laser.
3. Obtenha as imagens e pegue pilhas Z para avaliar o tamanho da célula em três dimensões.
   1. Para adquirir as imagens bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D), encontre a área a ser fotografada com uma objetiva de água apócromática 40x/1.2. Com os lasers Argônio (488) (primeira varredura), HeNe1 (543) (segunda varredura e HeNe2 (633) (terceira varredura), digitalize em três canais separados usando os divisores de feixe, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis, e NFT 545 LP560, LP505.
   2. Use a varredura sequencial de várias faixas para reduzir o crosstalk.
      NOTA: LP505 é usado para o canal 2 com o laser 488 para capturar a emissão do corante de calceína. A LP560 é utilizada no canal 3 com o laser 543 para captar a emissão do homodímero de etídio 1. NFT 635 é usado com o laser 633 para capturar a emissão da anexina V. O objetivo do HFT é separar a excitação e a emissão de luz. O NFT divide a luz refletindo a luz < comprimento de onda especificado para um canal separado, deixando a luz > um comprimento de onda especificado até um segundo canal. Os filtros LP bloqueiam comprimentos de onda mais curtos do que o comprimento de onda especificado e deixam passar os comprimentos de onda mais longos.
   3. Para criar imagens em 3D, defina o confocal como Z-stack e digitalize pelo menos 20 quadros.

3. Exposição das células à radiação UV

1. Semeando as células a 5 × 10⁴/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 3 h. Após o período de incubação, reduzir o volume do meio nos poços para 300 μL. Em seguida, exponha as células à radiação UV (UVA a 6,48 W/m 2 e UVB a 1,82 W/m², pois os tubos UVA e UVB são ligados na incubadora ao mesmo tempo) em uma incubadora de 37 °C por 5 e 20 minutos em experimentos separados.
2. Após a radiação UV, adicionar 200 μL de HOEM fresco a cada poço e incubar durante 20 h a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Após a incubação, coletar o sobrenadante celular em cada poço e transferi-lo para tubos estéreis de polipropileno de 2 mL. Congelar a -80 °C. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.
4. Adicionar reagente de ensaio metabólico às células dos poços.
5. Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM/F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mL da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 °C com CO₂ a 5% por 4 h.
6. Medir a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.

4. Exposição das células a toxinas químicas

1. Células de sementes a 5 × 10⁴/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubam a 37 °C com 5% de CO₂ por 3 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, H 2O₂ 0,01% e SDS 0,0025% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) por 5 e 15 min.
2. Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio com 1 mL de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 °C com CO₂ a 5% por 4 h. Meça a fluorescência usando um leitor de placas multipoços de fluorescência em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.
3. Transferir os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 h para tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mL e congelar a -80 °C. Quantificar as citocinas liberadas pelos pHCECs e iHCECs após a exposição aos produtos químicos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV. Use um ensaio de citocinas multiplex seguindo as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.

5. Exame de células expostas a várias concentrações de BAK

1. Células de sementes a 1 × 10 5/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com⁵% de CO₂ por 24 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, BAK 0,005% e BAK 0,01% em PBS) por 5 min.
2. Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Ajustar o microscópio para medir intensidades de coloração de anexina V, calceína AM e etídio-1 nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 630/675 nm, 495/515 nm e 528/617 nm, respectivamente. Imagem das células usando o microscópio de fluorescência

6. Análise dos dados

1. Realizar um teste de normalidade e um teste para variâncias iguais antes de realizar uma análise de variância (ANOVA), ANOVA de Welch ou teste de Kruskal-Wallis. Use o teste post-hoc apropriado para comparar cada grupo testado. Definir p < 0,05.

Resultados

Tamanho da célula
Os HCECs primários e imortalizados foram visualizados com três corantes fluorescentes, que refletem três diferentes estágios de viabilidade celular. As células vivas são verdes (calceína-AM), as células mortas são vermelhas (homodímero etídio-1) e as células apoptóticas são amarelas (anexina V - cor ajustada por computador para melhor visualização do sinal de fluorescência). As células vivas contêm esterases no citoplasma celular e convertem calceína-AM em calce?...

Discussão

Diferenças potenciais no uso de dois tipos de HCECs foram avaliadas. As células foram colocadas no mesmo meio (HOEM) em concentrações idênticas de células e, em seguida, expostas a curtos e longos períodos de radiação UV e três toxinas oculares. As doses de radiação UV e produtos químicos foram selecionadas com base em seus efeitos fisiológicos, que foram prejudiciais o suficiente para as células produzirem respostas intermediárias que pudessem ser comparadas. Os tempos de exposição de 5 e 20 min para a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036