确定紫外线辐射和化学物质对原代和永生化的人角膜上皮细胞的毒性

摘要

本文介绍了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代和永生化细胞系的毒性的程序。

摘要

本文介绍了测量紫外线 （UV） 辐射和眼毒素对原发性 （pHCEC） 和永生化 （iHCEC） 人角膜上皮细胞培养物的毒性的方法。细胞暴露于紫外线辐射和有毒剂量的苯扎氯铵（BAK），过氧化氢（H 2 O₂）和十二烷基硫酸钠（SDS）。使用代谢测定法测量代谢活性。使用多重白细胞介素（IL）-1β，IL-6，IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定法测量炎症细胞因子的释放，并使用荧光染料评估细胞的活力。

紫外线对细胞代谢活性和细胞因子释放的破坏性影响发生在iHCEC的紫外线暴露5分钟和pHCEC的20分钟。在暴露于BAK，H₂O₂ 或SDS后，iHCEC和pHCEC的代谢活性下降百分比相似，IL-6和IL-8的细胞因子释放变化最显着。荧光染色的iHCEC和pHCEC BAK暴露细胞的显微镜检查显示，在0.005%BAK暴露时细胞死亡，尽管iHCEC的乙锭染色程度高于pHCEC。利用多种方法评估使用显微镜的毒性作用，评估代谢活性和细胞因子产生，可以确定原代和永生化细胞系的紫外线辐射和化学毒素的毒性。

引言

进行体外毒理学研究以预测可能对细胞造成损害的化学物质和其他试剂的毒性作用。在评估对角膜的毒性时，人角膜上皮细胞（HCEC）已被用于评估^{这些影响的模型中}1，²，^3，4。这些模型通常评估生理效应，例如细胞代谢活动的变化，细胞增殖和其他细胞功能，例如炎性细胞因子的产生和释放。对于这些毒理学研究，已经选择了来自不同来源的细胞来评估化学物质和紫外线辐射对HCEC的破坏作用^2，3。pHCEC系可从提供来自成人供体组织的这些细胞的公司获得。原代细胞可以用分散酶处理，并轻轻刮掉角膜进行培养⁵。然后对细胞进行病毒和污染测试，然后用10%二甲基亚砜冷冻保存。

原代细胞系的优点是细胞在遗传上与供体的细胞相同。这是理想的，因为 体外 模型应尽可能模仿 体内 组织。原代细胞系的缺点是它们的细胞分裂或传代次数^有限6。可用的细胞数量有限，限制了使用单一原代培养物可以进行的实验数量，增加了实验的成本。

永生化细胞系也已用于细胞培养毒性模型。然而，与从体内组织获得的原代细胞系不同，永生化的细胞系已经过遗传改变。永生化细胞是通过将病毒的基因结合到原代细胞^6，7，⁸的DNA中而创建的。为永生化细胞系选择具有成功病毒基因掺入的细胞。永生化的优点是它允许无限期的快速增殖，提供无限数量的细胞来使用相同的细胞系进行多次实验。这允许实验之间的一致性并降低成本。

除了限制细胞增殖的基因变化外，关键功能基因表达的变化也可能发生^9。因此，使用永生化细胞的缺点是，就对各种外部刺激的反应而言，它们可能不再 代表原始体内 细胞¹⁰。比较涉及观察化学物质对原代和永生化的人角膜角质细胞的毒性作用¹¹，以及永生化的HCEC和兔角膜上皮原代细胞¹²。毒素对原代人角质细胞和永生化角质细胞的影响之间的比较显示没有显着差异¹¹。使用本文中详述的方法，将确定这些测定法评估紫外线辐射和眼部毒素对pHCEC和iHCEC的毒性的有效性。

选择了体外测定中常用的三种眼部毒素:BAK，H 2 O₂和SDS。BAK是一种阳离子防腐剂，常用于眼用溶液¹³，^14，H₂O₂通常用于消毒隐形眼镜15，SDS是一种阴离子表面活性剂，存在于洗涤剂和洗发水中¹⁴。与眼部毒素类似，紫外线辐射也会对HCEC造成重大损害³。此外，过度暴露于紫外线会导致一种称为光角膜炎的眼部疾病，其特征是流泪、对光敏感和砂砾感的症状¹⁶.

可以使用无限数量的原代细胞培养物和已开发的各种永生化细胞系。因此，进行了一项研究，将原代HCEC与永生化的HCEC系进行比较，以确定包含这些类型细胞的模型之间的异同。

这项研究使用显微镜来评估pHCEC和iHCEC之间对紫外线和毒素的细胞生理反应的可能差异。还评估了紫外线辐射和化学物质对两种细胞系的细胞代谢活性和炎性细胞因子释放的影响。确定两种细胞系之间的差异的重要性在于了解这些细胞系的最佳用途，以评估:1）紫外线辐射对细胞的影响，2）毒素对细胞的影响，以及3）由此产生的代谢，细胞活力和细胞因子释放的变化，以供未来的研究。

研究方案

1. 生物用氯环油酸和生物异氯环氧乙烷的培养

1. 使用以下补充剂在人眼上皮培养基 （HOEM） 中培养 pHCEC 和 iHCEC:6 mM L-谷氨酰胺、0.002% 细胞培养基补充剂 O（材料表）、1.0 μM 肾上腺素、0.4% 细胞培养基补充剂 P（材料表）、5 μg/mL rh 胰岛素、5 μg/mL 载脂转铁蛋白和 100 ng/mL 半琥珀酸氢化可的松半琥珀酸酯在胶原蛋白-1 包被培养瓶中（75 cm² 培养瓶中为 18 mL）。
2. 每2-3天更换一次培养瓶中的培养基，在细胞生长至~80%汇合后除去培养基。加入不含酚红的解离溶液，并将烧瓶在37°C孵育直至细胞完全分离。用血清用DMEM / F12中和解离溶液，然后以500 × g离心细胞。除去上清液培养基并将细胞重悬于HOEM培养基中。

2. 使用共聚焦显微镜测定细胞大小

1. 用 1 mL HOEM 以 1 × 10⁵ 的浓度将 pHCEC 和 iHCEC 接种到带有玻璃底盖玻片的胶原蛋白包被的培养皿上。在含有5%CO₂的37°C培养箱中培养pHCEC和iHCEC，一组培养物24小时，另一组培养物48小时。
2. 孵育期后，用含有钙黄绿素（4μM），乙锭同源二聚体-1（8μM）和膜联蛋白V（5μL在500μL缓冲液-Alexa Fluor 647偶联物中的5μL）的膜联蛋白染色缓冲液在37°C下染色细胞20分钟。 染色细胞后，使用共聚焦激光扫描显微镜调整显微镜以捕获钙黄绿素-AM的488/515 nm，乙锭同源二聚体-1的543/600 nm和膜联蛋白V的633/665 nm的激发/发射波长。
3. 获取图像并采用Z堆栈以评估三维细胞大小。
   1. 要获取二维 （2D） 和三维 （3D） 图像，请使用复消色差 40x/1.2 水镜找到要成像的区域。使用氩气 （488）（第一次扫描）、HeNe1 （543）（第二次扫描）和 HeNe2 （633）（第三次扫描）激光器，使用 HFT 488/543/633、NFT 635 Vis 和 NFT 545 LP560、LP505 在三个单独的通道中进行扫描。
   2. 使用多轨顺序扫描来减少串扰。
      注意:LP505 用于带有 488 激光器的通道 2，以捕获钙黄绿素染料的发射。LP560 在通道 3 中使用 543 激光器来捕获乙锭同源二聚体 1 的发射。NFT 635 与 633 激光一起使用以捕获膜联蛋白 V 的发射。高频处理的目的是分离激发光和发射光。NFT 通过将指定波长<光反射到单独的通道来分割光，同时让>指定波长的光通过第二个通道。LP滤光片阻挡比指定波长更短的波长，并让较长的波长通过。
   3. 要以 3D 方式成像，请将共聚焦设置为 Z 堆栈并扫描至少 20 帧。

3. 细胞暴露于紫外线辐射

1. 在 24 孔胶原蛋白-1 包被的培养板的每个孔中以 5 ×^{10 4}/mL HOEM 接种细胞，并在 37 °C 下用 5% CO₂ 孵育 3 小时。孵育期后，将孔中培养基的体积减少至300μL。接下来，将细胞暴露在紫外线辐射下（6.48W / m 2的UVA和1.82W /^{m 2}的UVB，因为UVA和UVB管同时在培养箱中打开）在37°C培养箱中单独实验5和20分钟。
2. 紫外线辐射后，向每个孔中加入200μL新鲜HOEM，并在37°C下用5%CO₂孵育20小时。
3. 孵育后，收集每个孔中的细胞上清液并将其转移到无菌的2 mL聚丙烯管中。在-80°C冷冻。 为了确定 pHCEC 和 iHCEC 在紫外线照射后释放的细胞因子水平，请使用多重细胞因子测定并按照试剂盒的说明量化以下四种细胞因子:IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α。
4. 向孔中的细胞中加入代谢测定试剂。
5. 在DMEM / F12中制备10%代谢测定试剂。用1mL的10%代谢测定溶液替换每个孔中的培养基，并在37°C下用5%CO₂ 孵育4小时。
6. 使用荧光板读数器在530/590nm激发/发射波长下测量每种溶液的荧光。

4. 细胞暴露于化学毒素

1. 在24孔胶原蛋白-1包被的培养板的每个孔中接种5×10^{4 /} mL HOEM的细胞，并在37°C下用5%CO₂孵育3小时。孵育期后，除去培养基并将细胞暴露于1mL化学毒素（BAK 0.001%，H 2 O₂ 0.01%和SDS 0.0025%磷酸盐缓冲盐水（PBS））中5和15分钟。
2. 暴露于化学毒素后，从孔中取出毒素，用 1 mL PBS 冲洗，并向每个孔中加入 1 mL HOEM。孵育20小时后，通过用1mL的10%代谢测定溶液替换培养基并在37°C下用5%CO₂ 孵育4小时来进行代谢测定。使用荧光多孔板读数器在530/590nm激发/发射波长下测量荧光。
3. 孵育20小时后将细胞上清液从孔中转移到单独的无菌2mL聚丙烯管中，并在-80°C下冷冻。 量化pHCEC和iHCEC在接触化学物质后释放的细胞因子。使用与评估来自紫外线处理细胞的细胞因子相同的多重平台。按照试剂盒的说明使用多重细胞因子测定来定量以下四种细胞因子:IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α。

5. 检查暴露于各种浓度BAK的细胞

1. 在24孔胶原蛋白-1包被的培养板的每个孔中接种1×10^{5 /} mL HOEM的细胞，并在37°C下用5%CO₂ 孵育24小时。孵育期后，除去培养基并将细胞暴露于 1 mL 化学毒素（BAK 0.001%，BAK 0.005% 和 BAK 0.01% 在 PBS 中）中 5 分钟。
2. 暴露后，去除化学毒素，用 1 mL PBS 冲洗孔，并向每个孔中加入 1 mL HOEM。孵育20小时后，用含有钙黄绿素（4μM），乙锭同源二聚体-1（8μM）和膜联蛋白V（5μL在500μL缓冲液-Alexa Fluor 647偶联物中的5μL）的膜联蛋白染色缓冲液在37°C下染色细胞20分钟。 调整显微镜以分别在 630/675 nm、495/515 nm 和 528/617 nm 的激发/发射波长下测量膜联蛋白 V、钙黄绿素 AM 和乙锭-1 染色的强度。使用荧光显微镜对细胞进行成像

6. 数据分析

1. 在执行方差分析 （ANOVA）、Welch ANOVA 或 Kruskal-Wallis 检验之前，执行正态性检验和相等方差检验。使用适当的 事后 测试来比较每个测试组。将 p 设置为 0.05 <。

结果

细胞大小
用三种荧光染料可视化原代和永生化的HCEC，它们反映了细胞活力的三个不同阶段。活细胞为绿色（钙黄绿素-AM），死细胞为红色（乙锭同源二聚体-1），凋亡细胞为黄色（膜联蛋白V-计算机调整的颜色，以便更好地可视化荧光信号）。活细胞在细胞质中含有酯酶，并将钙黄绿素-AM转化为钙黄绿素。死细胞具有可渗透乙锭同源二聚体-1的细胞膜。凋亡细胞在细胞膜处有染色，...

讨论

评估了使用两种类型的HCEC的潜在差异。将细胞置于相同浓度的细胞的相同培养基（HOEM）中，然后暴露于短时间和长期的紫外线辐射和三种眼部毒素中。根据它们的生理效应选择紫外线辐射和化学物质的剂量，这些效应对细胞的损害足以产生可以比较的中间反应。紫外线辐射的暴露时间为5和20分钟，所选剂量的BAK （0.001%），SDS（0.0025%）和H 2 O₂（0.01%）的暴露时间为5和15分钟是理想...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036