Bestimmung der Toxizität von UV-Strahlung und Chemikalien auf primären und immortalisierten humanen Hornhautepithelzellen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (_H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.

Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,_H2O₂ oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.

Einleitung

In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen. Für diese toxikologischen Studien wurden Zellen aus verschiedenen Quellen ausgewählt, um die schädlichen Auswirkungen von Chemikalien und UV-Strahlung auf HCECs zu bewerten ^2,3. pHCEC-Linien sind von Unternehmen erhältlich, die diese Zellen aus Spendergewebe von Erwachsenen liefern. Primärzellen können mit Dispase behandelt und für die Kultur schonend von der Hornhaut abgekratzt werden⁵. Die Zellen werden dann auf Viren und Verunreinigungen getestet und dann kryokonserviert in 10% Dimethylsulfoxid verschickt.

Der Vorteil von primären Zelllinien besteht darin, dass die Zellen genetisch identisch mit den Zellen des Spenders sind. Dies ist ideal, da ein In-vitro-Modell das In-vivo-Gewebe so weit wie möglich nachahmen sollte. Der Nachteil von primären Zelllinien besteht darin, dass sie eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen oder -passagen^{aufweisen 6}. Die begrenzte Anzahl der verfügbaren Zellen schränkt die Anzahl der Experimente ein, die mit einer einzigen Primärkultur durchgeführt werden können, was die Kosten der Experimente erhöht.

Immortalisierte Zelllinien wurden auch in Toxizitätsmodellen für Zellkulturen verwendet. Im Gegensatz zur primären Zelllinie, die aus In-vivo-Gewebe gewonnen wird, wurde die immortalisierte Zelllinie jedoch genetisch verändert. Immortalisierte Zellen entstehen, indem die Gene eines Virus in die DNA von Primärzellen eingebaut^werden 6,7,8. Zellen mit erfolgreicher viraler Geninkorporation werden für die immortalisierte Zelllinie ausgewählt. Der Vorteil der Immortalisierung besteht darin, dass sie eine unbegrenzte schnelle Proliferation ermöglicht und eine unbegrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung stellt, um mehrere Experimente mit derselben Zelllinie durchzuführen. Dies ermöglicht Konsistenz zwischen den Experimenten und senkt die Kosten.

Zusätzlich zu den Veränderungen in den Genen, die die Zellproliferation einschränken, können auch Veränderungen in der Expression von Genen mit kritischer Funktionalität auftreten⁹. Der Nachteil der Verwendung von immortalisierten Zellen besteht daher darin, dass sie in Bezug auf ihre Reaktion auf verschiedene äußere Reize möglicherweise nicht mehr die ursprünglichen In-vivo-Zellen darstellen¹⁰. Bei den Vergleichen wurden die toxischen Wirkungen von Chemikalien auf primäre und immortalisierte menschliche Hornhautkeratozyten¹¹ sowie auf immortalisierte HCECs und Kaninchen-Hornhautepithel-Primärzellen¹² beobachtet. Der Vergleich zwischen den Effekten von Toxinen auf primäre humane Keratozyten und immortalisierte Keratozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede¹¹. Mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden wird die Wirksamkeit dieser Assays zur Beurteilung der Toxizität von UV-Strahlung und Augentoxinen auf pHCECs und iHCECs bestimmt.

Es wurden drei okuläre Toxine ausgewählt, die üblicherweise in In-vitro-Assays verwendet werden: BAK,_H2O2und SDS. BAK ist ein kationisches Konservierungsmittel, das häufig in ophthalmologischen Lösungen verwendet wird 13,14,_H2O2wird häufig zur Desinfektion von Kontaktlinsen 15 verwendet, und SDS ist ein anionisches Tensid^, das in Waschmitteln und Shampoos ¹⁴ vorkommt. Ähnlich wie Augentoxine kann auch UV-Strahlung HCECs erheblich schädigen³. Darüber hinaus kann eine übermäßige UV-Strahlung eine Augenerkrankung verursachen, die als Photokeratitis bekannt ist und durch Symptome wie Tränenfluss, Lichtempfindlichkeit und ein Gefühl der Körnigkeit gekennzeichnet ist¹⁶.

Es gibt eine unbegrenzte Anzahl von primären Zellkulturen, die verwendet werden können, und verschiedene immortalisierte Zelllinien, die entwickelt wurden. Daher wurde eine Untersuchung durchgeführt, um primäre HCECs mit einer immortalisierten HCEC-Linie zu vergleichen, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Modellen zu ermitteln, die diese Zelltypen enthalten.

Diese Untersuchung nutzte die Mikroskopie, um mögliche Unterschiede zwischen pHCECs und iHCECs in Bezug auf die physiologische Reaktion der Zellen auf UV-Strahlung und Toxine zu bewerten. Die Auswirkungen von UV-Strahlung und Chemikalien auf die Zellstoffwechselaktivität und die inflammatorische Zytokinfreisetzung für die beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Die Bedeutung der Bestimmung der Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien besteht darin, die optimale Verwendung dieser Zelllinien für die Bewertung zu verstehen: 1) die Wirkung von UV-Strahlung auf Zellen, 2) die Auswirkungen von Toxinen auf Zellen und 3) die daraus resultierenden Veränderungen des Stoffwechsels, der Zelllebensfähigkeit und der Zellzytokinfreisetzung für zukünftige Studien.

Protokoll

1. Kultivierung von pHCECs und iHCECs

1. Züchten Sie die pHCECs und iHCECs in humanem okulärem Epithelmedium (HOEM) mit den folgenden Nahrungsergänzungsmitteln: 6 mM L-Glutamin, 0,002 % Zellmedienergänzung O (Materialtabelle), 1,0 μM Epinephrin, 0,4 % Zellmedienergänzung P (Materialtabelle), 5 μg/ml rh Insulin, 5 μg/ml Apotransferrin und 100 ng/ml Hydrocortisonhemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (18 ml in einem 75 cm² Kulturkolben).
2. Wechseln Sie das Medium in den Kolben alle 2-3 Tage, indem Sie das Medium entfernen, nachdem die Zellen auf ~80% Konfluenz gewachsen sind. Dissoziationslösung ohne Phenolrot zugeben und den Kolben bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Neutralisieren Sie die Dissoziationslösung mit DMEM/F12 mit Serum und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 500 × g. Entfernen Sie das überstehende Medium und resuspendieren Sie die Zellen in HOEM-Medium.

2. Bestimmung der Zellgröße mittels konfokaler Mikroskopie

1. Säen Sie sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Glasbodendeckgläsern in einer Konzentration von 1 × 10⁵ mit 1 ml HOEM. Kultivieren Sie pHCECs und iHCECs, einen Satz Kulturen für 24 Stunden und einen anderen Satz Kulturen für 48 Stunden, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO₂.
2. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μl in 500 μl Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Nach der Färbung der Zellen ist das Mikroskop so einzustellen, dass es die Anregungs-/Emissionswellenlängen von 488/515 nm für Calcein-AM, 543/600 nm für Ethidiumhomodimer-1 und 633/665 nm für Annexin V mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop erfasst.
3. Erhalten Sie die Bilder und nehmen Sie Z-Stapel auf, um die Zellgröße in drei Dimensionen zu bestimmen.
   1. Um die zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) Bilder aufzunehmen, suchen Sie den abzubildenden Bereich mit einem apochromatischen 40x/1,2-Wasserobjektiv. Scannen Sie mit den Lasern Argon (488) (erster Scan), HeNe1 (543) (zweiter Scan) und HeNe2 (633) (dritter Scan) in drei separaten Kanälen mit den Strahlteilern HFT 488/543/633, NFT 635 Vis und NFT 545 LP560, LP505.
   2. Verwenden Sie mehrspuriges sequenzielles Scannen, um Übersprechen zu reduzieren.
      HINWEIS: LP505 wird für Kanal 2 mit dem 488-Laser verwendet, um die Emission des Calcine-Farbstoffs zu erfassen. LP560 wird in Kanal 3 mit dem Laser 543 verwendet, um die Emission des Ethidium-Homodimers 1 zu erfassen. NFT 635 wird mit dem Laser 633 verwendet, um die Emission des Annexins V zu erfassen. Der Zweck des HFT ist es, das Anregungs- und Emissionslicht zu trennen. NFT spaltet Licht, indem es Licht < bestimmten Wellenlänge in einen separaten Kanal reflektiert, während Licht > einer bestimmten Wellenlänge zu einem zweiten Kanal durchgelassen wird. LP-Filter blockieren kürzere Wellenlängen als die angegebene Wellenlänge und lassen die längeren Wellenlängen durch.
   3. Um in 3D zu fotografieren, stellen Sie den Konfokal auf Z-Stapel ein und scannen Sie mindestens 20 Bilder.

3. Exposition der Zellen gegenüber UV-Strahlung

1. Die Zellen werden mit 5 × 10⁴/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 3 h inkubiert. Nach der Inkubationszeit ist das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 μl zu reduzieren. Als nächstes werden die Zellen in einem 37 °C-Inkubator in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UV-Strahlung ausgesetzt (sowohl UVA bei 6,48 W/m2 als auch UVB bei 1,82 W/^m2, da sowohl UVA- als auch UVB-Röhren gleichzeitig im Inkubator eingeschaltet sind).
2. Nach der UV-Bestrahlung werden 200 μl frisches HOEM in jede Vertiefung gegeben und 20 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.
3. Nach der Inkubation wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt. Bei -80 °C einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung der folgenden vier Zytokine: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.
4. Fügen Sie den Zellen in den Vertiefungen ein metabolisches Assay-Reagenz hinzu.
5. Bereiten Sie ein 10%iges metabolisches Assay-Reagenz in DMEM/F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 ml der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 4 h.
6. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.

4. Exposition der Zellen gegenüber chemischen Toxinen

1. Die Keimzellen werden mit 5 × 10⁴/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO₂ 3 h lang inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, H2_O2 0,01 % und SDS 0,0025 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) aus.
2. Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Toxine aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 ml PBS und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation wird ein metabolischer Assay durchgeführt, indem das Medium durch 1 ml einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzt und 4 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert wird. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Multiwell-Plattenlesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.
3. Die Zellüberstände werden nach der 20-stündigen Inkubation aus den Vertiefungen in separate sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt und bei -80 °C eingefroren. Quantifizierung der Zytokine, die von den pHCECs und iHCECs nach Exposition gegenüber den Chemikalien freigesetzt werden. Verwenden Sie die gleiche Multiplex-Plattform, die auch zur Beurteilung der Zytokine der UV-behandelten Zellen verwendet wird. Verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay gemäß den Anweisungen des Kits, um die folgenden vier Zytokine zu quantifizieren: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.

5. Untersuchung von Zellen, die verschiedenen Konzentrationen von BAK ausgesetzt waren

1. Die Keimzellen werden mit 1 × 10 5/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit⁵ % CO₂ für 24 h inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, BAK 0,005 % und BAK 0,01 % in PBS) aus.
2. Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Toxine, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 ml PBS aus und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μL in 500 μL Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass die Intensitäten der Annexin-V-, Calcinein-AM- und Ethidium-1-Färbung bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 630/675 nm, 495/515 nm bzw. 528/617 nm gemessen werden. Bildgebung der Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop

6. Datenanalyse

1. Führen Sie einen Normalitätstest und einen Test auf gleiche Varianzen durch, bevor Sie eine Varianzanalyse (ANOVA), eine Welch-ANOVA oder einen Kruskal-Wallis-Test durchführen. Verwenden Sie den entsprechenden Post-hoc-Test , um jede getestete Gruppe zu vergleichen. Legen Sie p < 0,05 fest.

Ergebnisse

Zellengröße
Die primären und immortalisierten HCECs wurden mit drei Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert, die drei verschiedene Stadien der Zellviabilität widerspiegeln. Lebende Zellen sind grün (Calcein-AM), tote Zellen rot (Ethidium-Homodimer-1) und apoptotische Zellen gelb (Annexin-V-Computer-angepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals). Lebende Zellen enthalten Esterasen im Zellzytoplasma und wandeln Calcein-AM in Calcein um. Tote Zellen haben Zellmembranen, die für Et...

Diskussion

Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min f...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036