初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定

要約

この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。

要約

この記事では、初代(pHCEC)および不死化(iHCEC)ヒト角膜上皮細胞培養における紫外線(UV)放射線および眼毒素の毒性を測定する方法について説明します。細胞は、紫外線および毒性用量の塩化ベンザルコニウム(BAK)、過酸化水素(H 2 O₂)、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に曝露された。代謝活性は、代謝アッセイを用いて測定した。炎症性サイトカインの放出は、マルチプレックスインターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)アッセイを用いて測定し、蛍光色素を用いて細胞の生存率を評価した。

細胞代謝活性およびサイトカイン放出に対するUVの有害な影響は、iHCECのUV曝露の5分およびpHCECの20分で発生した。iHCECおよびpHCECの代謝活性の同様のパーセント低下は、BAK、_H2O2、またはSDSへの曝露後に発生し_、 サイトカイン放出の最も重要な変化はIL-6およびIL-8で発生した。蛍光染色されたiHCECおよびpHCEC BAKばく露細胞の顕微鏡検査では、0.005%BAKばく露で細胞死が示されましたが、エチジウム染色の程度はpHCECよりもiHCECの方が大きかったです。顕微鏡を使用して毒性効果を評価する複数の方法、代謝活性の評価、およびサイトカイン産生を利用して、初代細胞株と不死化細胞株の両方でUV放射と化学毒素の毒性を決定できました。

概要

in vitro毒物学研究は、細胞に損傷を与える可能性のある化学物質やその他の薬剤の毒性作用を予測するために行われます。角膜に対する毒性の評価において、ヒト角膜上皮細胞(HCEC)は、これらの効果を評価するためのモデルにおいて使用されている¹、^2、3、4。これらのモデルは通常、細胞の代謝活性の変化、細胞増殖、および炎症性サイトカインの産生および放出などの他の細胞機能などの生理学的効果を評価します。これらの毒物学研究では、HCEC^に対する化学物質とUV放射の有害な影響を評価するために、さまざまなソースからの細胞が選択されています^2,3。pHCEC株は、成人のドナー組織からこれらの細胞を提供する企業から入手可能です。初代細胞はディスパーゼで処理し、培養のために角膜を穏やかに掻き取ることができます⁵。次に、細胞はウイルスと汚染についてテストされ、10%ジメチルスルホキシドで凍結保存された状態で出荷されます。

初代細胞株の利点は、細胞がドナーの細胞と遺伝的に同一であることです。in vitro モデルは in vivo 組織を可能な限り模倣する必要があるため、これは理想的です。初代細胞株の欠点は、細胞分裂または継代の数が限られていることです⁶。利用可能な細胞数が限られているため、1回の初代培養で実施できる実験の数が制限され、実験のコストが増加します。

不死化細胞株は、細胞培養毒性モデルでも使用されています。しかし、in vivo組織から得られた初代細胞株とは異なり、不死化細胞株は遺伝的に改変されています。不死化細胞は、初代細胞のDNAにウイルスの遺伝子を組み込むことによって作成されます^6,7,8。ウイルス遺伝子の取り込みに成功した細胞が不死化細胞株に選択されます。不死化の利点は、無期限の急速な増殖を可能にし、同じ細胞株を使用して複数の実験を実行するための無制限の数の細胞を提供することです。これにより、実験間の一貫性が確保され、コストが削減されます。

細胞増殖を制限する遺伝子の変化に加えて、重要な機能の遺伝子の発現の変化も起こり得る⁹。したがって、不死化細胞を使用することの欠点は、それらが様々な外部刺激に対するそれらの応答に関して、もはや元の インビボ 細胞を表していない可能性があることである¹⁰。比較には、初代および不死化ヒト角膜角膜細胞¹¹、ならびに不死化HCECおよびウサギ角膜上皮初代細胞¹²に対する化学物質の毒性効果の観察が含まれていました。初代ヒト角化細胞と不死化角化細胞に対する毒素の影響の比較では、有意差は示されませんでした¹¹。この記事で詳述されている方法を使用して、これらのアッセイの有効性を評価する pHCECおよびiHCECに対する紫外線および眼毒素の毒性が決定されます。

インビトロアッセイで一般的に使用される3つの眼毒素、BAK、_H2O2、およびSDSが選択されました。BAKは点眼液13、14に一般的に使用されるカチオン性防腐剤であり、_H2O2はコンタクトレンズ¹⁵の消毒に一般的に使用され^、SDSは洗剤および^{シャンプー14}に見られるアニオン性界面活性剤である。眼の毒素と同様に、紫外線もHCECに重大な損傷を引き起こす可能性があります³。さらに、UVへの過度の曝露は、涙の症状、光過敏症、およびざらざら感を特徴とする光角膜炎として知られる眼の状態を引き起こす可能性があります¹⁶。

使用できる初代細胞培養物は無制限であり、開発されたさまざまな不死化細胞株があります。したがって、これらのタイプの細胞を組み込んだモデル間の類似点と相違点を決定するために、初代HCECを不死化HCEC株と比較するための調査が行われました。

この研究では、顕微鏡を使用して、UVおよび毒素に対する細胞の生理学的応答に関するpHCECとiHCECの違いの可能性を評価しました。2つの細胞株の細胞代謝活性と炎症性サイトカイン放出に対するUV放射と化学物質の影響も評価されました。2つの細胞株の違いを決定することの重要性は、1)細胞に対するUV放射の影響、2)細胞に対する毒素の影響、および3)将来の研究のために結果として生じる代謝、細胞生存率、および細胞サイトカイン放出の変化を評価するためのこれらの細胞株の最適な使用を理解することです。

プロトコル

1. pHCECおよびiHCECの培養

1. 6 mM L-グルタミン、0.002%細胞培地サプリメントO(材料表)、1.0 μMエピネフリン、0.4%細胞培地サプリメントP(材料表)、5 μg/mL rhインスリン、5 μg/mLアポトランスフェリン、および100 ng/mLヒドロコルチゾンヘミコハク酸塩をコラーゲン-1コーティング培養フラスコ(75 cm²培養フラスコに18 mL)で増殖させます。
2. 細胞が~80%のコンフルエントに成長した後に培地を除去して、2〜3日ごとにフラスコ内の培地を交換します。フェノールレッドを含まない解離溶液を加え、細胞が完全に剥離するまでフラスコを37°Cでインキュベートします。DMEM/F12で解離液を血清で中和し、細胞を500 × gで遠心分離します。上清培地を取り出し、細胞をHOEM培地に再懸濁します。

2. 共焦点顕微鏡による細胞サイズの決定

1. pHCECとiHCECの両方を、1 mLのHOUEMを含む1 × 10⁵ の濃度のガラス底カバーガラスでコラーゲンコーティングされたペトリ皿に播種します。pHCECおよびiHCECを、1セットの培養液を24時間、別の培養セットを48時間、5%_CO2を含む37°Cのインキュベーターで増殖させます。
2. インキュベーション期間の後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 細胞を染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、カルセイン-AMの場合は488/515 nm、エチジウムホモ二量体-1の場合は543/600 nm、アネキシンVの場合は633/665 nmの励起/発光波長をキャプチャするように顕微鏡を調整します。
3. 画像を取得し、Zスタックを取得して、3次元でセルサイズを評価します。
   1. 2次元(2D)および3次元(3D)画像を取得するには、アポクロマート40x/1.2水対物レンズで画像化する領域を見つけます。アルゴン(488)(最初のスキャン)、HeNe1(543)(2番目のスキャン)、およびHeNe2(633)(3番目のスキャン)レーザーでは、ビームスプリッター、HFT 488/543/633、NFT 635 Vis、およびNFT 545 LP560、LP505を使用して3つの別々のチャネルでスキャンします。
   2. マルチトラックシーケンシャルスキャンを使用して、クロストークを減らします。
      注:LP505は、カルセイン色素の発光をキャプチャするために、488レーザーを備えたチャネル2に使用されます。LP560は、エチジウムホモダイマー1の発光をキャプチャするために、543レーザーを備えたチャネル3で使用されます。NFT 635は、アネキシンVの発光をキャプチャするために633レーザーとともに使用されます。HFTの目的は、励起光と発光光を分離することです。NFTは、指定された波長<光を別のチャネルに反射させ、指定された波長>光を2番目のチャネルに通すことで光を分割します。LPフィルターは、指定された波長よりも短い波長を遮断し、長い波長を通過させます。
   3. 3Dで画像化するには、共焦点をZスタックに設定し、少なくとも20フレームをスキャンします。

3.紫外線への細胞の曝露

1. 細胞を24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×10⁴/mLのHEMOMで播種し、5%_CO2で37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、ウェル内の培地の容量を300 μLに減らします。次に、細胞をUV照射(UVAチューブとUVBチューブの両方がインキュベーター内で同時にオンになっているため、6.48 W / m 2のUVAと1.82 W / m²のUVB)に37°Cのインキュベーターで5分間と20分間別々の実験でさらします。
2. UV照射後、200 μLの新鮮なHEMOMを各ウェルに加え、5%_CO2を用いて37°Cで20時間インキュベートします。
3. インキュベーション後、各ウェルに細胞上清を集め、滅菌済みの2 mLポリプロピレンチューブに移します。-80°Cで凍結する。 UV曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインレベルを決定するには、マルチプレックスサイトカインアッセイを使用し、キットの指示に従って、IL-6、IL-8、IL-1β、およびTNF-αの4つのサイトカインを定量します。
4. 代謝アッセイ試薬をウェル内の細胞に追加します。
5. DMEM/F12で10%代謝アッセイ試薬を調製します。各ウェルの培養液を1 mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%_CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートします。
6. 蛍光プレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で各溶液の蛍光を測定します。

4.化学毒素への細胞の曝露

1. 24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×10⁴/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%_CO2を用いて37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間後、培地を取り出し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、H 2 O₂0.01%、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のSDS 0.0025%)に5〜15分間さらします。
2. 化学毒素にさらされた後、ウェルから毒素を取り除き、1 mLのPBSですすぎ、各ウェルに1 mLのHOUMを追加します。20時間のインキュベーション後、培地を1mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%_CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートすることにより、代謝アッセイを行う。蛍光マルチウェルプレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で蛍光を測定します。
3. 20時間のインキュベーション後のウェルから細胞上清を別々の滅菌2 mLポリプロピレンチューブに移し、-80°Cで凍結します。 化学物質への曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインを定量化します。UV処理された細胞からのサイトカインを評価するために使用したのと同じマルチプレックスプラットフォームを使用してください。キットの指示に従ってマルチプレックスサイトカインアッセイを使用して、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-αの4つのサイトカインを定量します。

5.さまざまな濃度のBAKに曝露された細胞の検査

1. 24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに1×10⁵/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%_CO2 を含む37°Cで24時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、培地を除去し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、BAK 0.005%、およびPBS中のBAK 0.01%)に5分間さらします。
2. 曝露後、化学毒素を除去し、1 mLのPBSでウェルをすすぎ、各ウェルに1 mLのHEMOを追加します。20時間のインキュベーション後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 顕微鏡を調整して、アネキシンV、カルセインAM、およびエチジウム-1染色の強度を、それぞれ630/675 nm、495/515 nm、および528/617 nmの励起/発光波長で測定します。蛍光顕微鏡を使用した細胞のイメージング

6.データ分析

1. 分散分析(ANOVA)、ウェルチ分散分析、またはクラスカル-ウォリス検定を実行する前に、正規性検定と等分散の検定を実行します。テストされた各グループを比較するために、適切な 事後 テストを使用します。p < 0.05 に設定します。

結果

セルサイズ
一次および不死化HCECは、細胞生存率の3つの異なる段階を反映する3つの蛍光色素で視覚化されました。生細胞は緑色(カルセイン-AM)、死細胞は赤色(エチジウムホモ二量体-1)、アポトーシス細胞は黄色(アネキシンV-蛍光シグナルをよりよく視覚化するためのコンピュータ調整色)です。生細胞は細胞質にエステラーゼを含み、カルセイン-AMをカルセインに変換します。...

ディスカッション

2種類のHCECの使用における潜在的な違いが評価された。細胞を同じ濃度の細胞で同じ培地(HOEM)に入れ、短期間および長期間の紫外線と3つの眼毒素に曝露しました。UV放射と化学物質の線量は、比較できる中間応答を生成するのに十分な損傷を細胞に及ぼす生理学的効果に基づいて選択されました。UV放射で5分と20分、選択した線量のBAK(0.001%)、SDS(0.0025%)、および_H2O2(0.01%)の5分と15分のば...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036