Desarrollo de una tira inmunocromatográfica de flujo lateral para la detección rápida y cuantitativa de compuestos de moléculas pequeñas

Resumen

Las tiras inmunocromatográficas de flujo lateral (CSI) basadas en membranas son herramientas útiles para el autodiagnóstico de bajo costo y se han aplicado de manera eficiente a la detección de toxinas, índices fisiológicos y biomarcadores clínicos. En este protocolo, proporcionamos una descripción detallada de los pasos para desarrollar un inmunoensayo de flujo lateral rápido, sensible y cuantitativo (utilizando AuNPs como marcador y mAbs como sonda). El procedimiento describe la preparación y caracterización del oro coloidal, la síntesis del conjugado AuNP-mAb, el ensamblaje de la tira inmunocromatográfica y la investigación metodológica del ensayo. Los resultados mostraron que las tiras finales se pueden utilizar aún más para el autodiagnóstico rápido y conveniente de una molécula pequeña, lo que puede proporcionar una herramienta alternativa en el análisis rápido y preciso de los índices fisiológicos y biológicos.

Introducción

Las tiras inmunocromatográficas de flujo lateral (CSI) basadas en membranas son herramientas útiles para la detección rápida y de bajo costo. La membrana de nitrocelulosa como portadora y el oro coloidal como marcadores de los reactivos de diagnóstico rápido de cromatografía inmune son el método POCT (prueba de punto de atención) más utilizado, y el alcance de la prueba del proyecto es más amplio. Desde su aplicación original en el monitoreo durante el embarazo, su uso se ha extendido para monitorear el estado de coagulación sanguínea^{1,2, lesión}miocárdica^3,medicina veterinaria^4,residuos de pesticidas^5,enfermedades infecciosas⁶ y concentraciones de medicamentos. Se pueden evaluar más tipos de muestras, incluyendo orina, saliva, sangre total, suero y otros fluidos corporales^7,8,9.

En los últimos años, se han desarrollado numerosos ensayos novedosos para detectar biomarcadores en el diagnóstico de trastornos, incluidos HPLC, UPLC, LC-MS y ELISA, que son sensibles y precisos, creíbles y específicos. Sin embargo, estos métodos requieren instrumentación sofisticada, preprocesamiento complejo y tratamientos que consumen mucho tiempo⁹. Por lo tanto, el desarrollo de una estrategia de diagnóstico en el punto de atención más rápida y conveniente para la detección automática y en tiempo real de compuestos activos medicinales es urgente^10,11.

La popularidad de los CSI, especialmente para pruebas comunes, está impulsada por su facilidad de uso, ya que no requieren profesionales ni configuraciones instrumentales elaboradas¹². En otras palabras, las personas que no tienen entrenamiento especial pueden operar tiras o autopruebas¹³. Los resultados de la prueba se pueden obtener en 5 minutos, lo que significa que se puede utilizar para inspecciones in situ¹⁴. Además, según nuestros cálculos, el costo de las tiras podría ser inferior a 1 RMB^15,lo que significa que las pruebas son baratas para promover^16. Por lo tanto, el ICS es un dispositivo desechable relativamente preciso, simple y económico. Los CSI basados en oro coloidal^17,18 también se aplican en la detección rápida de COVID-19.

El principio de ICS se puede dividir en ICS sándwich e ICS competitivo. La Figura 1A es un diagrama esquemático del CSI sándwich, que se utiliza principalmente para detectar sustancias macromoleculares como proteínas, incluidos marcadores tumorales, factores inflamatorios y gonadotropina coriónica humana (HCG, antígeno del embarazo temprano). En este método, se utilizan anticuerpos pareados dirigidos a diferentes epítopos del antígeno, y el anticuerpo de captura se seca en la membrana NC como una línea de prueba. El anticuerpo marcado se seca en la almohadilla conjugada, y el anticuerpo secundario se utiliza como línea de control.

La Figura 1B es un diagrama esquemático de ICS competitivo, que se utiliza principalmente para detectar sustancias de moléculas pequeñas (MWCO < 2000 Da). El antígeno de recubrimiento se fija en la membrana NC como una línea de prueba, y el anticuerpo marcado se seca en la almohadilla conjugada. Durante la detección, la muestra y el anticuerpo marcado fluyen a través de la línea de detección bajo acción capilar, y el antígeno recubierto se une competitivamente al antígeno libre en la muestra y desarrolla un color rojo en la línea de detección.

Recientemente, describimos el procedimiento de generación de anticuerpos monoclonales contra productos^{naturales 19}. En este trabajo, desarrollamos un nuevo inmunoensayo de flujo lateral basado en el anti-SSD mA²⁰ preparado para una detección rápida in situ. Los resultados indican que el ensayo de inmunocromatografía es una herramienta indispensable y conveniente para detectar compuestos derivados de productos naturales.

Figura 1 Diagrama esquemático del ensayo de inmunocromatografía (A) Tiras reactivas inmunocromatográficas sándwich. (B) Tiras reactivas cromatográficas inmunes competitivas indirectas. Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.,2018²¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Revisión de Ética de la Universidad de Medicina China de Beijing (número de aprobación 2017BZYYL00120).

1. Preparación y caracterización del oro coloidal

NOTA: Para la síntesis de oro coloidal, como el oro coloidal se adsorbe fácilmente en la pared interna del recipiente y es propenso a la precipitación por impurezas, el recipiente para la síntesis y el almacenamiento de oro coloidal debe limpiarse a fondo y empaparse en ácido (40 ml de agua destilada, 360 ml de ácido sulfúrico concentrado, 20 g de dicromato de potasio) o someterse a un tratamiento de pasivación superficial. Se utilizó un método de reducción de ácido cítrico para sintetizar oro coloidal.

1. Encienda el agitador magnético y coloque el matraz (250 ml) en el mezclador.
2. Prepare una solución de ácido de cloruro de oro al 4% y una solución de citrato de sodio al 1%, respectivamente.
3. Agregue 120 ml de agua destilada a un matraz de fondo redondo y caliéntelo hasta que hierva en un agitador magnético termostático.
4. Siga hirviendo y agregue rápidamente 0.5 ml de ácido cloroáurico al 4% y 5 ml de citrato de sodio al 1%.
5. Observe el color de la solución. La solución de ácido cloroáurico de color amarillo pálido se vuelve roja para el vino en unos pocos minutos.
6. Continúe calentando durante 10 minutos, hasta que la solución cambie de incoloro a rojo vino transparente.
7. Apague la alimentación del mezclador magnético termostático, enfríe a temperatura ambiente y mueva la mezcla a una botella limpia. Guárdelo a 4 °C.
8. Determinar el tamaño y la morfología de los AuNPs mediante espectroscopia ultravioleta e imágenes TEM.
   NOTA: Se pueden obtener diferentes tamaños de partículas de oro coloide para diversas aplicaciones cambiando la proporción de citrato sódico y ácido cloroáurico.

2. Síntesis de AuNPs-mAb conjugado

NOTA: Dado que los anticuerpos se unen al oro coloidal por adsorción electrostática, las cargas en la superficie de las proteínas y el oro coloidal afectan directamente la intensidad de la unión; por lo tanto, el valor de pH tampón es un factor importante que afecta la estabilidad del conjugado de oro anticuerpo-coloidal. SSD y anti-SSD mAbs se utilizan como ejemplos en este protocolo.

1. Evaluación del pH de acoplamiento
   1. Añadir 100 μL de solución de NaCl (10% m/v) en ocho tubos.
   2. Ajuste las soluciones AuNP a pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 con 0,1 M K₂CO₃.
   3. Añadir 100 μL de solución de oro coloidal (pH ajustado 5-12) a ocho tubos que contengan NaCl.
   4. Deje que las soluciones se mantengan durante varios minutos después de la mezcla. Observe el cambio de color de cada solución de tubo y registre el tubo que permanece rojo.
   5. Elija el valor de pH con la menor adición de K₂CO₃ y el color de la solución estable como el valor de pH óptimo para preparar conjugados AuNP-mAb.
      NOTA: No utilice un medidor de pH porque la sonda puede ser destruida por AuNPs.
2. Evaluación de la cantidad de anticuerpos
   1. Añadir 100 μL de solución de NaCl (10% m/v) a ocho tubos.
   2. Añadir 100 μL de solución de oro coloidal con pH óptimo a cada tubo.
   3. Añadir las soluciones de anticuerpos monoclonales (concentración de proteínas 0,1 mg/mL-3,2 mg/mL) a los ocho tubos antes mencionados.
   4. Deje que las soluciones se mantengan durante varios minutos después de la mezcla. Observe el cambio de color de cada solución de tubo y registre el tubo que permanece rojo.
   5. Elija la cantidad de anticuerpos con la concentración más baja de mAb y el color de la solución estable como la cantidad óptima de mAb para preparar conjugados AuNP-mAb.
3. Prepare el búfer de resuspensión: agregue 1 M Tris-HCl (pH 8.8), 1% (p/v) BSA, 0.5% (v/v) Tween 20 y 1% (v/v) PEG 20000 y mezcle bien.
4. Síntesis del conjugado AuNP-mAb
   1. Tome 10 ml de solución de oro coloidal y use 0.1 M K₂CO₃ para ajustar la solución al valor óptimo de pH.
   2. Agregue lentamente los mAbs de SSD a concentraciones apropiadas y agite a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Centrifugar la mezcla a 83 x g (1.000 rpm) durante 10 min a 4 °C. Retire el precipitado, que contiene impurezas u oro coloidal precipitado.
   4. Centrifugar la mezcla a 8.330 x g (10.000 rpm) durante 30 min a 4 °C. Descarte el sobrenadante, y el precipitado es el conjugado coloidal oro-mAb.
   5. Agregue el tampón de resuspensión para disociar la precipitación.

3. Montaje de la Franja

NOTA: Para los inmunoensayos de flujo posteriores, la selección y el pretratamiento del material de membrana afectarán directamente a la prueba, que debe investigarse. La tira inmunocromatográfica consiste en una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, una membrana de nitrocelulosa (NC), una almohadilla absorbente y una placa de PVC (Figura 1). El material de la membrana debe ser revisado y evaluado por estereomicroscopía para eliminar la inhomogeneidad.

1. Pegue la membrana NC en una placa de PVC a 2 cm de distancia del borde del extremo de succión de la placa.
2. Agregue SSD-BSA (2 mg/mL) gota a gota a la membrana NC (2 cm de distancia del borde superior) como línea de prueba (1 mm de ancho), y agregue IgG anti-ratón de cabra (1,5 mg/ ml) en forma de gota en la membrana NC (2 cm aparte del borde inferior) como línea de control (1 mm de ancho). Controle la cantidad de proteína añadida.
3. Conecte la almohadilla absorbente a la lámina de PVC sobre la membrana NC y superponga con la membrana NC en 2 mm.
4. Sumergir la membrana de fibra de vidrio en la solución conjugada AuNPs-mAb. Seque la membrana húmeda en una incubadora a 37 °C.
5. Recorte la membrana de fibra de vidrio a 5 cm de largo y 2 cm de ancho y úselo como una almohadilla conjugada.
6. Pegue la almohadilla conjugada pretratada debajo de la membrana NC. La longitud de superposición con la membrana NC debe ser de 0,1 cm.
   NOTA: La membrana de fibra de vidrio tiene una fuerte capacidad para unirse y liberar proteínas.
7. Recorte la membrana fusion 3 a 1,8 cm de largo y 3,5 cm de ancho y úselo como almohadilla de muestra.
8. Pegue la almohadilla de muestra en la placa de PVC y superponga con la almohadilla conjugada en 2 mm.
9. Corte el cartón ensamblado en tiras de 3,5 mm de ancho con una máquina de corte y compactarlo utilizando un sistema de laminación por lotes.
10. Finalmente, coloque las tiras reactivas en la carcasa, séllelas en una bolsa de papel de aluminio que contenga desecante y guárdelo lejos de la luz. Los ICS ya están ensamblados.
    NOTA: Lo anterior es el procedimiento de laboratorio. En la producción, los equipos de pulverización de oro y los instrumentos de membrana cruzada se utilizan para rociar oro y hacer las líneas T y C.

4. Detección cuantitativa

1. Deje caer 50 μL de solución de muestra sobre el orificio de muestra para observar el proceso de cromatografía.
   NOTA: Como resultado de la acción capilar impulsada por la almohadilla absorbente, la solución de muestra migra al otro extremo de la tira. Cuando la solución de muestra llega a la almohadilla conjugada, el SSD (antígeno) en la muestra reacciona con el AuNPs-mAb precargado en la almohadilla. Cuando la solución migra y alcanza la línea T, el AuNPs-mAb sin SSD puede ser capturado selectivamente por SSD-BSA (antígeno-portador de proteína conjugada), mostrándose como un color rojo en la línea T. Luego, la solución migra a la línea C, donde los AuNPs-mAb son capturados por igG anti-ratón de cabra en la región, mostrándose así como un color rojo en la línea C.
2. Analice las tiras con un lector de tiras portátil. La máquina puede proporcionar la relación entre la línea de prueba y la línea de control (T/C).
3. Evaluar la especificidad, sensibilidad, repetibilidad y estabilidad de la prueba ICS.
   NOTA: En la detección cualitativa, una línea roja indica un resultado positivo (línea de control). Dos líneas rojas indican un resultado negativo (líneas de prueba y control). Si la línea de control no está presente, la prueba se considera inválida.

Resultados

Caracterización del oro coloidal
Las soluciones de oro coloidal preparadas eran de color rojo clarete. Se utilizaron análisis TEM para determinar la morfología y la forma de los AuNPs(Figura 2A-D). La Figura 2A y la Figura 2B revelan que las partículas tienen forma poliédrica y están distribuidas uniformemente. Se encontró que el diámetro promedio de AuNPs era de aproximadamente 14 nm

Discusión

En este trabajo, presentamos un protocolo para la preparación de mAbs contra moléculas pequeñas derivadas de productos naturales. Se han esbozado los pasos esenciales y los asuntos que necesitan atención en el procedimiento, y hemos demostrado la utilidad de este protocolo utilizando la molécula pequeña SSD como ejemplo. Los espectros de ejemplo, las imágenes TEM, los resultados cuantitativos y las investigaciones metodológicas se muestran en datos representativos. Por lo tanto, hemos demostrado que la producció...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroauric acid solution (HAuCl4)	Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory	JY-SJ102
bovine serum albumin	AMRESCO	332
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
Filter paper	Sinopharm	H5072
Glass fibre membranes	Jieyi	XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
Nitrocellulose membranes	Millipore	millipore 180
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
Pipette 10mL	COSTAR	4488
Pipette 25mL	FALCON	357525
semi-rigid PVC sheets	Jieyi	JY-C104
Sodium citrate	Beijing Chemical Works	C1034
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5