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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour l’autodiagnostic à faible coût et ont été appliquées efficacement à la détection des toxines, de l’indice physiologique et des biomarqueurs cliniques. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée des étapes de développement d’un immunodosage rapide, sensible et quantitatif à flux latéral (en utilisant les AuNPs comme marqueur et les mAbs comme sonde). La procédure décrit la préparation et la caractérisation de l’or colloïdal, la synthèse du conjugué AuNP-mAb, l’assemblage de la bande immunochromatographique et l’étude méthodologique du test. Les résultats ont montré que les bandelettes finales peuvent être utilisées pour l’autodiagnostic rapide et pratique d’une petite molécule, ce qui peut fournir un outil alternatif dans l’analyse rapide et précise des indices physiologiques et biologiques.
Les bandelettes immunochromatographiques à flux latéral (CSI) à base de membrane sont des outils utiles pour une détection rapide et à faible coût. La membrane de nitrocellulose en tant que support et l’or colloïdal en tant que marqueurs des réactifs de diagnostic rapide par chromatographie immunitaire sont la méthode POCT (point of care testing) la plus couramment utilisée, et la portée des tests du projet est plus large. Depuis leur application initiale dans la surveillance pendant la grossesse, leur utilisation a été étendue pour surveiller l’état de coagulation sanguine1,2, les lésions myocardiques3, la médecine vétérinaire4, les résidus de pesticides5, les maladies infectieuses6 et les concentrations de médicaments. D’autres types d’échantillons peuvent être évalués, y compris l’urine, la salive, le sang total, le sérum et d’autres fluides corporels7,8,9.
Au cours des dernières années, de nombreux nouveaux tests ont été développés pour détecter les biomarqueurs dans le diagnostic des troubles, y compris HPLC, UPLC, LC-MS et ELISA, qui sont sensibles et précis, crédibles et spécifiques. Cependant, ces méthodes nécessitent une instrumentation sophistiquée, un prétraitement complexe et des traitements chronophages9. Par conséquent, le développement d’une stratégie de diagnostic au point de service plus rapide et plus pratique pour la détection en temps réel et en temps réel des composés actifs médicinaux est urgent10,11.
La popularité des ICS, en particulier pour les tests courants, est motivée par leur facilité d’utilisation, car ils ne nécessitent pas de professionnels ou de configurations instrumentales élaborées12. En d’autres termes, les personnes qui n’ont pas de formation spéciale peuvent utiliser des bandelettes ou des auto-tests13. Les résultats du test peuvent être obtenus en 5 minutes, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour des inspections de site14. De plus, selon nos calculs, le coût des bandes pourrait être inférieur à 1 RMB15, ce qui signifie que les tests sont peu coûteux pour promouvoir16. Par conséquent, l’ICS est un appareil jetable relativement précis, simple et peu coûteux. Les ICS basés sur l’or colloïdal17,18 sont également appliqués dans la détection rapide de la COVID-19.
Le principe de l’ICS peut être divisé en ICS sandwich et ICS compétitif. La figure 1A est un diagramme schématique du SCI sandwich, qui est principalement utilisé pour détecter les substances macromoléculaires telles que les protéines, y compris les marqueurs tumoraux, les facteurs inflammatoires et la gonadotrophine chorionique humaine (HCG, antigène de grossesse précoce). Dans cette méthode, des anticorps appariés ciblant différents épitopes de l’antigène sont utilisés, et l’anticorps de capture est séché sur la membrane NC comme ligne de test. L’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué et l’anticorps secondaire est utilisé comme ligne de contrôle.
La figure 1B est un diagramme schématique des SCI concurrents, qui est principalement utilisé pour détecter les substances à petites molécules (MWCO < 2000 Da). L’antigène de revêtement est fixé sur la membrane NC comme ligne de test, et l’anticorps marqué est séché sur le tampon conjugué. Au cours de la détection, l’échantillon et l’anticorps marqué circulent à travers la ligne de détection sous action capillaire, et l’antigène enrobé se lie de manière compétitive à l’antigène libre dans l’échantillon et développe une couleur rouge sur la ligne de détection.
Récemment, nous avons décrit la procédure de génération d’anticorps monoclonaux contre des produits naturels19. Dans ce travail, nous avons développé un nouveau test immunologique à flux latéral basé sur l’anti-SSD mA20 préparé pour une détection rapide sur site. Les résultats indiquent que le test d’immunochromatographie est un outil indispensable et pratique pour détecter les composés naturels dérivés de produits.
Figure 1 Schéma du test d’immunochromatographie (A) Bandelettes de test immunochromatographiques sandwich. (B) Bandelettes de test immuno chromatographiques compétitives indirectes. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.,201821. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Toutes les procédures effectuées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de médecine chinoise de Beijing (numéro d’approbation 2017BZYYL00120).
1. Préparation et caractérisation de l’or colloïdal
REMARQUE: Pour la synthèse de l’or colloïdal, comme l’or colloïdal est facilement adsorbé sur la paroi interne du récipient et est sujet à la précipitation par les impuretés, le récipient pour la synthèse et le stockage de l’or colloïdal doit être soigneusement nettoyé et trempé dans de l’acide (40 mL d’eau distillée, 360 mL d’acide sulfurique concentré, 20 g de dichromate de potassium) ou soumis à un traitement de passivation de surface. Une méthode de réduction de l’acide citrique a été utilisée pour synthétiser l’or colloïdal.
2. Synthèse du conjugué AuNPs-mAb
REMARQUE: Étant donné que les anticorps se lient à l’or colloïdal par adsorption électrostatique, les charges à la surface des protéines et de l’or colloïdal affectent directement l’intensité de liaison; par conséquent, la valeur du pH tampon est un facteur important affectant la stabilité du conjugué anticorps-or colloïdal. Les mAbs SSD et anti-SSD sont utilisés comme exemples dans ce protocole.
3. Assemblage de la bande
REMARQUE: Pour les immunoessais à flux ultérieur, la sélection et le prétraitement du matériau membranaire affecteront directement le test, qui doit être étudié. La bande immunochromatographique se compose d’un tampon d’échantillon, d’un tampon conjugué, d’une membrane de nitrocellulose (NC), d’un tampon absorbant et d’un panneau de PVC(Figure 1). Le matériau de la membrane doit être vérifié et évalué par stéréomicroscopie pour éliminer l’inhomogénéité.
4. Détection quantitative
Caractérisation de l’or colloïdal
Les solutions d’or colloïdal préparées étaient rouge clair. Des analyses TEM ont été utilisées pour déterminer la morphologie et la forme des AuNPs (Figure 2A-D). Les figures 2A et 2B révèlent que les particules sont de forme polyédrique et uniformément réparties. Le diamètre moyen des AuNPs s’est avéré être d’environ 14 nm
Dans ce travail, nous présentons un protocole pour la préparation de mAbs contre de petites molécules dérivées de produits naturels. Les étapes essentielles et les questions nécessitant une attention particulière dans la procédure ont été décrites, et nous avons démontré l’utilité de ce protocole en utilisant le SSD à petite molécule comme exemple. Des exemples de spectres, d’images TEM, de résultats quantitatifs et d’investigations méthodologiques sont présentés dans des données représentati...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par les Fonds spéciaux pour la recherche fondamentale des établissements d’enseignement supérieur affiliés aux départements centraux. Nous apprécions le soutien de l’équipe de recherche fondamentale sur la prescription classique de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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