소분자 화합물의 신속하고 정량적 검출을 위한 측면 흐름 면역크로모그래피 스트립 개발

초록

멤브레인 기반 측면 흐름 면역 크로마토그래피 스트립(ICSs)은 저비용 자가 진단을 위한 유용한 도구이며 독소, 생리지수 및 임상 바이오마커 검출에 효율적으로 적용되어 왔다. 이 프로토콜에서, 우리는 신속하고 민감하고 정량적인 측면 흐름 면역 분석술 (AuNP를 마커로 사용하여 프로브로)를 개발하는 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 절차는 콜로이드 금의 준비 및 특성화, AuNP-mAb 공수의 합성, 면역 크로마토그래피 스트립의 조립 및 분석의 방법론적 조사를 설명합니다. 결과는 최종 스트립이 생리학적 및 생물학적 지수의 신속하고 정확한 분석에 대체 도구를 제공 할 수있는 작은 분자의 신속하고 편리한 자가 진단을 위해 더 활용 될 수 있음을 보여 주었다.

서문

멤브레인 기반 측면 흐름 면역 크로마토그래피 스트립(ICSs)은 저비용 및 신속한 검출을 위한 유용한 도구입니다. 면역 크로마토그래피 의 마커로서 캐리어 및 콜로이드 골드로서 니트로셀룰로오스 멤브레인은 가장 일반적으로 사용되는 POCT(치료 시점 테스트) 방법이며, 프로젝트의 테스트 범위가 더 넓다. 임신 중 모니터링에 대한 본래의 적용에서, 그들의 사용은 혈액 응고 상태^1,2,심근 상해^3,수의학^4,농약 잔류물^5,전염병⁶ 및 약물 농도를 모니터링하기 위해 확장되었습니다. 더 많은 유형의 샘플을 소변, 타액, 전혈, 혈청 및 기타 체액^7,8,9를포함하여 더 많은 유형의 샘플을 평가할 수 있다.

최근 몇 년 동안, HPLC, UPLC, LC-MS 및 ELISA를 포함하여 장애의 진단에 있는 바이오마커를 검출하기 위한 수많은 새로운 분석이 개발되었습니다, 이는 민감하고 정확하고, 믿을 수 있고 특정합니다. 그러나 이러한 방법은 정교한 계측, 복잡한 전처리 및 시간이 많이 소요되는 처리^9가필요합니다. 따라서 약용 활성 화합물의 자체 및 실시간 검출을 위한 보다 신속하고 편리한 치료 시점 진단 전략을 개발하는 것이^10,11로긴급하다.

ICS의 인기, 특히 일반적인 테스트에 대 한, 그들의 사용의 용이성에 의해 구동 된다, 그들은 전문가 또는 정교한 악기 설정 필요 하지 않기 때문에^12. 즉, 특별한 훈련을 받지 않은 사람은 스트립이나 자체^{테스트(13)를}조작할 수 있습니다. 시험 결과는 5분 안에 얻어질 수 있으며, 이는 현장^{검사(14)에}사용될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 우리의 계산에 따르면, 스트립의 비용은 1RMB 보다 낮을 수 있습니다^15,이는 테스트가 홍보 저렴 의미^16. 따라서 ICS는 비교적 정확하고 간단하며 저렴한 일회용 장치입니다. 콜로이드^골드(17)및^18을 기반으로 한 ICS도 빠른 COVID-19 검출에 적용된다.

ICS의 원리는 샌드위치 ICS 및 경쟁 ICS로 나눌 수 있습니다. 도 1A는 주로 종양 마커, 염증인자 및 인간 융골 생식선 호르몬(HCG, 초기 임신 항원)을 포함한 단백질과 같은 거대 분자 물질을 검출하는 데 사용되는 샌드위치 ICS의 회로도다. 이 방법에서, 항원의 상이한 에피토프를 표적으로 한 쌍항체가 사용되고, 포획 항체는 시험선으로서 NC 멤브레인상에서 건조된다. 표지된 항체는 컨쥬게이트 패드에서 건조되고, 이차 항체는 대조군선으로서 사용된다.

도 1B는 주로 소분자 물질(MWCO < 2000 Da)을 검출하는 데 사용되는 경쟁ICS의 회로도다. 코팅 항원은 NC 멤브레인에 시험선으로 고정되고, 표지된 항체는 컨쥬게이트 패드에서 건조된다. 검출 하는 동안, 샘플 및 표지 된 항체 는 모세관 작용 하에서 검출 라인을 통해 흐르고, 코팅 된 항원경쟁적으로 샘플에서 무료 항원결합 및 검출 라인에 적색을 개발한다.

최근에는^{천연물(19)에}대한 단일클론 항체 생성 의 절차를 설명했다. 이 작품에서는 신속한 현장 검출을 위해 준비된 항SSD mA^20을 기반으로 한 새로운 측면 흐름 면역 분석제를 개발했습니다. 결과는 면역 크로마토그래피 분석이 천연 제품 유래 화합물을 검출하기 위한 필수불가결하고 편리한 도구임을 나타냅니다.

도 1 면역크로마토그래피 분석의 회로도 도면 (A)샌드위치 면역 크로마토그래피 테스트 스트립. (B)간접 경쟁 면역 크로마토그래피 테스트 스트립. 이 수치는 2018 년²¹에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

이 연구에서 수행 된 모든 절차는 중국 의학의 베이징 대학의 윤리 검토위원회에 의해 승인되었다 (승인 번호 2017BZYYL00120).

1. 콜로이드 골드의 준비 및 특성화

참고: 콜로이드 금 합성의 경우, 콜로이드 금이 용기의 내벽에 쉽게 흡착되어 불순물에 의해 침전되기 쉽기 때문에, 콜로이드 금의 합성 및 저장을 위한 용기는 산(증류수 40mL, 농축 황산 360mL, 농축 황산 360mL, 농축 황산 20g)에 철저히 세척되어야 합니다. 구연산 환감 방법을 사용하여 콜로이드 골드를 합성하였다.

1. 마그네틱 교반기를 켜고 플라스크(250mL)를 믹서에 놓습니다.
2. 각각 4% 금 염화산 용액과 1% 구연산 용액을 준비합니다.
3. 120mL의 증류수를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 가열하여 온도성 자기 교반기에서 끓입니다.
4. 끓는 것을 유지하고 빠르게 0.5 mL의 4 % 클로로우릭 산과 5 mL의 1 % 구연산 나트륨을 추가하십시오.
5. 용액의 색상을 관찰합니다. 옅은 노란색 클로로우릭 산 용액은 몇 분 안에 와인을 붉게 합니다.
6. 용액이 무색에서 투명 와인 레드로 바뀌기 전까지 10 분 동안 계속 가열하십시오.
7. 온도 조절 성 자기 믹서의 힘을 끄고 실온으로 냉각하고 혼합물을 깨끗한 병으로 옮습니다. 4 °C에 보관하십시오.
8. 자외선 분광및 TEM 이미징에 의하여 AuNPs의 크기와 형태를 결정합니다.
   참고: 다양한 용도에 대한 콜로이드 금 입자의 크기는 구연산 나트륨 및 클로로우릭산의 비율을 변경하여 얻을 수 있습니다.

2. AuNPs-mAb 컨쥬게이트 합성

참고: 항체가 정전기 흡착에 의해 콜로이드 금에 결합하기 때문에 단백질 표면과 콜로이드 금의 전하가 결합 강도에 직접적인 영향을 미칩니다. 따라서, 완충pH 값은 항체-콜로이드 골드 컨쥬게이트의 안정성에 영향을 미치는 중요한 인자이다. SSD 및 안티 SSD mAbs는 이 프로토콜의 예로 사용됩니다.

1. 커플링 pH 평가
   1. NaCl 용액 100μL(10% m/v)를 8개의 튜브에 추가합니다.
   2. 0.1 M K₂CO_3로pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12에서 AuNP 솔루션을 조정합니다.
   3. 100 μL의 콜로이드 골드 용액(pH 조정 5-12)을 NaCl을 포함하는 8개의 튜브에 추가합니다.
   4. 블렌딩 후 몇 분 동안 용액을 견딜 수 있습니다. 각 튜브 용액의 색상 변화를 관찰하고 빨간색으로 남아있는 튜브를 기록합니다.
   5. AuNP-mAb 컨쥬게이트를 준비하기 위한 최적의 pH 값으로_K2CO₃ 및 안정적인 솔루션 색상을 가장 적게 첨가하여 pH 값을 선택합니다.
      참고: 프로브가 AuNP에 의해 파괴될 수 있으므로 pH 미터를 사용하지 마십시오.
2. 항체 양 평가
   1. NaCl 용액 100μL(10% m/v)를 8개의 튜브에 추가합니다.
   2. 각 튜브에 최적의 pH가 있는 콜로이드 골드 용액 100 μL을 추가합니다.
   3. 상기 8개의 튜브에 단클론 항체 용액(단백질 농도 0.1 mg/mL-3.2 mg/mL)을 추가한다.
   4. 블렌딩 후 몇 분 동안 용액을 견딜 수 있습니다. 각 튜브 용액의 색상 변화를 관찰하고 빨간색으로 남아있는 튜브를 기록합니다.
   5. AuNP-mAb 컨쥬게이트를 준비하기 위한 최적의 mAb 양으로서 mAb의 가장 낮은 농도와 안정적인 용액 색으로 항체 양을 선택한다.
3. 재서스펜션 버퍼 준비: M Tris-HCl(pH 8.8), 1% (w/v) BSA, 0.5% (v/v) 트위엔 20 및 1% (v/v) PEG 20000을 추가하고 잘 혼합합니다.
4. AuNP-mAb 공주물의 합성
   1. 콜로이드 골드 용액 10mL를 복용하고 0.1 M K₂CO_3을 사용하여 최적의 pH 값으로 용액을 조정하십시오.
   2. SSD mAbs를 적절한 농도로 천천히 추가하고 실온에서 30 분 동안 흔들어주세요.
   3. 4°C에서 10분 동안 83 x g(1,000 rpm)에서 혼합물을 원심분리합니다. 불순물 또는 침전 된 콜로이드 금을 포함하는 침전물을 제거하십시오.
   4. 4°C에서 30분 동안 8,330 x g(10,000 rpm)에서 혼합물을 원심분리합니다. 상체를 버리고 침전은 콜로이드 골드-mAb 컨쥬게이트입니다.
   5. 강수량을 소화하기 위해 재서스펜션 버퍼를 추가합니다.

3. 스트립 의 집회

참고: 나중에 플로우 면역 분석의 경우 멤브레인 물질의 선택 및 전처리가 검사해야 하는 시험에 직접적인 영향을 미칩니다. 면역 크로마토그래피 스트립은 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인, 흡수패드 및 PVC보드(도 1)로구성된다. 멤브레인 물질은 불균일성을 제거하기 위해 스테레오 현미경 검사법에 의해 검사되고 평가되어야합니다.

1. NC 멤브레인을 PVC 보드에 2cm 떨어져 보드의 흡입 끝의 가장자리에서 붙여 넣습니다.
2. SSD-BSA(2 mg/mL)를 테스트 라인(1mm 너비)으로 NC 멤브레인(2cm 떨어져)에 드롭와이즈를 추가하고, NC 멤브레인(1.5 mg/mL)에 드롭와이즈를 제어 라인(1mm 폭)으로 추가합니다. 추가된 단백질의 양을 제어합니다.
3. 흡수 패드를 NC 멤브레인 위의 PVC 시트에 부착하고 NC 멤브레인과 2mm 겹칩니다.
4. 유리 섬유 멤브레인을 AuNPs-mAb 컨쥬게이트 용액에 잠급합니다. 37°C에서 인큐베이터에서 젖은 멤브레인을 건조시킵니다.
5. 유리 섬유 멤브레인을 길이 5cm, 너비 2cm로 다듬어 컨쥬게이트 패드로 사용하십시오.
6. 전처리된 컨쥬게이트 패드를 NC 멤브레인 아래에 붙여 넣습니다. NC 멤브레인과 겹치는 길이는 0.1cm여야 합니다.
   참고: 유리 섬유막은 단백질을 결합하고 방출하는 강력한 능력을 가지고 있습니다.
7. 퓨전 3 멤브레인을 길이 1.8cm, 너비 3.5cm로 다듬어 시료 패드로 사용하십시오.
8. 샘플 패드를 PVC 보드에 붙여 넣은 다음 컨쥬게이트 패드와 2mm 겹칩니다.
9. 조립된 종이 보드를 절단기를 사용하여 3.5mm 너비의 스트립으로 자르고 배치 라미네이션 시스템을 사용하여 압축합니다.
10. 마지막으로, 테스트 스트립을 쉘에 넣고 건조제가 들어있는 알루미늄 호일 가방에 밀봉하고 빛에서 멀리 보관하십시오. 이제 ICS가 조립됩니다.
    참고: 위의 실험실 절차입니다. 생산에서 금 살포 장비와 크로스 멤브레인 계측기는 금을 분사하고 T 와 C 라인을 만드는 데 사용됩니다.

4. 정량적 검출

1. 샘플 용액 50μL을 샘플 구멍에 떨어뜨려 크로마토그래피 공정을 관찰합니다.
   참고: 흡수 패드에 의해 구동되는 모세관 작용의 결과로, 샘플 용액은 스트립의 다른 쪽 끝으로 이동합니다. 샘플 용액이 컨쥬게이트 패드에 도달하면 샘플내의 SSD(항원)는 패드상에 미리 로드된 AuNPs-mAb와 반응한다. 용액이 이동하여 T라인에 도달하면 SSD가 없는 AuNPs-mAb는 SSD-BSA(항원-담체 단백질 컨쥬게이트)에 의해 선택적으로 포획되어 T-line상에 적색으로 나타난다. 그런 다음 솔루션이 C 선으로 마이그레이션되어 AuNPs-mAb가 이 지역의 염소 항 마우스 IgG에 의해 캡처되어 C 선에 빨간색으로 표시됩니다.
2. 휴대용 스트립 판독기로 스트립을 분석합니다. 이 기계는 테스트 라인의 비율을 제어 선(T/C)에 제공할 수 있습니다.
3. ICS 테스트의 특이성, 감도, 반복성 및 안정성을 평가합니다.
   참고: 정성적 감지하에 빨간색 줄 하나가 양수 결과(제어 선)를 나타냅니다. 두 개의 빨간색 선은 음의 결과(테스트 및 제어 선)를 나타냅니다. 제어 선이 없는 경우 테스트가 유효하지 않은 것으로 간주됩니다.

결과

콜로이드 골드의 특성화
준비된 콜로이드 골드 솔루션은 클라렛 레드였습니다. TEM 분석은 AuNPs(그림2A-D)의형태 와 모양을 결정하는 데 사용되었습니다. 도 2A 및 도 2B는 입자가 모양의 다각형이며 균일하게 분포되어 있음을 보여줍니다. AuNPs의 평균 직경은 약 14nm(도2C)인것으로 나?...

토론

이 작품에서, 우리는 천연 제품 유래 소분자에 대한 mAbs의 준비를위한 프로토콜을 제시한다. 절차에서 주의를 필요로하는 필수 단계와 문제가 설명되었으며, 우리는 작은 분자 SSD를 사용하여이 프로토콜의 유용성을 예로 제시했습니다. 예스펙트럼, TEM 이미지, 정량적 결과 및 방법론적 조사가 대표 데이터에 표시됩니다. 따라서, 우리는 콜로이드 금 생산, AuNP-mAb 컨쥬게이션 및 스트립 조립 전략이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroauric acid solution (HAuCl4)	Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory	JY-SJ102
bovine serum albumin	AMRESCO	332
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
Filter paper	Sinopharm	H5072
Glass fibre membranes	Jieyi	XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
Nitrocellulose membranes	Millipore	millipore 180
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
Pipette 10mL	COSTAR	4488
Pipette 25mL	FALCON	357525
semi-rigid PVC sheets	Jieyi	JY-C104
Sodium citrate	Beijing Chemical Works	C1034
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5