Разработка боковой проточной иммунохроматографической полосы для быстрого и количественного обнаружения маломолекулярных соединений

Аннотация

Мембранные иммунохроматографические полоски бокового потока (ICS) являются полезными инструментами для недорогой самодиагностики и эффективно применяются для обнаружения токсинов, физиологических индексов и клинических биомаркеров. В этом протоколе мы предоставляем подробное описание шагов по разработке быстрого, чувствительного и количественного бокового иммуноанализа (с использованием AuNPs в качестве маркера и mAbs в качестве зонда). Методика описывает получение и характеристику коллоидного золота, синтез конъюгата AuNP-mAb, сборку иммунохроматографической полосы, методологическое исследование анализа. Результаты показали, что конечные полоски могут быть дополнительно использованы для быстрой и удобной самодиагностики малой молекулы, что может обеспечить альтернативный инструмент в быстром и точном анализе физиологических и биологических показателей.

Введение

Мембранные иммунохроматографические полоски бокового потока (ICS) являются полезными инструментами для недорогого и быстрого обнаружения. Нитроцеллюлозная мембрана в качестве носителя и коллоидное золото в качестве маркеров иммунохроматографических быстродиагностических реагентов являются наиболее часто используемым методом POCT (point of care testing), и объем тестирования проекта шире. Из их первоначального применения в мониторинге во время беременности их применение было расширено для контроля состояния свертываемой крови^1,2,травмы миокарда^3,ветеринарии^4,остатков пестицидов^5,инфекционных заболеваний⁶ и концентраций препарата. Можно оценить больше типов образцов, включая мочу, слюну, цельную кровь, сыворотку и другие жидкости организма^7,8,9.

В последние годы были разработаны многочисленные новые анализы для выявления биомаркеров в диагностике расстройств, включая ВЭЖХ, UPLC, LC-MS и ELISA, которые являются чувствительными и точными, достоверными и специфическими. Однако эти методы требуют сложных инструментов, сложной предварительной обработки и трудоемких обработок^9. Следовательно, разработка более быстрой и удобной диагностической стратегии в месте оказания медицинской помощи для самостоятельного обнаружения лекарственных активных соединений в режиме реального времени является неотложной^10,11.

Популярность АСУ ТП, особенно для распространенных тестов, обусловлена их простотой использования, так как они не требуют профессионалов или сложных инструментальных установок^12. Другими словами, люди, не имеющие специальной подготовки, могут оперировать полосками или самотестами^13. Результаты теста могут быть получены за 5 минут, что означает, что его можно использовать для осмотра на месте^14. Более того, по нашим расчетам, стоимость полосок может быть ниже 1^{15 юаней,}а это значит, что тесты недорого продвигать^16. Следовательно, ICS является относительно точным, простым и недорогим одноразовым устройством. ICS на основе коллоидного золота^17,18 также применяются при быстром выявлении COVID-19.

Принцип ICS можно разделить на сэндвич ICS и конкурентный ICS. Рисунок 1А представляет собой принципиальную схему сэндвич-ICS, которая в основном используется для обнаружения макромолекулярных веществ, таких как белки, включая опухолевые маркеры, воспалительные факторы и хорионический гонадотропин человека (ХГЧ, антиген ранней беременности). В этом методе используют парные антитела, нацеленные на разные эпитопы антигена, а захватное антитело сушат на мембране NC в качестве тестовой линии. Меченое антитело сушат на конъюгированной прокладке, а в качестве контрольной линии используют вторичное антитело.

Рисунок 1B представляет собой принципиальную схему конкурирующих АСУ ТП, которая в основном используется для обнаружения маломолекулярных веществ (MWCO < 2000 Da). Антиген покрытия фиксируют на мембране NC в качестве тестовой линии, а меченое антитело сушат на конъюгированной прокладке. Во время обнаружения образец и меченое антитело протекают через линию обнаружения под капиллярным действием, а покрытый антиген конкурентно связывает свободный антиген в образце и развивает красный цвет на линии обнаружения.

Недавно мы описали процедуру генерации моноклональных антител против натуральных продуктов^19. В этой работе мы разработали новый анализ бокового потока на основе подготовленного анти-SSD mA²⁰ для быстрого обнаружения на месте. Результаты показывают, что иммунохроматографический анализ является незаменимым и удобным инструментом для обнаружения соединений, полученных из натурального продукта.

Рисунок 1 Принципиальная схема иммунохроматографического анализа (А)Сэндвич иммунохроматографические тест-полоски. (B) Косвенные конкурентные иммунные хроматографические тест-полоски. Эта цифра была изменена с Zhang et al.,2018²¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Все процедуры, выполненные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике Пекинского университета китайской медицины (номер одобрения 2017BZYYL00120).

1. Получение и характеристика коллоидного золота

ПРИМЕЧАНИЕ: Для коллоидного синтеза золота, поскольку коллоидное золото легко адсорбируется на внутренней стенке сосуда и подвержено осаждению примесями, сосуд для синтеза и хранения коллоидного золота следует тщательно очистить и замочить в кислоте (40 мл дистиллированной воды, 360 мл концентрированной серной кислоты, 20 г дихромата калия) или подвергнуть поверхностной пассивационной обработке. Метод восстановления лимонной кислоты был использован для синтеза коллоидного золота.

1. Включите магнитную мешалку и поместите колбу (250 мл) на смеситель.
2. Готовят 4% раствор хлорида золота и 1% раствор цитрата натрия соответственно.
3. Добавьте 120 мл дистиллированной воды в колбу с круглым дном и нагрейте ее до кипения на термостатической магнитной мешалке.
4. Держите кипение и быстро добавляйте 0,5 мл 4% хлорауровой кислоты и 5 мл 1% цитрата натрия.
5. Следите за цветом раствора. Бледно-желтый раствор хлораурисовой кислоты становится винно-красным в течение нескольких минут.
6. Продолжайте нагревать в течение 10 минут, пока раствор не изменится с бесцветного на прозрачный винно-красный.
7. Выключите питание термостатического магнитного смесителя, охладите до комнатной температуры и переместите смесь в чистую бутылку. Храните при 4 °C.
8. Определение размера и морфологии AuNPs с помощью ультрафиолетовой спектроскопии и визуализации ТЭМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные размеры частиц коллоидного золота для различных применений могут быть получены путем изменения пропорции цитрата натрия и хлораурисовой кислоты.

2. Синтез сопряженных AuNPs-mAb

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку антитела связываются с коллоидным золотом путем электростатической адсорбции, заряды на поверхности белков и коллоидного золота напрямую влияют на интенсивность связывания; поэтому значение буферного рН является важным фактором, влияющим на стабильность конъюгата антитело-коллоидное золото. SSD и anti-SSD mAbs используются в качестве примеров в этом протоколе.

1. Оценка pH связи
   1. Добавьте 100 мкл раствора NaCl (10% м/об) в восемь пробирок.
   2. Регулируйте растворы AuNP при рН 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 с 0,1_МК2СО3.
   3. Добавьте 100 мкл раствора коллоидного золота (рН с поправкой 5-12) в восемь пробирок, содержащих NaCl.
   4. Дайте растворам постоять в течение нескольких минут после смешивания. Наблюдайте за изменением цвета каждого раствора трубки и записывайте трубку, которая остается красной.
   5. Выберите значение pH с наименьшим добавлением_K2CO₃ и стабильным цветом раствора в качестве оптимального значения pH для получения конъюгатов AuNP-mAb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте рН-метр, так как зонд может быть разрушен AuNPs.
2. Оценка количества антител
   1. Добавьте 100 мкл раствора NaCl (10% м/об) в восемь пробирок.
   2. Добавьте 100 мкл раствора коллоидного золота с оптимальным рН в каждую пробирку.
   3. Добавьте растворы моноклональных антител (концентрация белка 0,1 мг/мл-3,2 мг/мл) в вышеупомянутые восемь пробирок.
   4. Дайте растворам постоять в течение нескольких минут после смешивания. Наблюдайте за изменением цвета каждого раствора трубки и записывайте трубку, которая остается красной.
   5. Выберите количество антител с наименьшей концентрацией mAb и стабильным цветом раствора в качестве оптимального количества mAb для получения конъюгатов AuNP-mAb.
3. Подготовьте буфер повторного суспензии: добавьте 1 M Tris-HCl (pH 8,8), 1% (мас./об.) BSA, 0,5% (v/v) Tween 20 и 1% (v/v) PEG 20000 и хорошо перемешайте.
4. Синтез сопряженного AuNP-mAb
   1. Возьмите 10 мл раствора коллоидного золота и используйте 0,1 M K₂CO_3, чтобы отрегулировать раствор до оптимального значения рН.
   2. Медленно добавляйте SSD mAbs в соответствующих концентрациях и встряхивайте при комнатной температуре в течение 30 мин.
   3. Центрифугировать смесь при 83 х г (1 000 об/мин) в течение 10 мин при 4 °C. Удалите осадок, который содержит примеси или осажденное коллоидное золото.
   4. Центрифугировать смесь при 8 330 х г (10 000 об/мин) в течение 30 мин при 4 °C. Отбросьте супернатант, и осадок будет коллоидным сопряжением золото-mAb.
   5. Добавьте буфер повторного суспендения, чтобы диссоциировать осадки.

3. Сборка полосы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих проточных иммуноанализов выбор и предварительная обработка мембранного материала будут непосредственно влиять на тест, который должен быть исследован. Иммунохроматографическая полоса состоит из пробоотборника, сопряженной прокладки, нитроцеллюлозной (NC) мембраны, абсорбирующей прокладки и плитыПВХ (рисунок 1). Материал мембраны должен быть проверен и оценен с помощью стереомикроскопии для устранения неоднородности.

1. Наклеить мембрану с ЧПУ на плиту ПВХ на 2 см друг от друга от края всасывающего конца доски.
2. Добавьте SSD-BSA (2 мг/мл) по каплям на мембрану NC (на 2 см друг от друга от верхнего края) в качестве тестовой линии (шириной 1 мм) и добавьте козлиную антимышью IgG (1,5 мг/мл) по каплям на мембрану NC (2 см от нижнего края) в качестве контрольной линии (шириной 1 мм). Контролируйте количество добавленного белка.
3. Прикрепите абсорбивную прокладку к листу ПВХ над мембраной NC и перекрывайте ее мембраной NC на 2 мм.
4. Погрузьте стекловолокнистую мембрану в сопряженный раствор AuNPs-mAb. Высушите влажную мембрану в инкубаторе при 37 °C.
5. Обрежьте стекловолокнистую мембрану до 5 см в длину и 2 см в ширину и используйте ее в качестве сопряженной прокладки.
6. Вставьте предварительно обработанный конъюгатный подушечек под мембрану NC. Длина перекрытия с мембраной NC должна составлять 0,1 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана из стекловолокна обладает сильной способностью связывать и высвобождать белки.
7. Обрежьте мембрану fusion 3 до 1,8 см в длину и 3,5 см в ширину и используйте ее в качестве образца.
8. Наклейте прокладку для образцов на плиту ПВХ и перекрывайте ее сопряженной прокладкой на 2 мм.
9. Нарежьте собранный картон на полосы шириной 3,5 мм с помощью режущего станка и уплотните его с помощью системы периодического ламинирования.
10. Наконец, поместите тест-полоски в оболочку, запечатайте их в пакет из алюминиевой фольги, содержащий адсорбцию, и храните их вдали от света. В настоящее время АСУ ТП собраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанная лабораторная процедура. В производстве оборудование для распыления золота и поперечные мембранные инструменты используются для распыления золота и изготовления линий T и C.

4. Количественное определение

1. Опустите 50 мкл раствора образца на отверстие для образца, чтобы наблюдать за процессом хроматографии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В результате капиллярного действия, приводимого абсорбирующей прокладкой, раствор образца мигрирует на другой конец полосы. Когда раствор образца достигает сопряженной прокладки, SSD (антиген) в образце реагирует с AuNPs-mAb, предварительно загруженным на площадку. Когда раствор мигрирует и достигает Т-линии, AuNPs-mAb без SSD может быть избирательно захвачен SSD-BSA (конъюгат белка-антиген-носитель), показываясь красным цветом на Т-линии. Затем решение мигрирует в линию C, где AuNPs-mAb захватываются козьим антимышиным IgG в области, тем самым показываясь красным цветом на линии C.
2. Анализируйте полоски с помощью портативного считывателя полос. Машина может обеспечить отношение испытательной линии к управляюще (T/C).
3. Оцените специфичность, чувствительность, повторяемость и стабильность теста ICS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При качественном обнаружении одна красная линия указывает на положительный результат (контрольная линия). Две красные линии указывают на отрицательный результат (тестовая и контрольная линии). Если управлящая линия отсутствует, тест считается недействительным.

Результаты

Характеристика коллоидного золота
Приготовленные коллоидные растворы золота были бордово-красного цвета. Анализы ТЕА использовались для определения морфологии и формы AuNPs(рисунок 2A-D). Фиг.2А и Фиг.2В показывают, что ч?...

Обсуждение

В этой работе мы представляем протокол получения mAbs против малых молекул, полученных из натурального продукта. Основные шаги и вопросы, требующие внимания в процедуре, были изложены, и мы продемонстрировали полезность этого протокола на примере SSD с малыми молекулами. Примеры спектров,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroauric acid solution (HAuCl4)	Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory	JY-SJ102
bovine serum albumin	AMRESCO	332
centrifuge tube 15 mL	Corning	430645
centrifuge tube 50 mL	Corning	430828
ELISA plates, 96 well	NUNC	655101
Filter paper	Sinopharm	H5072
Glass fibre membranes	Jieyi	XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody	applygen	C1308
Nitrocellulose membranes	Millipore	millipore 180
ovalbumin	Beijing BIODEE	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
Pipette 10mL	COSTAR	4488
Pipette 25mL	FALCON	357525
semi-rigid PVC sheets	Jieyi	JY-C104
Sodium citrate	Beijing Chemical Works	C1034
sodium periodate	Sinopharm Chemical	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5