Modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico

Resumen

La terapia génica miocárdica para la cardiopatía isquémica es muy prometedora para futuras terapias. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

Resumen

La enfermedad arterial coronaria es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. A pesar de la progresión de la terapéutica actual, una proporción considerable de pacientes con enfermedad arterial coronaria siguen siendo sintomáticos. La angiogénesis terapéutica mediada por terapia génica ofrece un nuevo método terapéutico para mejorar la perfusión miocárdica y aliviar los síntomas. La terapia génica con diferentes factores angiogénicos se ha estudiado en pocos ensayos clínicos. Debido a la novedad del método, el progreso de la terapia génica miocárdica es un camino continuo desde el banco hasta la cabecera. Por lo tanto, se necesitan modelos animales grandes para evaluar la seguridad y la eficacia. Cuanto más identifica el modelo animal grande la enfermedad original y los criterios de valoración utilizados en las clínicas, más predecibles son los resultados de los ensayos clínicos. Aquí, presentamos un modelo animal grande para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón porcino isquémico. Utilizamos métodos de imagen clínicamente relevantes, como imágenes de ultrasonido y ¹⁵H₂O-PET. Para dirigir las transferencias de genes al área deseada, se utiliza el mapeo electroanatómico. El objetivo de este método es: (1) imitar la enfermedad arterial coronaria crónica, (2) inducir angiogénesis terapéutica en áreas hipóxicas del corazón, y (3) evaluar la seguridad y eficacia de la terapia génica mediante el uso de criterios de valoración relevantes.

Introducción

La enfermedad arterial coronaria es responsable de la gran proporción de mortalidad y carga de enfermedad en todo el mundo¹. Las estrategias de tratamiento actuales son las intervenciones percutáneas, el tratamiento farmacológico y la cirugía de derivación². Sin embargo, a pesar de la progresión de estas terapias actuales, muchos pacientes sufren de la llamada angina refractaria, lo que subraya la necesidad insatisfecha de nuevos enfoques de tratamiento³. La angiogénesis terapéutica mediada por terapia génica podría dirigirse a este grupo de pacientes.

La terapia génica miocárdica se administra con mayor frecuencia mediante el uso de diferentes vectores virales, más comúnmente adenovirus⁴ deficiente en replicación. Como genes terapéuticos, se utilizan varios factores de crecimiento angiogénicos. Los factores de crecimiento angiogénico más estudiados son los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que median su señalización angiogénica a través de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y sus correceptores⁵. Varios ensayos clínicos han demostrado el beneficio y la seguridad de la terapia génica cardíaca y han hecho de este nuevo método de tratamiento una opción realista para el tratamiento de las cardiopatías isquémicas ^6,7. Sin embargo, este concepto todavía necesita mejorar los genes terapéuticos y los vectores virales puestos a prueba en modelos animales grandes antes de ingresar a las clínicas. El cerdo se ha utilizado con frecuencia como animal de laboratorio ya que su corazón es muy similar al corazón humano. El tamaño del sistema cardiovascular de un cerdo permite el uso de invenciones de catéter similares a las utilizadas en humanos. Todas las modalidades de imagen disponibles para humanos se pueden utilizar en cerdos⁸.

Hay varios modelos animales grandes para la isquemia crónica. El más utilizado es el ameroide constrictor modelo 9,10,11. La desventaja de este método es la invasividad, ya que se necesita toracotomía para acceder a la vasculatura coronaria. Previamente en nuestro grupo, se ha desarrollado un modelo de stent de cuello de botella miniinvasivo para la isquemia miocárdica crónica¹². Este método también se utiliza en este manuscrito para inducir isquemia miocárdica.

La usabilidad de las imágenes de ultrasonido ha evolucionado sustancialmente a pesar de la edad de la modalidad de imagen. Por ejemplo, la tensión miocárdica todavía está principalmente en uso de investigación debido a su novedad. La tensión miocárdica refleja los cambios en la función contráctil del corazón mejor que la medición tradicional de la fracción de eyección en modo M¹³. Por lo tanto, aquí en el modelo animal grande, se utiliza la medición de la tensión miocárdica. Para evaluar la función del corazón, el gasto cardíaco también se mide mediante imágenes de cine del ventrículo izquierdo durante la angiografía. El gasto cardíaco se mide tanto en reposo como bajo estrés inducido por dobutamina para evaluar la función miocárdica bajo estrés.

Además de las mediciones de la función cardíaca, la información sobre la perfusión miocárdica es esencial en los estudios de terapia génica destinados a la angiogénesis terapéutica. En este modelo animal, se obtienen imágenes de los animales con una tomografía por emisión de positrones radioacuídica marcada con 15 O (¹⁵H₂O-PET), ya que este es el estándar de oro para medir la perfusión miocárdica. ¹⁵El_H2O-PET ha sido previamente validado para medir la perfusión del corazón porcino isquémico¹⁴.

Por lo tanto, los métodos y modalidades mencionados anteriormente constituyen una excelente perspectiva para evaluar la eficacia de la terapia génica en el corazón isquémico.

Protocolo

Los experimentos presentados aquí se realizan utilizando cerdos domésticos hembras de aproximadamente 10 semanas de edad y están aprobados por la Junta de Experimentación Animal en Finlandia. Los animales pesan 30-40 kg al comienzo del protocolo, lo que permite el mismo equipo de procedimiento y modalidades de imagen posibles para los humanos. La isquemia crónica se induce 14 días antes de la transferencia génica, y el tiempo de seguimiento después de la transferencia génica depende del vector viral utilizado. El protocolo del estudio se muestra en la Figura 1. Este protocolo se puede utilizar para realizar inyecciones de terapia génica adenoviral o mediada por AAV. El tiempo de recogida de la muestra debe ajustarse al pico de expresión transgénica, que depende del vector viral utilizado. Por ejemplo, cuando se realizan transferencias de genes adenovirales, el tiempo de recolección de la muestra se establece en 6 días después de la transferencia de genes.

1. Medicación

1. Administrar una dosis diaria de 200 mg de amiodarona y 2,5 mg de bisoprolol para prevenir arritmias ventriculares fatales. El medicamento comienza 1 semana antes de la operación de isquemia y se continúa diariamente hasta el seguimiento.
2. Además, administrar dosis perorales de clopidogrel (300 mg) y ácido acetilsalicílico (300 mg) a los animales 1 día antes de la operación de isquemia para prevenir la trombosis aguda en el stent después de la colocación del stent.
3. Administrar 100 mg de lidocaína y 2,5 ml de (246 mg/ml) de MgSO₄ por vía intravenosa a los animales al comienzo de la operación de isquemia para prevenir arritmias ventriculares.
4. Administrar inyección intramuscular de cefuroxima (500 mg) al comienzo de cada operación para la profilaxis de la infección.
5. Administrar 30 mg de enoxaparina por vía intravenosa al comienzo de las operaciones de isquemia y por vía subcutánea después del procedimiento de operación para la prevención de la trombosis.
6. Para anestesia y analgesia, administrar 1,5 mL de atropin, 6 mL de azaperona (40 mg/mL), propofol 20 mg/mL, a razón de 15 mg/kg/h, y fentanilo 50 μg/mL a razón de 10 μg/kg/h. Las dosis de medicamentos fueron las mismas para cada cerdo. Consulte las pautas locales de uso en animales para la administración de dosis.
7. Anestesiar a los animales durante todas las operaciones. Todas las operaciones deben realizarse en un ambiente estéril utilizando una técnica estéril.

2. Ecocardiografía transtorácica

1. Realizar ecocardiografía transtorácica antes de la operación de isquemia, transferencia de genes y eutanasia para evaluar cualquier líquido pericárdico detectable y determinar la tensión miocárdica.
2. Coloque el transductor en el tercer o cuarto espacio intercostal debajo de la axila del cerdo para acceder a las vistas paraesternales de eje corto a nivel de la válvula mitral, el músculo papilar y los niveles apicales (Video 1). El marcador del transductor debe apuntar al esternón del cerdo. Para guardar un clip, pulse Adquirir.

3. Operaciones endovasculares bajo guía fluoroscópica

1. Realizar imágenes de cine del ventrículo izquierdo después de angiografías coronarias antes de la operación de isquemia, transferencia de genes y recolección de tejido.
2. Preparación de la operación
   1. Prepárese para las operaciones sedando a los cerdos con una inyección intramuscular de 1,5 ml de atropina y 6 ml de azaperona.
   2. Después de la sedación, inducir anestesia general con propofol y fentanilo para los procedimientos angiográficos a los cerdos con dosis de 15 mg/kg/h y 10 μg/kg/h, respectivamente.
      NOTA: Los cerdos son anestesiados durante todo el procedimiento.
   3. Apoyar la ventilación mediante intubación y ventilador y controlar los parámetros fisiológicos vitales, como el ECG y los parámetros respiratorios.
3. Colocación de la funda introductora
   1. Coloque una vaina introductora en la arteria femoral derecha para todas las operaciones como práctica estándar en cardiología. Use ultrasonido para rastrear la arteria femoral y perforarla con una aguja de entrada (18 G).
      NOTA: Utilice una vaina introductora 8F para las transferencias de genes intramiocárdicos y una vaina 6F para todas las demás operaciones. Introduzca el alambre guía de la vaina a través de la aguja para enhebrar la arteria y mantenga el alambre guía quieto mientras retira la aguja.
   2. Inserte la vaina introductora a lo largo del alambre guía y, cuando se coloque, retire el alambre guía y administre 1,25 mg de dinitrato sublingual al cerdo para inducir la vasodilatación coronaria.
4. Angiografía coronaria
   1. Realizar una angiografía coronaria directamente antes de la operación de isquemia, la transferencia de genes y la recolección de tejido. La maquinaria necesaria para los angiogramas se muestra en la Figura 2.
   2. Use un catéter 6F bajo guía fluoroscópica con un agente de contraste de yodo para obtener imágenes de la arteria coronaria derecha y la arteria coronaria ascendente izquierda (Video 2).
5. Imágenes de cine del ventrículo izquierdo en reposo y estrés con dobutamina
   1. Administre un bolo de 21 ml de agente de contraste de yodo en el ventrículo izquierdo a través de un catéter pigtail 5F utilizando un autoinyector. Primero, establezca la duración del bolo en 3 s y el volumen total para 21 ml. Luego, presione Single y Sí.
   2. Calcule la fracción de eyección mediante el software de medición de la estación de trabajo angiográfica. Para realizar el cálculo, seleccione Análisis ventricular de la imagen en cuestión. Desplácese por la imagen para seleccionar un marco de tiempo, uno en diástole y otro en sístole. Seleccione una herramienta para dibujar contornos ventriculares de cada marco de tiempo.
      NOTA: El software ahora calcula la fracción de eyección y el volumen sistólico por el método de Simpson. La medición de la fracción de eyección se realiza durante el reposo y bajo estrés inducido por dobutamina.
6. Imágenes de estrés
   1. Dosis de dobutamina por vía intravenosa en dosis crecientes de 10 μg/kg/min a 20 μg/kg/min para las imágenes de estrés inducido por dobutamina hasta que se alcance la frecuencia cardíaca objetivo de 160 lpm. Luego, realice las imágenes de cine.
7. Operación de isquemia
   1. Coloque un stent de cuello de botella en la arteria coronaria izquierda (LAD) 14 días antes de la transferencia del gen para inducir isquemia miocárdica crónica. Después de la colocación del stent en el cuello de botella, verifique si el stent del cuello de botella se coloca correctamente, lo que restringe el flujo sanguíneo coronario.
      NOTA: El stent de cuello de botella se coloca sobre un catéter de dilatación y consiste en un stent de metal desnudo cubierto por un tubo de politetrafluoroetileno formado en forma de cuello de botella para reducir el flujo sanguíneo coronario⁹.
8. Definición del tamaño del stent
   1. Elija el tamaño del stent, ya sea 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, de acuerdo con el tamaño de la arteria coronaria ascendente izquierda en el angiograma utilizando el software de medición automática en la estación de trabajo angiográfica (Video 3)¹².
9. Colocación del stent
   1. Coloque una bobina en la arteria coronaria izquierda y deslice el stent del cuello de botella hacia el LAD, colocándolo distalmente a la primera diagonal.
   2. Infle el stent a la presión nominal en la arteria usando un deflactor con una relación stent-luz de 1.3, anclando el cuello de botella en su lugar. Después de 15 s adicionales, desinfle el stent y retraiga el equipo de la arteria.
      NOTA: Confirme la colocación correcta del stent de cuello de botella mediante angiografía.

4. Imágenes PET

NOTA: Un día antes de la transferencia de genes, realice reposo y estrés ¹⁵exploraciones PET/CT radioacuícolas marcadas con O (requiere ambiente hospitalario y técnicos radiológicos).

1. Imágenes de referencia
   1. Realice tomografías computarizadas (TC) antes del descanso y las imágenes de esfuerzo. Utilice la información de TC para la corrección de atenuación.
2. ¹⁵Imágenes de radioagua marcadas con O
   1. Realice imágenes de descanso y estrés utilizando un bolo de 800 MBq ¹⁵_H2O.
3. Imágenes de estrés
   1. Realice imágenes de estrés con un bolo de O-agua adicional de 800 MBq 15 después de una desintegración radiactiva adecuada de ¹²min.
      NOTA: La hiperemia es inducida por adenosina (200 μg/kg/min intravenosa), como se describió anteriormente¹².

5. Transferencia génica

1. Mapeo electroanatómico
   1. Proceder al mapeo electroanatómico después de una angiografía coronaria y mediciones funcionales (ecocardiografía, imágenes de cine VI).
   2. Introducir un catéter de mapeo en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral en la guía fluoroscópica.
      NOTA: Registre alrededor de 100-150 puntos alrededor del ventrículo izquierdo con el catéter de mapeo para crear el mapa electroanatómico.
2. Terminando el mapa electroanatómico
   1. Elimine los puntos atípicos para garantizar un mapa electroanatómico más confiable del ventrículo izquierdo.
   2. Para ello, seleccione Clip Planes del mapa y elimine los puntos que difieren de los puntos que forman la forma ventricular. A continuación, seleccione Trayectorias para la vista de mapa y elimine los puntos que se han recorrido horizontalmente durante el registro de puntos.
      NOTA: Asegúrese de que los puntos restantes cubran el ventrículo izquierdo y registre más puntos si es necesario.
3. Inyecciones de transferencia de genes
   1. Introducir un catéter de inyección intramiocárdica en el ventrículo izquierdo a través de la vaina femoral bajo guía fluoroscópica. Ajuste la longitud de la aguja de inyección a 3 mm.
4. Criterios para las inyecciones intramiocárdicas
   1. Guiar las transferencias de genes mediante un sistema de mapeo electroanatómico y dirigir las inyecciones en áreas viables pero hipocinéticas del ventrículo izquierdo.
      NOTA: Para la viabilidad, utilice un voltaje unipolar superior a 5 mV como criterio. Para la hipocinesia, seleccione un acortamiento lineal local (LLS) tan bajo como esté disponible, al menos por debajo del 12%, pero preferiblemente por debajo del 6%¹³.
5. Inyecciones intramiocárdicas
   1. Durante 30 s, inyecte el material vectorial en el punto de selección (paso 5.4) y mantenga la aguja de inyección dentro del miocardio durante 5 s adicionales antes de retraerse para evitar el reflujo al ventrículo izquierdo.

6. Eutanasia y recogida de muestras

NOTA: Después de la angiografía coronaria y las mediciones de la fracción de eyección descritas en los pasos 3.4.1 y 3.5.2, respectivamente, administrar 50 mL de cloruro de potasio saturado por vía intravenosa al cerdo anestesiado.

1. Fijación del corazón por perfusión
   1. Cosechar el corazón de la cavidad torácica. Enjuagar con agua. Coloque una aguja de 18 G por encima de la válvula aórtica y conecte la aguja a una bomba de perfusión. Perfundir el corazón con 750 ml de paraformaldehído al 1% (PFA).
2. Recogida de muestras
   1. Corte el corazón en rodajas de 1 cm de grosor con un cuchillo de cocina afilado. Recoja las muestras del área de transferencia de genes en PFA al 4% y nitrógeno líquido.
      NOTA: Para cosechar controles negativos, recoja una muestra de control de la pared posterior del ventrículo izquierdo.
3. Recolección de pañuelos de seguridad
   1. Recolecte muestras de tejidos remotos, como el pulmón, el hígado, el riñón, el bazo y los ovarios. Tome muestras en PFA al 4% y nitrógeno líquido.

7. Almacenamiento de muestras

1. Almacenar las muestras para teñir en PFA al 4% durante 48 h a 4 °C.
   NOTA: Reemplace el PFA diariamente con un líquido fresco.
   1. Después de 48 h, reemplace el PFA con sacarosa al 15% en agua desionizada. Conservar durante al menos 24 h antes de incrustar las muestras en bloques de parafina. Las muestras congeladas a presión se almacenan a -70 °C.

Resultados

El éxito de la operación de isquemia se puede confirmar con este protocolo mediante angiografía coronaria y determinando el área hipocinética mediante ecografía transtorácica (Figura 1) antes de proceder a la entrega del gen. El estado de la oclusión coronaria se puede evaluar mediante angiografía coronaria, y el mapeo electroanatómico asegura las áreas isquémicas e hibernantes.

La eficacia de la terapia génica se puede analizar midiendo la tensión c...

Discusión

Los puntos de tiempo de este protocolo pueden modificarse de acuerdo con el vector viral utilizado. Además, los análisis inmunohistológicos pueden seleccionarse de acuerdo con el gen terapéutico. También es posible agregar más puntos de tiempo y puntos finales al protocolo si es necesario.

Este protocolo comprende etapas, que son esenciales para tener éxito e imposibles de corregir después. En primer lugar, si no se induce una isquemia adecuada, el animal debe ser excluido de otros pro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips