허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델

요약

허혈성 심장 질환에 대한 심근 유전자 치료는 미래 치료법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 여기에서는 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다.

초록

관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 중요한 원인 중 하나입니다. 현재 치료법의 진행에도 불구하고 관상 동맥 질환 환자의 상당 부분이 증상을 유지하고 있습니다. 유전자 요법 매개 치료 혈관신생은 심근 관류를 개선하고 증상을 완화하기 위한 새로운 치료 방법을 제공합니다. 다양한 혈관신생 인자를 이용한 유전자 요법은 몇 가지 임상 시험에서 연구되었습니다. 이 방법의 참신함으로 인해 심근 유전자 치료의 진행은 벤치에서 침대 옆으로 이어지는 연속적인 경로입니다. 따라서 안전성 및 효능을 평가하기 위해서는 대형 동물모델이 필요하다. 대형 동물 모델이 원래 질병과 클리닉에서 사용되는 종점을 더 많이 식별할수록 임상 시험에서 더 예측 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 허혈성 돼지 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다. 우리는 초음파 영상 및 ¹⁵H₂O-PET와 같은 임상 적으로 관련된 영상 방법을 사용합니다. 원하는 영역으로의 유전자 전달을 표적화하기 위해 전기해부학적 매핑이 사용됩니다. 이 방법의 목적은 (1) 만성 관상 동맥 질환을 모방하고, (2) 심장의 저산소 영역에서 치료 혈관신생을 유도하고, (3) 관련 종점을 사용하여 유전자 요법의 안전성과 효능을 평가하는 것입니다.

서문

관상동맥 질환은 전 세계적으로 사망률과 질병 부담의 막대한 부분을 차지합니다¹. 현재 치료 전략은 경피적 중재, 약리학적 치료, 우회 수술²이다. 그러나 이러한 현재 치료법의 발전에도 불구하고 많은 환자들이 소위 불응성 협심증을 앓고 있으며, 이는 새로운 치료법에 대한 충족되지 않은 필요성을 강조한다³. 유전자 치료 매개 치료 혈관신생은 이 환자 그룹을 표적으로 할 수 있습니다.

심근 유전자 치료는 가장 일반적으로 다른 바이러스 벡터, 가장 일반적으로 복제 결핍 아데노바이러스⁴를 사용하여 전달됩니다. 치료 유전자로서, 다양한 혈관신생 성장 인자들이 사용된다. 가장 실질적으로 연구된 혈관신생 성장인자는 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFRs)와 그 보조수용체를 통해 혈관신생 신호전달을 매개하는 혈관 내피 성장인자(VEGF)이다⁵. 여러 임상 시험에서 심장 유전자 치료의 이점과 안전성이 입증되었으며 이 새로운 치료 방법을 허혈성 심장 질환 치료를 위한 현실적인 옵션으로 만들었습니다 ^6,7. 그러나 이 개념은 여전히 클리닉에 들어가기 전에 대형 동물 모델에서 테스트한 치료 유전자와 바이러스 벡터의 향상이 필요합니다. 돼지는 심장이 인간의 심장과 매우 유사하기 때문에 실험실 동물로 자주 사용되었습니다. 돼지의 심혈관 시스템의 크기는 인간에서 사용되는 것과 유사한 카테터 발명의 사용을 허용합니다. 인간이 사용할 수 있는 모든 이미징 양식은 돼지에서 사용할 수 있다⁸.

만성 허혈에 대한 몇 가지 대형 동물 모델이 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 아메로이드 수축기 모델 9,10,11입니다. 이 방법의 단점은 관상 동맥 혈관에 접근하기 위해 개흉술이 필요하기 때문에 침습성입니다. 이전에 우리 그룹에서는 만성 심근 허혈에 대한 미니 침습적 병목 스텐트 모델이 개발되었습니다¹². 이 방법은 또한 심근 허혈을 유도하기 위해 이 원고에서 사용됩니다.

초음파 영상의 유용성은 영상 양식의 시대에도 불구하고 크게 발전했습니다. 예를 들어, 심근 변형은 참신함으로 인해 여전히 주로 연구 용도로 사용됩니다. 심근 긴장은 기존의 M-모드 박출률 측정보다 심장의 수축 기능의 변화를 더 잘 반영한다¹³. 따라서, 여기 대형 동물 모델에서, 심근 변형률 측정이 활용된다. 심장의 기능을 평가하기 위해 심박출량은 혈관 조영술 중 좌심실의 시네 이미징으로도 측정됩니다. 심박출량은 스트레스 하에서 심근 기능을 평가하기 위해 휴식 시와 도부타민 유발 스트레스 하에서 모두 측정됩니다.

심장 기능의 측정 외에도 심근 관류에 대한 정보는 치료 혈관 신생을 목표로하는 유전자 치료 연구에서 필수적입니다. 이 동물 모델에서, 동물은 심근 관류를 측정하기 위한 황금 표준인 15 O-표지된 방사성 양전자 방출 단층 촬영(¹⁵H₂O-PET)으로 영상화된다. ¹⁵H2O-PET는 허혈성 돼지 심장의 관류를 측정하기 위해 이전에 검증되었다¹⁴.

따라서, 상기 언급된 방법 및 양상은 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 우수한 관점을 구성한다.

프로토콜

여기에 제시된 실험은 약 10 주 된 암컷 국내 돼지를 사용하여 수행되며 핀란드 동물 실험위원회의 승인을 받았습니다. 프로토콜이 시작될 때 동물의 무게는 30-40kg이므로 인간과 동일한 절차 장비 및 이미징 방식을 허용합니다. 만성 허혈은 유전자 전달 14일 전에 유도되며, 유전자 전달 후 추적 관찰 시간은 사용된 바이러스 벡터에 따라 다릅니다. 연구 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 아데노바이러스 또는 AAV 매개 유전자 요법 주사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플 수집 시간은 사용된 바이러스 벡터에 따라 달라지는 이식유전자 발현 피크에 맞게 조정되어야 합니다. 예를 들어, 아데노바이러스 유전자 전달을 수행할 때 샘플 수집 시간은 유전자 전달 후 6일로 설정됩니다.

1. 약물 치료

1. 치명적인 심실 부정맥을 예방하기 위해 아미오다론 200mg과 비소프롤롤 2.5mg을 매일 투여하십시오. 약물은 허혈 수술 1주일 전에 시작하여 추적 관찰까지 매일 계속됩니다.
2. 또한, 스텐트 삽입 후 급성 스텐트 내 혈전증을 예방하기 위해 허혈 수술 1일 전에 동물에게 클로피도그렐(300mg)과 아세틸살리실산(300mg)을 경구 투여한다.
3. 심실 부정맥을 예방하기 위해 허혈 수술 시작 시 동물에게 리도카인 100mg과 MgSO₄ 2.5mL(246mg/mL)를 정맥 주사합니다.
4. 감염 예방을 위해 각 수술 시작 시 세푸록심(500mg)을 근육내 주사합니다.
5. 혈전증 예방을 위해 허혈 수술 시작 시 에녹사파린 30mg을 정맥 주사하고 수술 후 피하 투여한다.
6. 마취 및 진통을 위해 아트로핀 1.5mL, 아자페론 6mL(40mg/mL), 프로포폴 20mg/mL를 15mg/kg/h, 펜타닐 50μg/mL를 10μg/kg/h의 속도로 투여합니다. 약물 투여량은 각 돼지에 대해 동일했습니다. 용량 투여에 대해서는 지역 동물 사용 지침을 참조하십시오.
7. 모든 수술 중에 동물을 마취하십시오. 모든 작업은 멸균 기술을 사용하여 멸균 환경에서 수행해야합니다.

2. 경흉부 심초음파

1. 허혈 수술, 유전자 전달 및 안락사 전에 경흉부 심초음파를 수행하여 검출 가능한 심낭액을 평가하고 심근 균주를 결정합니다.
2. 돼지 겨드랑이 아래의 세 번째 또는 네 번째 늑간 공간에 변환기를 배치하여 승모판 수준, 유두 근육 및 정점 수준에서 흉골주위 단축 보기에 액세스합니다(비디오 1). 변환기의 마커는 돼지의 흉골을 가리켜 야합니다. 클립을 저장하려면 Acquire를 누릅니다.

3. 형광 투시 유도 하에 혈관내 수술

1. 허혈 수술, 유전자 전달 및 조직 수집 전에 관상 동맥 조영술 후 좌심실 시네 이미징을 수행합니다.
2. 수술 준비
   1. 아트로핀 1.5mL와 아자페론 6mL를 근육주사하여 돼지를 진정시켜 수술을 준비합니다.
   2. 진정 후 돼지에게 혈관조영술을 위한 전신 프로포폴과 펜타닐 마취를 각각 15mg/kg/h 및 10μg/kg/h의 용량으로 유도합니다.
      참고: 돼지는 전체 절차 동안 마취됩니다.
   3. 삽관 및 인공 호흡기로 환기를 지원하고 ECG 및 호흡 매개 변수와 같은 중요한 생리적 매개 변수를 모니터링합니다.
3. 도입기 피복 배치
   1. 심장학의 표준 관행으로 모든 수술을 위해 오른쪽 대퇴 동맥에 도입기 덮개를 배치합니다. 초음파를 사용하여 대퇴 동맥을 추적하고 입구 바늘 (18G)로 뚫습니다.
      참고: 심근내 유전자 전달에는 8F 도입기 덮개를 사용하고 다른 모든 작업에는 6F 덮개를 사용합니다. 바늘을 통해 칼집의 가이드와이어를 삽입하여 동맥에 나사산을 꿰고 바늘을 제거하는 동안 가이드와이어를 가만히 유지합니다.
   2. 가이드와이어를 따라 도입기 덮개를 삽입하고 배치되면 가이드와이어를 제거하고 설하 디니트레이트 1.25mg을 돼지에게 투여하여 관상동맥 확장을 유도합니다.
4. 관상 동맥 조영술
   1. 허혈 수술, 유전자 전달 및 조직 수집 직전에 관상동맥 조영술을 시행합니다. 혈관 조영술에 필요한 기계는 그림 2에 나와 있습니다.
   2. 요오드 조영제와 함께 형광 투시 유도 하에 6F 카테터를 사용하여 오른쪽 관상동맥과 왼쪽 상행 관상동맥을 이미지화합니다(비디오 2).
5. 휴식과 도부타민 스트레스 하에서 좌심실 시네 영상
   1. 자동 주사기를 사용하여 5F 피그테일 카테터를 통해 21mL의 요오드 조영제를 좌심실에 투여합니다. 먼저 볼루스 지속 시간을 3초로 설정하고 총 부피를 21mL로 설정합니다. 그런 다음 Single 및 Yes를 누릅니다.
   2. 혈관 조영 워크스테이션의 측정 소프트웨어로 박출률을 계산합니다. 계산을 수행하려면 해당 이미지의 심실 분석을 선택합니다. 이미지를 스크롤하여 이완기와 수축기의 시간 프레임을 선택합니다. 각 시간 프레임의 심실 윤곽을 그리는 도구를 선택합니다.
      알림: 소프트웨어는 이제 Simpson의 방법으로 배출 분율과 스트로크 볼륨을 계산합니다. 박출률 측정은 휴식 중과 도부타민 유발 스트레스 하에서 수행됩니다.
6. 스트레스 이미징
   1. 목표 심박수 160bpm에 도달할 때까지 도부타민 유발 스트레스 영상을 위해 도부타민 유발 스트레스 영상을 위해 10μg/kg/min에서 20μg/kg/min으로 증량하여 도부타민을 정맥 주사합니다. 그런 다음 시네 이미징을 수행합니다.
7. 허혈 수술
   1. 만성 심근 허혈을 유도하기 14일 전에 유전자 전달 14일 전에 왼쪽 관상동맥(LAD)에 병목 스텐트를 삽입합니다. 병목 스텐트를 식립한 후 병목 스텐트가 올바르게 식립되어 관상 동맥 혈류를 제한하는지 확인하십시오.
      참고: 병목 스텐트는 확장 카테터에 배치되며 관상 동맥 혈류를 감소시키기 위해 병목 모양으로 형성된 폴리테트라플루오로에틸렌 튜브로 덮인 베어 메탈 스텐트로 구성됩니다⁹.
8. 스텐트 크기 정의
   1. 혈관 조영술 워크스테이션의 자동 측정 소프트웨어를 사용하여 혈관 조영술에서 왼쪽 상행 관상동맥의 크기에 따라 스텐트의 크기를 3.0/3.5/4.0 x 8mm로 선택합니다(비디오 3)¹².
9. 스텐트 배치
   1. 왼쪽 관상 동맥에 코일을 놓고 병목 스텐트를 LAD로 미끄러지듯 이동하여 첫 번째 대각선까지 말단에 배치합니다.
   2. 스텐트 대 루멘 비율이 1.3인 인디플레이터를 사용하여 동맥의 공칭 압력으로 스텐트를 팽창시켜 병목 현상을 제자리에 고정합니다. 추가로 15초 후에 스텐트를 수축시키고 동맥에서 장비를 집어넣습니다.
      참고: 혈관 조영술로 병목 스텐트가 올바르게 배치되었는지 확인합니다.

4. PET 이미징

참고: 유전자 이식 하루 전에 휴식과 스트레스 ¹⁵O-표지 방사성 물 PET/CT 스캔을 수행합니다(병원 환경 및 방사선 기술자 필요).

1. 레퍼런스 이미징
   1. 휴식 및 스트레스 영상 촬영 전에 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔을 수행합니다. 감쇠 보정을 위해 CT 정보를 사용합니다.
2. ¹⁵O-표지 방사성 영상
   1. 800MBq ¹⁵H₂O 볼루스를 사용하여 휴식 및 스트레스 이미징을 수행합니다.
3. 스트레스 이미징
   1. 12분의 적절한 방사성 붕괴 후 추가로 800MBq ¹⁵O-물 볼루스로 스트레스 이미징을 수행합니다.
      참고: 충혈은 앞서 설명한 바와 같이 아데노신(200μg/kg/min 정맥 주사)에 의해 유발됩니다¹².

5. 유전자 전달

1. 전기 해부학 매핑
   1. 관상동맥 조영술 및 기능 측정(심초음파, LV 시네 영상) 후 전기해부학적 매핑을 진행합니다.
   2. 형광 투시 유도에서 대퇴골초를 통해 좌심실에 매핑 카테터를 삽입합니다.
      참고: 매핑 카테터로 좌심실 주변의 약 100-150점을 등록하여 전기 해부학적 지도를 만듭니다.
2. 전기 해부학 지도 완성
   1. 좌심실의 보다 신뢰할 수 있는 전기해부학적 지도를 보장하기 위해 이상치 점을 삭제합니다.
   2. 맵의 평면 클립(Clip Planes )을 선택하고 심실 모양을 형성하는 점과 다른 점을 삭제하면 됩니다. 그런 다음 맵 뷰에 대한 궤적을 선택하고 포인트 등록 중에 수평으로 이동한 포인트를 삭제합니다.
      알림: 나머지 포인트가 좌심실을 덮고 있는지 확인하고 필요한 경우 더 많은 포인트를 등록하십시오.
3. 유전자 전달 주사
   1. 형광 투시 유도하에 대퇴골초를 통해 좌심실에 심근 내 주사 카테터를 삽입합니다. 주사 바늘 길이를 3mm로 설정합니다.
4. 심근 내 주사 기준
   1. electroanatomical mapping system에 의한 유전자 전달을 안내하고 좌심실의 생존 가능하지만 저운동 영역에 주사를 표적으로 삼습니다.
      알림: 생존 가능성을 위해 단극 볼륨을 사용하십시오.tage 5mV 이상을 기준으로 합니다. 저산소증의 경우, 국소 선형 단축(LLS)을 가능한 한 낮게, 최소 12% 미만, 바람직하게는 6% 미만으로 선택하십시오¹³.
5. 심근 주사
   1. 30초 동안 벡터 물질을 선택 지점에 주입하고(5.4단계) 좌심실로의 역류를 방지하기 위해 후퇴하기 전에 추가로 5초 동안 심근 내부에 주사 바늘을 유지합니다.

6. 안락사 및 샘플 수집

참고: 3.4.1단계와 3.5.2단계에서 각각 설명한 관상동맥 조영술 및 박출률 측정 후 마취된 돼지에게 포화 염화칼륨 50mL를 정맥 주사합니다.

1. 심장의 관류 고정
   1. 흉강에서 심장을 수확하십시오. 물로 헹굽니다. 대동맥 판막 위에 18G 바늘을 놓고 바늘을 관류 펌프에 부착합니다. 750mL의 1% 파라포름알데히드(PFA)로 심장을 관류합니다.
2. 시료 채취
   1. 날카로운 부엌 칼을 사용하여 심장을 1cm 두께로 자릅니다. 유전자 전달 영역에서 샘플을 수집하여 4% PFA와 액체 질소로 만듭니다.
      알림: 음성 대조군을 채취하려면 대조군을 수집amp좌심실의 후벽에서.
3. 안전 조직 수집
   1. 폐, 간, 신장, 비장 및 난소와 같은 원격 조직에서 샘플을 채취합니다. 시료를 4% PFA와 액체 질소로 채취합니다.

7. 시료 보관

1. 염색을 위한 샘플을 4°C에서 48시간 동안 4% PFA에 보관한다.
   알림: 매일 PFA를 새 액체로 교체하십시오.
   1. 48시간 후, PFA를 탈이온수에서 15% 자당으로 교체한다. 샘플을 파라핀 블록에 삽입하기 전에 최소 24시간 동안 보관하십시오. 급속 냉동 샘플은 -70°C에서 보관됩니다.

결과

허혈 수술의 성공 여부는 관상 동맥 조영술에 의해이 프로토콜과 유전자 전달을 진행하기 전에 경흉부 초음파 (그림 1)에 의해 저 운동 영역을 결정함으로써 확인할 수 있습니다. 관상동맥 폐색의 상태는 관상동맥 조영술로 평가할 수 있으며, 전기해부학적 매핑은 허혈성 및 동면 영역을 보장합니다.

유전자 치료의 효능은 15H2O-PET에 의한 원주 변형률, 박...

토론

이 프로토콜의 시점은 사용된 바이러스 벡터에 따라 수정될 수 있습니다. 또한, 면역조직학적 분석은 치료 유전자에 따라 선택될 수 있다. 필요한 경우 프로토콜에 더 많은 시점과 끝점을 추가할 수도 있습니다.

이 프로토콜은 성공에 필수적이며 나중에 수정할 수 없는 단계로 구성됩니다. 첫째, 적절한 허혈을 유도하지 못하면 동물을 추가 절차 및 분석에서 제외해야 합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips