מודל בעלי חיים גדולים להערכת יעילות הטיפול הגנטי בלב איסכמי

Summary

טיפול גנטי בשריר הלב למחלות לב איסכמיות טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפולים עתידיים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של ריפוי גנטי בלב איסכמי.

Abstract

מחלת לב כלילית היא אחד הגורמים המשמעותיים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. למרות התקדמות הטיפולים הנוכחיים, חלק ניכר מהחולים במחלת לב כלילית נשארים סימפטומטיים. אנגיוגנזה טיפולית בתיווך ריפוי גנטי מציעה שיטה טיפולית חדשנית לשיפור זילוח שריר הלב ולהקלה על הסימפטומים. טיפול גנטי עם גורמים אנגיוגניים שונים נחקר במספר ניסויים קליניים. בשל החידוש של השיטה, ההתקדמות של טיפול גנטי שריר הלב הוא נתיב מתמשך מספסל למיטה. לכן, מודלים גדולים של בעלי חיים נדרשים להערכת הבטיחות והיעילות. ככל שמודל בעלי החיים הגדולים מזהה יותר את המחלה המקורית ואת נקודות הקצה המשמשות במרפאות, כך התוצאות צפויות יותר מניסויים קליניים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של הטיפול הגנטי בלב חזירי איסכמי. אנו משתמשים בשיטות הדמיה רלוונטיות מבחינה קלינית כגון הדמיית אולטרסאונד ו- ¹⁵H₂O-PET. לצורך מיקוד העברות הגן לאזור הרצוי, נעשה שימוש במיפוי אלקטרואנטומי. מטרת שיטה זו היא: (1) לחקות מחלת לב כלילית כרונית, (2) לגרום לאנגיוגנזה טיפולית באזורים היפוקסיים של הלב, ו-(3) להעריך את הבטיחות והיעילות של הטיפול הגנטי באמצעות נקודות קצה רלוונטיות.

Introduction

מחלת לב כלילית אחראית לחלק העצום של נטל התמותה והמחלה ברחבי העולם¹. אסטרטגיות הטיפול הנוכחיות הן התערבויות מלעוריות, טיפול תרופתי וניתוח מעקפים². עם זאת, למרות ההתקדמות של טיפולים נוכחיים אלה, חולים רבים סובלים מה שנקרא תעוקת חזה עקשנית, המדגישה את הצורך הבלתי מסופק בגישות טיפול חדשניות³. אנגיוגנזה טיפולית בתיווך ריפוי גנטי יכולה להתמקד בקבוצת חולים זו.

טיפול גנטי בשריר הלב מועבר לרוב באמצעות וקטורים נגיפיים שונים, לרוב אדנו-וירוס חסר שכפול⁴. כגנים טיפוליים, נעשה שימוש בגורמי גדילה אנגיוגניים שונים. גורמי הגדילה האנגיוגניים הנחקרים ביותר הם גורמי גדילה אנדותל כלי דם (VEGFs) המתווכים את האיתות האנגיוגני שלהם באמצעות קולטני גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGFRs) וקולטני המשנה שלהם⁵. מספר ניסויים קליניים הוכיחו את התועלת והבטיחות של טיפול גנטי לבבי והפכו שיטת טיפול חדשנית זו לאפשרות מציאותית לטיפול במחלות לב איסכמיות ^6,7. עם זאת, תפיסה זו עדיין זקוקה לשיפור של הגנים הטיפוליים והווקטורים הנגיפיים שהועמדו למבחן במודלים גדולים של בעלי חיים לפני הכניסה למרפאות. החזיר שימש לעתים קרובות כחיית מעבדה מכיוון שליבו דומה מאוד ללב האדם. גודלה של מערכת הלב וכלי הדם של חזיר מאפשר שימוש בהמצאות קטטר דומות לאלה המשמשות בבני אדם. ניתן להשתמש בכל שיטות ההדמיה הזמינות לבני אדם בחזירים⁸.

ישנם מספר מודלים גדולים של בעלי חיים לאיסכמיה כרונית. הנפוץ ביותר הוא דגם מכווץ אמרואיד 9,10,11. החיסרון של שיטה זו הוא הפולשנות שכן בית החזה נחוץ כדי לגשת כלי הדם הכליליים. בעבר בקבוצה שלנו פותח מודל סטנט מיני פולשני לצוואר בקבוק לאיסכמיה כרונית של שריר הלב¹². שיטה זו משמשת גם בכתב יד זה לגרימת איסכמיה של שריר הלב.

השימושיות של הדמיית אולטרסאונד התפתחה באופן משמעותי למרות גיל שיטת ההדמיה. לדוגמה, זן שריר הלב הוא עדיין בעיקר בשימוש מחקרי בשל החידוש שלה. מתח שריר הלב משקף שינויים בתפקוד ההתכווצות של הלב טוב יותר מאשר מדידת מקטע הפליטה המסורתית במצב M¹³. כך, כאן במודל בעלי החיים הגדולים, נעשה שימוש במדידת מתח שריר הלב. כדי להעריך את תפקוד הלב, תפוקת הלב נמדדת גם על ידי הדמיית cine של החדר השמאלי במהלך אנגיוגרפיה. תפוקת הלב נמדדת הן במנוחה והן תחת לחץ הנגרם על ידי דובוטמין כדי להעריך את תפקוד שריר הלב תחת לחץ.

בנוסף למדידות של תפקוד הלב, מידע על זילוח שריר הלב חיוני במחקרי ריפוי גנטי שמטרתם אנגיוגנזה טיפולית. במודל זה של בעלי חיים, בעלי חיים מצולמים עם טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים של 15 H 2 O-PET עם תווית O (¹⁵H₂O-PET) מכיוון שזהו תקן הזהב למדידת זילוח שריר הלב. ¹⁵H₂O-PET אומת בעבר למדידת זילוח של לב חזירי איסכמי¹⁴.

לפיכך, השיטות והשיטות שהוזכרו לעיל מהוות פרספקטיבה מצוינת להערכת יעילות הטיפול הגנטי בלב האיסכמי.

Protocol

הניסויים המוצגים כאן מבוצעים באמצעות נקבות חזירי בית בנות כ-10 שבועות ומאושרים על ידי המועצה לניסויים בבעלי חיים בפינלנד. בעלי חיים שוקלים 30-40 ק"ג בתחילת הפרוטוקול, מה שמאפשר את אותו ציוד פרוצדורלי ושיטות הדמיה ככל האפשר לבני אדם. איסכמיה כרונית נגרמת 14 יום לפני העברת הגנים, וזמן המעקב לאחר העברת הגן תלוי בווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. פרוטוקול המחקר מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע זריקות טיפול גנטי אדנו-ויראלי או בתיווך AAV. יש להתאים את זמן איסוף הדגימה לשיא ביטוי הטרנסגנים, התלוי בווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. לדוגמה, בעת ביצוע העברות גנים אדנו-ויראליות, זמן איסוף הדגימה מוגדר ל -6 ימים לאחר העברת הגנים.

1. תרופות

1. לנהל מינון יומי של 200 מ"ג של amiodarone ו 2.5 מ"ג של bisoprolol כדי למנוע הפרעות קצב חדריות קטלניות. התרופה מתחילה שבוע לפני ניתוח האיסכמיה ונמשכת מדי יום עד למעקב.
2. בנוסף, לנהל מינונים peroral של clopidogrel (300 מ"ג) וחומצה אצטילסליצילית (300 מ"ג) לבעלי החיים 1 יום לפני ניתוח איסכמיה כדי למנוע פקקת חריפה in-stent לאחר מיקום סטנט.
3. לתת 100 מ"ג של לידוקאין ו 2.5 מ"ל של (246 מ"ג / מ"ל) MgSO₄ תוך ורידי לבעלי החיים בתחילת ניתוח איסכמיה כדי למנוע הפרעות קצב חדרים.
4. יש לבצע הזרקה תוך שרירית של cefuroxime (500 מ"ג) בתחילת כל ניתוח למניעת זיהום.
5. לנהל 30 מ"ג של enoxaparin תוך ורידי בתחילת פעולות איסכמיה תת עורית לאחר הליך הניתוח למניעת פקקת.
6. להרדמה ושיכוך כאבים, יש לתת 1.5 מ"ל אטרופין, 6 מ"ל אזפרון (40 מ"ג/מ"ל), פרופופול 20 מ"ג/מ"ל, בקצב של 15 מ"ג/ק"ג/שעה, ופנטניל 50 מק"ג/מ"ל בקצב של 10 מק"ג/ק"ג/שעה. מינוני התרופות היו זהים עבור כל חזיר. עיין בהנחיות מקומיות לשימוש בבעלי חיים למתן מינון.
7. מרדימים את בעלי החיים במהלך כל הניתוחים. כל הפעולות צריכות להתבצע בסביבה סטרילית בטכניקה סטרילית.

2. אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה

1. בצע אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים והמתת חסד כדי להעריך כל נוזל קרום הלב הניתן לגילוי ולקבוע את זן שריר הלב.
2. מקם את המתמר בחלל הבין-קוסטלי השלישי או הרביעי מתחת לבית השחי של החזיר כדי לגשת לתצוגות פרסטרנליות קצרות ציר ברמת המסתם המיטרלי, שריר פפילרי ורמות אפיקליות (וידאו 1). סמן המתמר צריך להצביע על עצם החזה של החזיר. כדי לשמור סרטון, לחץ על Acquire.

3. פעולות אנדו-וסקולריות בהנחיה פלואורוסקופית

1. ביצוע הדמיית cine בחדר שמאל לאחר אנגיוגרמות כליליות לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים ואיסוף רקמות.
2. הכנת המבצע
   1. היכונו לפעולות על ידי הרגעת החזירים עם הזרקה תוך שרירית של 1.5 מ"ל של אטרופין ו 6 מ"ל של azaperone.
   2. לאחר ההרגעה, יש להשרות הרדמה כללית של פרופופול ופנטניל עבור ההליכים האנגיוגרפיים לחזירים במינונים של 15 מ"ג/ק"ג/שעה ו-10 מק"ג/ק"ג/שעה, בהתאמה.
      הערה: החזירים מורדמים לכל אורך ההליך.
   3. לתמוך בהנשמה על ידי אינטובציה והנשמה ולנטר את הפרמטרים הפיזיולוגיים החיוניים, כגון א.ק.ג. ופרמטרים נשימתיים.
3. מבוא מיקום נדן
   1. הניחו נדן מבוא לעורק הירך הימני לכל הניתוחים כמקובל בקרדיולוגיה. השתמש באולטרסאונד כדי לעקוב אחר עורק הירך ולנקב אותו עם מחט כניסה (18 גרם).
      הערה: השתמש במעטפת 8F להעברת גנים תוך שריר הלב ובמעטה 6F לכל הפעולות האחרות. הכנס את חוט ההנחיה של הנדן דרך המחט כדי להשחיל את העורק ולהחזיק את חוט ההנחיה ללא תזוזה תוך הסרת המחט.
   2. הכנס את נדן המבוא לאורך חוט ההנחיה, וכאשר הוא מונח, הסר את חוט ההנחיה ותן 1.25 מ"ג של דיניטרט תת-לשוני לחזיר כדי לגרום להרחבת כלי הדם הכליליים.
4. אנגיוגרפיה כלילית
   1. בצע אנגיוגרפיה כלילית ישירות לפני ניתוח איסכמיה, העברת גנים ואיסוף רקמות. המנגנון הדרוש לאנגיוגרמות מוצג באיור 2.
   2. השתמש בצנתר 6F תחת הנחיה פלואורוסקופית עם חומר ניגוד יוד כדי לצלם את העורק הכלילי הימני ואת העורק הכלילי השמאלי העולה (וידאו 2).
5. הדמיית חדר שמאל תחת מנוחה ולחץ דובוטמין
   1. יש להכניס בולוס בנפח 21 מ"ל של חומר ניגוד יוד לחדר השמאלי באמצעות צנתר זנב חזיר 5F באמצעות מזרק אוטומטי. ראשית, הגדר את משך הבולוס ב -3 שניות ואת הנפח הכולל עבור 21 מ"ל. לאחר מכן, לחץ על יחיד וכן.
   2. חשב את מקטע הפליטה על ידי תוכנת המדידה של תחנת העבודה האנגיוגרפית. כדי לבצע את החישוב, בחר ניתוח חדרים של התמונה המדוברת. גלול את התמונה כדי לבחור מסגרת זמן, אחת בדיאסטולה ואחת בסיסטולה. בחר כלי לציור קווי מתאר חדריים של כל מסגרת זמן.
      הערה: התוכנה מחשבת כעת את נפח מקטע השליפה והשבץ לפי שיטת סימפסון. מדידת מקטע הפליטה מבוצעת במהלך מנוחה ותחת לחץ המושרה על ידי דובוטמין.
6. הדמיית מאמץ
   1. מינון דובוטאמין תוך ורידי במינונים עולים מ-10 מיקרוגרם/ק"ג/דקה ל-20 מק"ג/ק"ג/דקה עבור הדמיית מאמץ הנגרמת על ידי דובוטמין עד להשגת דופק היעד של 160 פעימות לדקה. לאחר מכן, בצע את הדמיית cine.
7. ניתוח איסכמיה
   1. הכניסו סטנט צוואר בקבוק לעורק הכלילי השמאלי (LAD) 14 יום לפני העברת הגן כדי לגרום לאיסכמיה כרונית של שריר הלב. לאחר מיקום הסטנט בצוואר הבקבוק, בדוק אם סטנט צוואר הבקבוק ממוקם כראוי, מה שמגביל את זרימת הדם הכלילית.
      הערה: סטנט צוואר הבקבוק ממוקם על צנתר התרחבות ומורכב מתומכן מתכת חשופה המכוסה על ידי צינור פוליטטרפלואוראתילן שנוצר בצורת צוואר בקבוק כדי להפחית את זרימת הדם הכלילי⁹.
8. הגדרת גודל הסטנט
   1. בחר את גודל הסטנט, 3.0/3.5/4.0 x 8 מ"מ, בהתאם לגודל העורק הכלילי העולה השמאלי באנגיוגרמה באמצעות תוכנת המדידה האוטומטית בתחנת העבודה האנגיוגרפית (וידאו 3)¹².
9. מיקום סטנט
   1. הניחו סליל לעורק הכלילי השמאלי והחליקו את סטנט צוואר הבקבוק אל ה-LAD, והניחו אותו באופן מרוחק לאלכסון הראשון.
   2. ניפוח הסטנט ללחץ נומינלי בעורק באמצעות in-deflator עם יחס סטנט ללומן של 1.3, המעגן את צוואר הבקבוק במקומו. לאחר 15 שניות נוספות, לרוקן את הסטנט ולמשוך את הציוד מהעורק.
      הערה: ודא את המיקום הנכון של סטנט צוואר הבקבוק על ידי אנגיוגרמה.

4. הדמיית PET

הערה: יום לפני העברת הגנים, בצע מנוחה ומתח ¹⁵סריקות PET/CT רדיו-מים מסומנות O (דורש טכנאי סביבת בית חולים וטכנאים רדיולוגיים).

1. הדמיית ייחוס
   1. בצע סריקות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) לפני מנוחה והדמיית מתח. השתמש במידע CT לתיקון הנחתה.
2. ¹⁵הדמיית מים רדיו-מים עם תווית O
   1. בצע הדמיית מנוחה ומאמץ באמצעות בולוס 800 MBq ¹⁵H₂O.
3. הדמיית מאמץ
   1. בצע הדמיית מאמץ עם בולוס מים נוסף של 800 MBq 15 O-water לאחר דעיכה רדיואקטיבית מתאימה של ¹²דקות.
      הערה: היפרמיה נגרמת על ידי אדנוזין (200 מיקרוגרם / ק"ג / דקה תוך ורידי), כפי שתואר קודם¹².

5. העברת גנים

1. מיפוי אלקטרואנטומי
   1. המשך למיפוי אלקטרואנטומי לאחר אנגיוגרמה כלילית ומדידות תפקודיות (אקוקרדיוגרפיה, הדמיית LV cine).
   2. החדרת קטטר מיפוי לחדר שמאל דרך מעטפת הירך בהנחיה פלואורוסקופית.
      הערה: רשום כ 100-150 נקודות סביב החדר השמאלי עם קטטר מיפוי כדי ליצור את המפה האלקטרואנטומית.
2. סיום המפה האלקטרואנטומית
   1. מחק את הנקודות החריגות כדי להבטיח מפה אלקטרואנטומית אמינה יותר של החדר השמאלי.
   2. עשו זאת על ידי בחירת Clip Planes של המפה ומחקו את הנקודות השונות מהנקודות המרכיבות את צורת החדר. לאחר מכן, בחר מסלולים עבור תצוגת המפה ומחק את הנקודות שעברו אופקית במהלך רישום הנקודות.
      הערה: יש לוודא שהנקודות הנותרות מכסות את החדר השמאלי ולרשום נקודות נוספות במידת הצורך.
3. זריקות העברת גנים
   1. החדרת קטטר הזרקה תוך שריר הלב לחדר שמאל דרך מעטפת הירך בהנחיה פלואורוסקופית. הגדר את אורך מחט ההזרקה ל -3 מ"מ.
4. קריטריונים לזריקות תוך שריר הלב
   1. להנחות את העברות הגנים על ידי מערכת מיפוי אלקטרואנטומית ולמקד את הזריקות לאזורים קיימא אך היפוקינטיים של החדר השמאלי.
      הערה: עבור כדאיות, השתמש במתח חד קוטבי מעל 5 mV כקריטריון. עבור היפוקינזיה, בחר קיצור ליניארי מקומי (LLS) נמוך ככל האפשר, לפחות מתחת ל -12% אך עדיף מתחת ל -^{6% 13}.
5. זריקות תוך שריר הלב
   1. במהלך 30 שניות, הזריקו את החומר הווקטורי לנקודת הבחירה (שלב 5.4) ושמרו את מחט ההזרקה בתוך שריר הלב למשך 5 שניות נוספות לפני הנסיגה כדי למנוע זרימה חזרה לחדר השמאלי.

6. המתת חסד ואיסוף דגימות

הערה: לאחר מדידות האנגיוגרמה הכלילית ומקטע הפליטה המתוארות בשלבים 3.4.1 ו-3.5.2, בהתאמה, יש לתת 50 מ"ל אשלגן כלורי רווי לווריד לחזיר המורדם.

1. קיבוע זילוח של הלב
   1. קצרו את הלב מחלל בית החזה. יש לשטוף במים. מניחים מחט 18 G מעל שסתום אבי העורקים ומחברים את המחט למשאבת זילוח. לחורר את הלב עם 750 מ"ל של 1% paraformaldehyde (PFA).
2. אוסף דוגמאות
   1. פורסים את הלב לפרוסות בעובי 1 ס"מ בעזרת סכין מטבח חדה. אספו את הדגימות מאזור העברת הגנים ל-4% PFA וחנקן נוזלי.
      הערה: כדי לקצור בקרות שליליות, אספו דגימת ביקורת מהדופן האחורית של החדר השמאלי.
3. איסוף רקמות בטיחות
   1. קצרו דגימות מרקמות מרוחקות, כגון הריאה, הכבד, הכליות, הטחול והשחלות. קח דגימות לתוך 4% PFA וחנקן נוזלי.

7. אחסון דוגמאות

1. אחסנו את הדגימות לצביעה ב-4% PFA למשך 48 שעות ב-4°C.
   הערה: יש להחליף את ה-PFA מדי יום בנוזל טרי.
   1. לאחר 48 שעות, החליפו את ה-PFA ב-15% סוכרוז במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן לפחות 24 שעות לפני הטמעת הדגימות בקוביות פרפין. הצמדת דגימות קפואות מאוחסנות בטמפרטורה של -70°C.

תוצאות

ההצלחה של ניתוח איסכמיה יכולה להיות מאושרת באמצעות פרוטוקול זה על ידי אנגיוגרמה כלילית ועל ידי קביעת האזור ההיפוקינטי באמצעות אולטרסאונד טרנס-חזה (איור 1) לפני שממשיכים למסירת הגן. ניתן להעריך את מצב החסימה הכלילית על ידי אנגיוגרמה כלילית, והמיפוי האלקטרואנטומי מבטיח את ה...

Discussion

ניתן לשנות את נקודות הזמן של פרוטוקול זה בהתאם לווקטור הנגיפי בו נעשה שימוש. כמו כן, ניתן לבחור את הניתוחים האימונוהיסטולוגיים על פי הגן הטיפולי. ניתן גם להוסיף עוד נקודות זמן ונקודות קצה לפרוטוקול במידת הצורך.

פרוטוקול זה מורכב משלבים, שהם חיוניים להצלחה ובלתי אפשריים לתיק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips