Модель крупного животного для оценки эффективности генной терапии при ишемическом сердце

Резюме

Генная терапия миокарда при ишемической болезни сердца имеет большие перспективы для будущих терапевтических средств. Здесь мы представляем модель на больших животных для оценки эффективности генной терапии в ишемизированном сердце.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Несмотря на прогрессирование современных терапевтических средств, значительная часть пациентов с ишемической болезнью сердца остается симптоматической. Терапевтический ангиогенез, опосредованный генной терапией, предлагает новый терапевтический метод для улучшения перфузии миокарда и облегчения симптомов. Генная терапия различными ангиогенными факторами была изучена в нескольких клинических испытаниях. Благодаря новизне метода, прогресс генной терапии миокарда представляет собой непрерывный путь от скамьи до постели больного. Поэтому для оценки безопасности и эффективности необходимы модели на крупных животных. Чем больше модель крупных животных идентифицирует исходное заболевание и конечные точки, используемые в клиниках, тем более предсказуемы результаты клинических испытаний. Здесь мы представляем модель на большом животном для оценки эффективности генной терапии в ишемизированном сердце свиньи. Мы используем клинически значимые методы визуализации, такие как ультразвуковая визуализация и ¹⁵H₂O-PET. Для нацеливания переноса генов в нужную область используется электроанатомическое картирование. Целью этого метода является: (1) имитировать хроническую ишемическую болезнь сердца, (2) индуцировать терапевтический ангиогенез в гипоксических областях сердца и (3) оценить безопасность и эффективность генной терапии с использованием соответствующих конечных точек.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является причиной значительной доли смертности и бремени болезней во всем мире¹. Современные стратегии лечения включают чрескожные вмешательства, фармакологическое лечение и шунтирование². Однако, несмотря на прогрессирование этих современных терапевтических средств, многие пациенты страдают от так называемой рефрактерной стенокардии, что подчеркивает неудовлетворенную потребность в новых подходах к лечению³. Терапевтический ангиогенез, опосредованный генной терапией, может быть нацелен на эту группу пациентов.

Генная терапия миокарда чаще всего проводится с использованием различных вирусных векторов, чаще всего аденовируса с дефицитом репликации⁴. В качестве терапевтических генов используются различные ангиогенные факторы роста. Наиболее изученными ангиогенными факторами роста являются факторы роста эндотелия сосудов (VEGF), которые опосредуют их ангиогенную передачу сигналов через рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) и их корецепторы⁵. Несколько клинических испытаний доказали пользу и безопасность генной терапии сердца и сделали этот новый метод лечения реалистичным вариантом лечения ишемической болезни сердца ^6,7. Тем не менее, эта концепция все еще нуждается в улучшении терапевтических генов и вирусных векторов, подвергнутых тестированию на моделях крупных животных перед поступлением в клиники. Свинья часто используется в качестве лабораторного животного, так как ее сердце очень похоже на сердце человека. Размер сердечно-сосудистой системы свиньи позволяет использовать катетерные изобретения, аналогичные тем, которые используются у людей. Все методы визуализации, доступные для людей, могут быть использованы у свиней⁸.

Существует несколько моделей хронической ишемии на крупных животных. Чаще всего используется амероидный констриктор модели 9,10,11. Недостатком этого метода является инвазивность, так как торакотомия необходима для доступа к коронарной сосудистой сети. Ранее в нашей группе была разработана миниинвазивная модель узкого стента при хронической ишемии миокарда¹². Этот метод также используется в данной рукописи для индукции ишемии миокарда.

Удобство использования ультразвуковой визуализации существенно изменилось, несмотря на возраст метода визуализации. Например, штамм миокарда до сих пор в основном используется в исследованиях из-за его новизны. Деформация миокарда отражает изменения сократительной функции сердца лучше, чем традиционное измерение фракции выброса в М-режиме¹³. Таким образом, здесь, в модели крупного животного, используется измерение деформации миокарда. Чтобы оценить функцию сердца, сердечный выброс также измеряется с помощью киновизуализации левого желудочка во время ангиографии. Сердечный выброс измеряется как в состоянии покоя, так и при стрессе, вызванном добутамином, для оценки функции миокарда при стрессе.

В дополнение к измерениям функции сердца, информация о перфузии миокарда имеет важное значение в исследованиях генной терапии, направленных на терапевтический ангиогенез. В этой модели животных животные визуализируются с помощью позитронно-эмиссионной томографии с 15 О-метками (¹⁵H₂O-PET), поскольку это золотой стандарт измерения перфузии миокарда. ¹⁵ См.H₂O-PET был ранее валидирован для измерения перфузии ишемизированного сердца свиньи¹⁴.

Таким образом, упомянутые выше методы и модальности представляют собой прекрасную перспективу для оценки эффективности генной терапии при ишемизированном сердце.

протокол

Представленные здесь эксперименты проводятся с использованием домашних свиней в возрасте около 10 недель и одобрены Советом по экспериментам на животных в Финляндии. Животные весят 30-40 кг в начале протокола, что позволяет использовать то же процедурное оборудование и методы визуализации, что и люди. Хроническая ишемия индуцируется за 14 дней до переноса генов, а время наблюдения после переноса генов зависит от используемого вирусного вектора. Протокол исследования показан на рисунке 1. Этот протокол может быть использован для выполнения инъекций аденовирусной или AAV-опосредованной генной терапии. Время сбора образца должно быть скорректировано в соответствии с пиком экспрессии трансгена, который зависит от используемого вирусного вектора. Например, при выполнении переноса аденовирусных генов время сбора образца устанавливается равным 6 дням после переноса гена.

1. Медикаментозное лечение

1. Вводите суточную дозу 200 мг амиодарона и 2,5 мг бисопролола для предотвращения фатальных желудочковых аритмий. Прием препарата начинается за 1 неделю до операции по ишемии и продолжается ежедневно до последующего наблюдения.
2. Кроме того, вводят пероральные дозы клопидогрела (300 мг) и ацетилсалициловой кислоты (300 мг) животным за 1 день до операции по ишемии, чтобы предотвратить острый тромбоз в стенте после установки стента.
3. Вводят животным 100 мг лидокаина и 2,5 мл (246 мг/мл) MgSO₄ внутривенно в начале операции по ишемии для профилактики желудочковых аритмий.
4. Вводят внутримышечно цефуроксим (500 мг) в начале каждой операции для профилактики инфекции.
5. Вводят 30 мг эноксапарина внутривенно в начале операций по ишемии и подкожно после процедуры операции для профилактики тромбоза.
6. Для анестезии и обезболивания вводят 1,5 мл атропина, 6 мл азаперона (40 мг / мл), пропофола 20 мг / мл из расчета 15 мг / кг / ч и фентанил 50 мкг / мл из расчета 10 мкг / кг / ч. Дозировки препарата были одинаковыми для каждой свиньи. Обратитесь к местным рекомендациям по использованию животных для введения дозы.
7. Обезболивайте животных во время всех операций. Все операции должны проводиться в стерильной среде с использованием стерильной техники.

2. Трансторакальная эхокардиография

1. Выполняйте трансторакальную эхокардиографию перед операцией ишемии, переносом генов и эвтаназией, чтобы оценить любую обнаруживаемую перикардиальную жидкость и определить деформацию миокарда.
2. Поместите датчик в третье или четвертое межреберье под подмышкой свиньи, чтобы получить доступ к парастернальным видам короткой оси на уровне митрального клапана, папиллярной мышцы и апикальных уровнях (видео 1). Маркер датчика должен указывать на грудину свиньи. Чтобы сохранить клип, нажмите кнопку «Получить».

3. Эндоваскулярные операции под рентгеноскопическим контролем

1. Выполнение киновизуализации левого желудочка после коронарных ангиограмм перед операцией по ишемии, переноса генов и сбора тканей.
2. Подготовка к операции
   1. Подготовьтесь к операциям, успокоив свиней внутримышечным введением 1,5 мл атропина и 6 мл азаперона.
   2. После седации проводят общую анестезию пропофолом и фентанилом для ангиографических процедур свиньям в дозах 15 мг/кг/ч и 10 мкг/кг/ч соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свиньи находятся под наркозом на протяжении всей процедуры.
   3. Поддерживайте вентиляцию легких с помощью интубации и аппарата искусственной вентиляции легких и контролируйте жизненно важные физиологические параметры, такие как ЭКГ и параметры дыхания.
3. Размещение оболочки интродьюсера
   1. Поместите оболочку интродьюсера в правую бедренную артерию для всех операций в качестве стандартной практики в кардиологии. Используйте ультразвук для отслеживания бедренной артерии и прокалывания ее входной иглой (18 G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте оболочку интродьюсера 8F для переноса генов интрамиокарда и оболочку 6F для всех других операций. Введите направляющую проволоку оболочки через иглу, чтобы продеть нитку в артерию, и удерживайте проводник неподвижно, извлекая иглу.
   2. Вставьте оболочку интродьюсера вдоль направляющей проволоки, а когда она будет размещена, снимите направляющую проволоку и введите свинье 1,25 мг сублингвального динитрата, чтобы вызвать коронарную вазодилатацию.
4. Коронарография
   1. Выполняйте коронарографию непосредственно перед операцией по ишемии, переносу генов и сбору тканей. Оборудование, необходимое для ангиограммы, показано на рисунке 2.
   2. Используйте катетер 6F под рентгеноскопическим контролем с йодным контрастным веществом для визуализации правой коронарной артерии и левой восходящей коронарной артерии (видео 2).
5. Киновизуализация левого желудочка в состоянии покоя и стресс от добутамина
   1. Введите болюс контрастного вещества йода объемом 21 мл в левый желудочек через катетер с косичкой 5F с помощью автоинжектора. Сначала установите продолжительность болюса на уровне 3 с и общий объем на 21 мл. Затем нажмите «Одиночный» и «Да».
   2. Рассчитайте фракцию выброса с помощью измерительного программного обеспечения ангиографической рабочей станции. Чтобы выполнить расчет, выберите «Желудочковый анализ» рассматриваемого изображения. Прокрутите изображение, чтобы выбрать временной интервал, один в диастоле и один в систоле. Выберите инструмент, чтобы нарисовать контуры желудочков каждого временного интервала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение теперь вычисляет долю выброса и объем хода по методу Симпсона. Измерение фракции выброса проводится в состоянии покоя и при стрессе, вызванном добутамином.
6. Стресс-визуализация
   1. Дозируйте добутамин внутривенно в возрастающих дозах от 10 мкг / кг / мин до 20 мкг / кг / мин для стресс-визуализации, вызванной добутамином, до тех пор, пока не будет достигнута целевая частота сердечных сокращений 160 ударов в минуту. Затем выполните киносъемку.
7. Операция по ишемии
   1. Поместите стент с узким горлышком в левую коронарную артерию (LAD) за 14 дней до переноса гена, чтобы вызвать хроническую ишемию миокарда. После установки стента с узким горлышком проверьте, правильно ли установлен стент с узким горлышком, ограничивая коронарный кровоток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стент с узким горлышком помещается на дилатационный катетер и состоит из стента из голого металла, покрытого политетрафторэтиленовой трубкой, сформированной в форме бутылочного горлышка для уменьшения коронарного кровотока⁹.
8. Определение размера стента
   1. Выберите размер стента 3,0/3,5/4,0 x 8 мм в соответствии с размером левой восходящей коронарной артерии на ангиограмме с помощью программного обеспечения для автоматического измерения на ангиографической рабочей станции (Видео 3)¹².
9. Установка стента
   1. Поместите катушку в левую коронарную артерию и проведите стент с узким горлышком к LAD, поместив его дистально к первой диагонали.
   2. Надуйте стент до номинального давления в артерии с помощью индефлятора с соотношением стента к просвету 1,3, закрепив узкое место на месте. Еще через 15 секунд сдуйте стент и втяните оборудование из артерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите правильность размещения стента с узким горлышком с помощью ангиограммы.

4. ПЭТ-визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: За день до переноса генов выполните 15 ПЭТ/КТ с радиочастотой и стрессом ¹⁵О-меченых радиоводных ПЭТ/КТ (требуется больничная обстановка и радиологические техники).

1. Эталонная визуализация
   1. Выполняйте компьютерную томографию (КТ) перед отдыхом и стресс-томографией. Используйте информацию КТ для коррекции затухания.
2. ¹⁵ См.Радиоводная визуализация с меткой O
   1. Выполняйте визуализацию покоя и стресса с помощью болюса 800 МБк ¹⁵H₂O.
3. Стресс-визуализация
   1. Выполните стресс-томографию с помощью болюса с дальнейшим 800 МБк 15 O-водой после подходящего радиоактивного распада в течение ¹²минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гиперемия индуцируется аденозином (200 мкг/кг/мин внутривенно), как описано ранее¹².

5. Перенос генов

1. Электроанатомическое картирование
   1. Приступают к электроанатомическому картированию после коронарной ангиограммы и функциональных измерений (эхокардиография, кинотомография ЛЖ).
   2. Введите картирующий катетер в левый желудочек через бедренную оболочку под рентгеноскопическим контролем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зарегистрируйте около 100-150 точек вокруг левого желудочка с помощью картирующего катетера, чтобы создать электроанатомическую карту.
2. Доработка электроанатомической карты
   1. Удалите точки выбросов, чтобы обеспечить более надежную электроанатомическую карту левого желудочка.
   2. Сделайте это, выбрав «Обрезать плоскости» карты и удалив точки, которые отличаются от точек, образующих форму желудочка. Затем выберите «Траектории » для просмотра карты и удалите точки, которые перемещались по горизонтали во время регистрации точек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оставшиеся точки покрывают левый желудочек, и при необходимости зарегистрируйте больше точек.
3. Инъекции переноса генов
   1. Ввести инъекционный катетер интрамиокарда в левый желудочек через оболочку бедренной кости под рентгеноскопическим контролем. Установите длину инъекционной иглы на 3 мм.
4. Критерии для инъекций интрамиокарда
   1. Направляйте перенос генов с помощью системы электроанатомического картирования и нацеливайте инъекции в жизнеспособные, но гипокинетические области левого желудочка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для жизнеспособности используйте в качестве критерия униполярное напряжение более 5 мВ. При гипокинезии выберите локальное линейное укорочение (LLS) как можно ниже, по крайней мере, ниже 12%, но предпочтительно ниже 6%¹³.
5. Инъекции интрамиокарда
   1. В течение 30 с вводят векторный материал в точку отбора (этап 5.4) и держат инъекционную иглу внутри миокарда еще 5 с, прежде чем втянуть, чтобы предотвратить обратный поток в левый желудочек.

6. Эвтаназия и сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: После измерения коронарной ангиограммы и фракции выброса, описанных на этапах 3.4.1 и 3.5.2, соответственно, введите 50 мл насыщенного хлорида калия внутривенно анестезированной свинье.

1. Перфузионная фиксация сердца
   1. Заготавливают сердце из грудной полости. Смойте водой. Поместите иглу 18 G над аортальным клапаном и присоедините иглу к перфузионному насосу. Перфузируйте сердце 750 мл 1% параформальдегида (PFA).
2. Сбор образцов
   1. Нарежьте сердце ломтиками толщиной 1 см с помощью острого кухонного ножа. Соберите образцы из области переноса генов в 4% PFA и жидкий азот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить отрицательный контроль, соберите контрольный образец с задней стенки левого желудочка.
3. Сбор безопасных тканей
   1. Собирайте образцы из отдаленных тканей, таких как легкие, печень, почки, селезенка и яичники. Возьмите пробы на 4% PFA и жидкий азот.

7. Хранение образцов

1. Храните образцы для окрашивания в 4% PFA в течение 48 часов при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно заменяйте PFA свежей жидкостью.
   1. Через 48 ч замените PFA 15% сахарозой в деионизированной воде. Хранить не менее 24 ч перед заделкой образцов в парафиновые блоки. Замороженные образцы хранятся при температуре -70 °C.

Результаты

Успешность операции по удалению ишемии может быть подтверждена с помощью этого протокола коронарной ангиограммой и путем определения гипокинетической области с помощью трансторакального ультразвукового исследования (рис. 1) перед тем, как приступить к доставке генов....

Обсуждение

Временные точки этого протокола могут быть изменены в соответствии с используемым вирусным вектором. Кроме того, иммуногистологические анализы могут быть выбраны в соответствии с терапевтическим геном. При необходимости в протокол также можно добавить дополнительные временные точк?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips