Großtiermodell zur Evaluierung der Wirksamkeit der Gentherapie beim ischämischen Herzen

Zusammenfassung

Die myokardiale Gentherapie bei ischämischen Herzerkrankungen ist vielversprechend für zukünftige Therapeutika. Hier stellen wir ein Großtiermodell vor, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Herzen zu evaluieren.

Zusammenfassung

Die koronare Herzkrankheit ist weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Trotz der Progression der aktuellen Therapeutika bleibt ein beträchtlicher Teil der Patienten mit koronarer Herzkrankheit symptomatisch. Die Gentherapie-vermittelte therapeutische Angiogenese bietet eine neuartige therapeutische Methode zur Verbesserung der myokardialen Durchblutung und zur Linderung von Symptomen. Die Gentherapie mit verschiedenen angiogenen Faktoren wurde in wenigen klinischen Studien untersucht. Aufgrund der Neuartigkeit der Methode ist der Fortschritt der myokardialen Gentherapie ein kontinuierlicher Weg vom Labor bis zum Krankenbett. Daher werden Großtiermodelle benötigt, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu bewerten. Je besser das Großtiermodell die ursprüngliche Krankheit und die in den Kliniken verwendeten Endpunkte identifiziert, desto besser sind die Ergebnisse der klinischen Studien vorhersagbar. Hier stellen wir ein Großtiermodell vor, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Schweineherzen zu evaluieren. Wir verwenden klinisch relevante bildgebende Verfahren wie Ultraschall und ¹⁵_H2O-PET. Um die Gentransfers gezielt in den gewünschten Bereich zu bringen, wird elektroanatomisches Mapping verwendet. Das Ziel dieser Methode ist: (1) die Nachahmung der chronischen koronaren Herzkrankheit, (2) die Induktion einer therapeutischen Angiogenese an hypoxischen Herzarealen und (3) die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit der Gentherapie anhand relevanter Endpunkte.

Einleitung

Die koronare Herzkrankheit ist für den größten Teil der Sterblichkeit und Krankheitslast weltweit verantwortlich¹. Aktuelle Behandlungsstrategien sind perkutane Interventionen, pharmakologische Behandlung und Bypass-Chirurgie². Trotz des Fortschritts dieser aktuellen Therapeutika leiden jedoch viele Patienten an einer sogenannten refraktären Angina pectoris, was den ungedeckten Bedarf an neuartigen Behandlungsansätzen unterstreicht³. Gentherapie-vermittelte therapeutische Angiogenese könnte auf diese Patientengruppe abzielen.

Die myokardiale Gentherapie wird am häufigsten unter Verwendung verschiedener viraler Vektoren durchgeführt, am häufigsten mit replikationsdefizientem Adenovirus⁴. Als therapeutische Gene kommen verschiedene angiogene Wachstumsfaktoren zum Einsatz. Die am besten untersuchten angiogenen Wachstumsfaktoren sind die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGFs), die ihre angiogene Signalübertragung über vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktorrezeptoren (VEGFRs) und ihre Co-Rezeptoren vermitteln⁵. Mehrere klinische Studien haben den Nutzen und die Sicherheit der kardialen Gentherapie bewiesen und diese neuartige Behandlungsmethode zu einer realistischen Option für die Behandlung ischämischer Herzerkrankungen gemacht ^6,7. Dieses Konzept muss jedoch noch verbessert werden, um die therapeutischen Gene und viralen Vektoren zu verbessern, die in Großtiermodellen getestet werden, bevor sie in die Kliniken gelangen. Das Schwein wurde häufig als Versuchstier verwendet, da sein Herz dem menschlichen Herzen sehr ähnlich ist. Die Größe des Herz-Kreislauf-Systems eines Schweins erlaubt die Verwendung ähnlicher Kathetererfindungen, wie sie beim Menschen verwendet werden. Alle bildgebenden Verfahren, die dem Menschen zur Verfügung stehen, können bei Schweinen eingesetzt werden⁸.

Es gibt mehrere Großtiermodelle für chronische Ischämie. Am häufigsten wird das Ameroid-Constrictor-Modell 9,10,11 verwendet. Der Nachteil dieser Methode ist die Invasivität, da eine Thorakotomie erforderlich ist, um Zugang zu den koronaren Gefäßen zu erhalten. Zuvor wurde in unserer Arbeitsgruppe ein mini-invasives Engpass-Stentmodell für chronische Myokardischämie entwickelt¹². Diese Methode wird auch in diesem Manuskript verwendet, um eine myokardiale Ischämie zu induzieren.

Die Benutzerfreundlichkeit der Ultraschallbildgebung hat sich trotz des Alters der Bildgebungsmodalität erheblich weiterentwickelt. Zum Beispiel wird der Myokardstamm aufgrund seiner Neuartigkeit immer noch hauptsächlich in der Forschung eingesetzt. Die Myokardbelastung spiegelt Veränderungen in der kontraktilen Funktion des Herzens besser wider als die herkömmliche Messung der M-Mode-Ejektionsfraktion¹³. Daher wird hier im Großtiermodell die myokardiale Dehnungsmessung verwendet. Um die Funktion des Herzens zu beurteilen, wird das Herzzeitvolumen auch durch Cine-Bildgebung der linken Herzkammer während der Angiographie gemessen. Das Herzzeitvolumen wird sowohl in Ruhe als auch unter Dobutamin-induziertem Stress gemessen, um die Myokardfunktion unter Stress zu beurteilen.

Neben den Messungen der Herzfunktion sind Informationen über die myokardiale Perfusion in gentherapeutischen Studien zur therapeutischen Angiogenese unerlässlich. In diesem Tiermodell werden die Tiere mit ^einer15-O-markierten Radiowasser-Positronen-Emissions-Tomographie (¹⁵_H2O-PET) abgebildet, da dies der goldene Standard für die Messung der myokardialen Perfusion ist. ¹⁵_H2O-PET wurde bereits für die Messung der Perfusion von ischämischem Schweineherz^{validiert 14}.

Die oben genannten Methoden und Modalitäten stellen somit eine hervorragende Perspektive dar, um die Wirksamkeit der Gentherapie im ischämischen Herzen zu bewerten.

Protokoll

Die hier vorgestellten Experimente werden an etwa 10 Wochen alten weiblichen Hausschweinen durchgeführt und sind von der Tierversuchskommission in Finnland zugelassen. Die Tiere wiegen zu Beginn des Protokolls 30-40 kg, was die gleiche prozedurale Ausrüstung und Bildgebungsmodalitäten wie für den Menschen ermöglicht. Die chronische Ischämie wird 14 Tage vor dem Gentransfer induziert, und die Nachbeobachtungszeit nach dem Gentransfer hängt vom verwendeten viralen Vektor ab. Das Studienprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um adenovirale oder AAV-vermittelte Gentherapie-Injektionen durchzuführen. Der Zeitpunkt der Probenentnahme muss an den Transgenexpressionspeak angepasst werden, der vom verwendeten viralen Vektor abhängt. Zum Beispiel wird bei der Durchführung von adenoviralen Gentransfers der Zeitpunkt der Probenentnahme auf 6 Tage nach dem Gentransfer festgelegt.

1. Medikation

1. Verabreichen Sie eine Tagesdosis von 200 mg Amiodaron und 2,5 mg Bisoprolol, um tödliche ventrikuläre Arrhythmien zu verhindern. Die Medikation beginnt 1 Woche vor der Ischämie-Operation und wird täglich bis zur Nachuntersuchung fortgesetzt.
2. Zusätzlich sollten den Tieren 1 Tag vor der Ischämieoperation perorale Dosen von Clopidogrel (300 mg) und Acetylsalicylsäure (300 mg) verabreicht werden, um eine akute In-Stent-Thrombose nach dem Einsetzen des Stents zu verhindern.
3. Verabreichen Sie den Tieren zu Beginn der Ischämieoperation 100 mg Lidocain und 2,5 ml (246 mg/ml) MgSO₄ intravenös, um ventrikuläre Arrhythmien zu verhindern.
4. Verabreichen Sie zu Beginn jeder Operation eine intramuskuläre Injektion von Cefuroxim (500 mg) zur Infektionsprophylaxe.
5. Verabreichen Sie 30 mg Enoxaparin intravenös zu Beginn der Ischämieoperationen und subkutan nach dem Operationsverfahren zur Thromboseprophylaxe.
6. Für Anästhesie und Analgesie verabreichen Sie 1,5 ml Atropin, 6 ml Azaperon (40 mg/ml), Propofol 20 mg/ml mit einer Rate von 15 mg/kg/h und Fentanyl 50 μg/ml mit einer Rate von 10 μg/kg/h. Die Dosierung der Medikamente war für jedes Schwein gleich. Beachten Sie die örtlichen Richtlinien zur Verwendung von Tieren für die Verabreichung der Dosis.
7. Betäuben Sie die Tiere während aller Operationen. Alle Operationen sollten in einer sterilen Umgebung mit einer sterilen Technik durchgeführt werden.

2. Transthorakale Echokardiographie

1. Führen Sie vor einer Ischämieoperation, einem Gentransfer und einer Euthanasie eine transthorakale Echokardiographie durch, um nachweisbare Perikardflüssigkeit zu beurteilen und die Myokardbelastung zu bestimmen.
2. Platzieren Sie den Schallkopf im dritten oder vierten Interkostalraum unter der Achselhöhle des Schweins, um parasternale Kurzachsenansichten auf Höhe der Mitralklappe, des Papillarmuskels und der apikalen Ebene zu erhalten (Video 1). Die Markierung des Schallkopfs sollte auf das Brustbein des Schweins zeigen. Um einen Clip zu speichern, drücken Sie die Taste "Erfassen".

3. Endovaskuläre Operationen unter Durchleuchtungskontrolle

1. Führen Sie eine Bildgebung des linken Ventrikels nach Koronarangiogrammen vor einer Ischämieoperation, einem Gentransfer und einer Gewebeentnahme durch.
2. Vorbereitung der Operation
   1. Bereiten Sie sich auf die Operationen vor, indem Sie die Schweine mit einer intramuskulären Injektion von 1,5 ml Atropin und 6 ml Azaperon sedieren.
   2. Nach der Sedierung ist bei den Schweinen eine allgemeine Propofol- und Fentanyl-Anästhesie für die angiographischen Eingriffe mit Dosen von 15 mg/kg/h bzw. 10 μg/kg/h einzuleiten.
      HINWEIS: Die Schweine werden während des gesamten Eingriffs betäubt.
   3. Unterstützen Sie die Beatmung durch Intubation und Beatmung und überwachen Sie die physiologischen Vitalparameter wie EKG und Atemparameter.
3. Platzierung des Einführmantels
   1. Platzieren Sie eine Einführschleuse in die rechte Oberschenkelarterie für alle Operationen, wie es in der Kardiologie üblich ist. Verfolgen Sie die Oberschenkelarterie mit Ultraschall und stechen Sie sie mit einer Eintrittsnadel (18 G) ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine 8F-Einführschleuse für intramyokardiale Gentransfers und eine 6F-Schleuse für alle anderen Operationen. Führen Sie den Führungsdraht der Scheide durch die Nadel ein, um die Arterie einzufädeln, und halten Sie den Führungsdraht ruhig, während Sie die Nadel entfernen.
   2. Führen Sie die Einführschleuse entlang des Führungsdrahtes ein, entfernen Sie den Führungsdraht und verabreichen Sie dem Schwein 1,25 mg sublinguales Dinitrat, um eine koronare Vasodilatation zu induzieren.
4. Koronarangiografie
   1. Führen Sie eine Koronarangiografie direkt vor der Ischämie-Operation, dem Gentransfer und der Gewebeentnahme durch. Die für die Angiogramme benötigte Maschinerie ist in Abbildung 2 dargestellt.
   2. Verwenden Sie einen 6F-Katheter unter Durchleuchtungskontrolle mit einem Jodkontrastmittel, um die rechte Koronararterie und die linke aufsteigende Koronararterie darzustellen (Video 2).
5. Bildgebung des linken Ventrikels unter Ruhe und Dobutaminbelastung
   1. Verabreichen Sie einen 21-ml-Bolus Jodkontrastmittel über einen 5F-Pigtail-Katheter mit einem Autoinjektor in die linke Herzkammer. Stellen Sie zunächst die Bolusdauer auf 3 s und das Gesamtvolumen auf 21 ml ein. Drücken Sie dann Single und Ja.
   2. Berechnen Sie die Ejektionsfraktion mit der Messsoftware des angiographischen Arbeitsplatzes. Um die Berechnung durchzuführen, wählen Sie Ventrikuläre Analyse des betreffenden Bildes. Scrollen Sie durch das Bild, um einen Zeitrahmen auszuwählen, einen in der Diastole und einen in der Systole. Wählen Sie ein Werkzeug aus, um ventrikuläre Umrisse für jeden Zeitrahmen zu zeichnen.
      HINWEIS: Die Software berechnet jetzt die Auswurffraktion und das Hubvolumen nach der Simpson-Methode. Die Messung der Ejektionsfraktion erfolgt in Ruhe und unter Dobutamin-induziertem Stress.
6. Belastungs-Bildgebung
   1. Dosis Dobutamin intravenös in ansteigenden Dosen von 10 μg/kg/min bis 20 μg/kg/min für die Dobutamin-induzierte Stressbildgebung, bis die Zielherzfrequenz von 160 Schlägen pro Minute erreicht ist. Führen Sie dann die Cine-Bildgebung durch.
7. Ischämie-Operation
   1. Platzieren Sie 14 Tage vor dem Gentransfer einen Engpass-Stent in die linke Koronararterie (LAD), um eine chronische Myokardischämie zu induzieren. Prüfen Sie nach dem Einsetzen des Engpass-Stents, ob der Engpass-Stent richtig platziert ist und den koronaren Blutfluss einschränkt.
      HINWEIS: Der Flaschenhals-Stent wird auf einen Dilatationskatheter gelegt und besteht aus einem Bare-Metal-Stent, der von einem Polytetrafluorethylen-Röhrchen bedeckt ist, das in Flaschenhalsform ausgebildet ist, um den koronaren Blutfluss^{zu reduzieren 9}.
8. Festlegen der Stentgröße
   1. Wählen Sie die Größe des Stents, entweder 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, entsprechend der Größe der linken aufsteigenden Koronararterie im Angiogramm, indem Sie die automatische Messsoftware am angiographischen Arbeitsplatz verwenden (Video 3)¹².
9. Platzierung von Stents
   1. Platzieren Sie eine Spule an der linken Koronararterie und gleiten Sie den Flaschenhals-Stent zum LAD, wobei Sie ihn distal zur ersten Diagonalen platzieren.
   2. Pumpen Sie den Stent mit einem In-Deflator mit einem Stent-Lumen-Verhältnis von 1,3 auf Nenndruck in der Arterie auf und verankern Sie den Flaschenhals. Lassen Sie nach weiteren 15 s die Luft aus dem Stent ab und ziehen Sie das Gerät aus der Arterie zurück.
      HINWEIS: Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Engpass-Stents durch ein Angiogramm.

4. PET-Bildgebung

HINWEIS: Führen Sie einen Tag vor dem Gentransfer ¹⁵O-markierte Radiowasser-PET/CT-Scans durch (erfordert Krankenhausumgebung und radiologische Techniker).

1. Referenz-Bildgebung
   1. Führen Sie Computertomographien (CT) vor Ruhe- und Belastungsbildgebungen durch. Verwenden Sie die CT-Informationen zur Dämpfungskorrektur.
2. ¹⁵O-markierte Radiowasser-Bildgebung
   1. Führen Sie eine Ruhe- und Stressbildgebung mit einem 800 MBq ¹⁵H₂O Bolus durch.
3. Belastungs-Bildgebung
   1. Führen Sie eine Stressbildgebung mit einem weiteren 800 MBq 15 O-Wasser-Bolus nach einem geeigneten radioaktiven Zerfall von ¹²min durch.
      HINWEIS: Hyperämie wird durch Adenosin (200 μg/kg/min intravenös) induziert, wie zuvor beschrieben¹².

5. Gentransfer

1. Elektroanatomische Kartierung
   1. Fahren Sie mit der elektroanatomischen Kartierung nach einem Koronarangiogramm und funktionellen Messungen (Echokardiographie, LV-Cine-Bildgebung) fort.
   2. Ein Kartierungskatheter wird über die Femurschleuse unter fluoroskopischer Führung in den linken Ventrikel eingeführt.
      HINWEIS: Registrieren Sie mit dem Kartierungskatheter etwa 100-150 Punkte um den linken Ventrikel herum, um die elektroanatomische Karte zu erstellen.
2. Fertigstellung der elektroanatomischen Karte
   1. Löschen Sie die Ausreißerpunkte, um eine zuverlässigere elektroanatomische Karte des linken Ventrikels zu gewährleisten.
   2. Wählen Sie dazu die Option Ebenen der Karte ausschneiden aus, und löschen Sie die Punkte, die sich von den Punkten unterscheiden, die die ventrikuläre Form bilden. Wählen Sie als Nächstes Trajektorien für die Kartenansicht aus, und löschen Sie die Punkte, die während der Punktregistrierung horizontal zurückgelegt wurden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Punkte den linken Ventrikel abdecken, und registrieren Sie bei Bedarf weitere Punkte.
3. Gentransfer-Injektionen
   1. Ein intramyokardialer Injektionskatheter wird über die Hüftschleuse unter Durchleuchtungskontrolle in die linke Herzkammer eingeführt. Stellen Sie die Länge der Injektionsnadel auf 3 mm ein.
4. Kriterien für intramyokardiale Injektionen
   1. Führen Sie die Gentransfers durch ein elektroanatomisches Kartierungssystem und zielen Sie die Injektionen gezielt in lebensfähige, aber hypokinetische Bereiche des linken Ventrikels ab.
      Anmerkungen: Verwenden Sie für die Durchführbarkeit eine unipolare Spannung über 5 mV als Kriterium. Wählen Sie bei Hypokinesie eine lokale lineare Verkürzung (LLS) so niedrig wie möglich, mindestens unter 12 %, vorzugsweise aber unter 6 %¹³.
5. Intramyokardiale Injektionen
   1. Injizieren Sie das Vektormaterial während 30 s in den Auswahlpunkt (Schritt 5.4) und halten Sie die Injektionsnadel weitere 5 s im Myokard, bevor Sie sie zurückziehen, um einen Rückfluss in die linke Herzkammer zu verhindern.

6. Euthanasie und Probenentnahme

HINWEIS: Nach den in den Schritten 3.4.1 bzw. 3.5.2 beschriebenen Messungen des Koronarangiogramms und der Ejektionsfraktion sind dem anästhesierten Schwein 50 ml gesättigtes Kaliumchlorid intravenös zu verabreichen.

1. Perfusionsfixierung des Herzens
   1. Ernte das Herz aus der Brusthöhle. Mit Wasser abspülen. Setzen Sie eine 18-G-Nadel über die Aortenklappe und befestigen Sie die Nadel an einer Perfusionspumpe. Perfundierten Sie das Herz mit 750 ml 1%igem Paraformaldehyd (PFA).
2. Musterkollektion
   1. Das Herz mit einem scharfen Küchenmesser in 1 cm dicke Scheiben schneiden. Sammeln Sie die Proben aus dem Gentransferbereich in 4% PFA und flüssigen Stickstoff.
      HINWEIS: Um Negativkontrollen zu entnehmen, entnehmen Sie eine Kontrollprobe aus der hinteren Wand des linken Ventrikels.
3. Entnahme von Sicherheitstüchern
   1. Entnahme von Proben aus entfernten Geweben wie Lunge, Leber, Niere, Milz und Eierstöcken. Proben mit 4 % PFA und flüssigem Stickstoff.

7. Lagerung von Proben

1. Lagern Sie die Proben zur Färbung in 4 % PFA für 48 h bei 4 °C.
   Anmerkungen: Ersetzen Sie die PFA täglich durch eine frische Flüssigkeit.
   1. Ersetzen Sie nach 48 Stunden die PFA durch 15%ige Saccharose in deionisiertem Wasser. Mindestens 24 Stunden lagern, bevor die Proben in Paraffinblöcke eingebettet werden. Schnappgefrorene Proben werden bei -70 °C gelagert.

Ergebnisse

Der Erfolg der Ischämieoperation kann mit diesem Protokoll durch ein Koronarangiogramm und durch die Bestimmung des hypokinetischen Bereichs durch transthorakalen Ultraschall (Abbildung 1) bestätigt werden, bevor mit der Genabgabe fortgefahren wird. Der Zustand des Koronarverschlusses kann durch ein Koronarangiogramm beurteilt werden, und die elektroanatomische Kartierung stellt die ischämischen und überwinternden Bereiche sicher.

Die Wirksamkeit der Gentherap...

Diskussion

Die Zeitpunkte dieses Protokolls können je nach verwendetem viralen Vektor geändert werden. Auch die immunhistologischen Analysen können entsprechend dem therapeutischen Gen ausgewählt werden. Es ist auch möglich, dem Protokoll bei Bedarf weitere Zeitpunkte und Endpunkte hinzuzufügen.

Dieses Protokoll besteht aus Phasen, die für den Erfolg unerlässlich sind und die im Nachhinein nicht mehr korrigiert werden können. Erstens, wenn es nicht gelingt, eine angemessene Ischämie herbeizufü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips