Modèle grand animal pour évaluer l’efficacité de la thérapie génique dans le cœur ischémique

Résumé

La thérapie génique myocardique pour les cardiopathies ischémiques est très prometteuse pour les thérapies futures. Ici, nous introduisons un grand modèle animal pour évaluer l’efficacité de la thérapie génique dans le cœur ischémique.

Résumé

La maladie coronarienne est l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. Malgré la progression des traitements actuels, une proportion considérable de patients atteints de coronaropathie restent symptomatiques. L’angiogenèse thérapeutique médiée par thérapie génique offre une nouvelle méthode thérapeutique pour améliorer la perfusion myocardique et soulager les symptômes. La thérapie génique avec différents facteurs angiogéniques a été étudiée dans quelques essais cliniques. En raison de la nouveauté de la méthode, les progrès de la thérapie génique myocardique sont un chemin continu du laboratoire au chevet du patient. Par conséquent, de grands modèles animaux sont nécessaires pour évaluer l’innocuité et l’efficacité. Plus le modèle du grand animal identifie la maladie d’origine et les paramètres utilisés dans les cliniques, plus les résultats des essais cliniques sont prévisibles. Ici, nous introduisons un grand modèle animal pour évaluer l’efficacité de la thérapie génique dans le cœur porcin ischémique. Nous utilisons des méthodes d’imagerie cliniquement pertinentes telles que l’imagerie par ultrasons et ¹⁵H₂O-PET. Pour cibler les transferts de gènes dans la zone souhaitée, une cartographie électroanatomique est utilisée. L’objectif de cette méthode est : (1) d’imiter la maladie coronarienne chronique, (2) d’induire une angiogenèse thérapeutique dans les zones hypoxiques du cœur et (3) d’évaluer l’innocuité et l’efficacité de la thérapie génique en utilisant des critères d’évaluation pertinents.

Introduction

La maladie coronarienne est responsable de la grande proportion de la mortalité et de la charge de morbidité dans le monde¹. Les stratégies de traitement actuelles sont les interventions percutanées, le traitement pharmacologique et le pontage^{coronarien 2}. Cependant, malgré la progression de ces thérapies actuelles, de nombreux patients souffrent d’angine dite réfractaire, soulignant le besoin non satisfait de nouvelles approches thérapeutiques³. L’angiogenèse thérapeutique médiée par la thérapie génique pourrait cibler ce groupe de patients.

La thérapie génique myocardique est le plus souvent administrée en utilisant différents vecteurs viraux, le plus souvent des adénovirus^{déficients en} réplication 4. En tant que gènes thérapeutiques, divers facteurs de croissance angiogéniques sont utilisés. Les facteurs de croissance angiogénique les plus étudiés sont les facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) qui interviennent dans leur signalisation angiogénique par les récepteurs du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR) et leurs corécepteurs⁵. Plusieurs essais cliniques ont prouvé les avantages et l’innocuité de la thérapie génique cardiaque et ont fait de cette nouvelle méthode de traitement une option réaliste pour le traitement des cardiopathies ischémiques ^6,7. Cependant, ce concept nécessite encore une amélioration des gènes thérapeutiques et des vecteurs viraux mis à l’épreuve dans de grands modèles animaux avant d’entrer dans les cliniques. Le porc a été fréquemment utilisé comme animal de laboratoire car son cœur est très similaire au cœur humain. La taille du système cardiovasculaire d’un porc permet l’utilisation d’inventions de cathéter similaires à celles utilisées chez l’homme. Toutes les modalités d’imagerie disponibles pour l’homme peuvent être utilisées chez les porcs⁸.

Il existe plusieurs grands modèles animaux pour l’ischémie chronique. Le plus couramment utilisé est le modèle constricteur amérioïde 9,10,11. L’inconvénient de cette méthode est le caractère invasif puisque la thoracotomie est nécessaire pour accéder au système vasculaire coronaire. Auparavant, dans notre groupe, un modèle de stent mini-invasif pour l’ischémie myocardique chronique a été développé¹². Cette méthode est également utilisée dans ce manuscrit pour induire une ischémie myocardique.

La facilité d’utilisation de l’imagerie par ultrasons a considérablement évolué malgré l’âge de la modalité d’imagerie. Par exemple, la souche myocardique est encore principalement utilisée dans la recherche en raison de sa nouveauté. La déformation myocardique reflète mieux les changements dans la fonction contractile du cœur que la mesure traditionnelle de la fraction d’éjection en mode M¹³. Ainsi, ici dans le modèle grand animal, la mesure de la déformation myocardique est utilisée. Pour évaluer la fonction du cœur, le débit cardiaque est également mesuré par imagerie cinée du ventricule gauche pendant l’angiographie. Le débit cardiaque est mesuré à la fois au repos et sous stress induit par la dobutamine pour évaluer la fonction myocardique sous stress.

En plus des mesures de la fonction cardiaque, l’information sur la perfusion myocardique est essentielle dans les études de thérapie génique visant l’angiogenèse thérapeutique. Dans ce modèle animal, les animaux sont imagés avec 15 tomographies par émission de positrons radio-eau marquées O (¹⁵H₂O-PET) car il s’agit de l’étalon-or pour mesurer la perfusion myocardique. ¹⁵H2O-PET a déjà été validé pour la mesure de la perfusion du cœur porcin ischémique¹⁴.

Ainsi, les méthodes et modalités mentionnées ci-dessus constituent une excellente perspective pour évaluer l’efficacité de la thérapie génique dans le cœur ischémique.

Protocole

Les expériences présentées ici sont réalisées sur des porcs domestiques femelles âgés d’environ 10 semaines et sont approuvées par le Conseil de l’expérimentation animale en Finlande. Les animaux pèsent entre 30 et 40 kg au début du protocole, ce qui permet aux humains de bénéficier des mêmes équipements procéduraux et modalités d’imagerie que possible. L’ischémie chronique est induite 14 jours avant le transfert de gène, et le temps de suivi après le transfert de gène dépend du vecteur viral utilisé. Le protocole de l’étude est illustré à la figure 1. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des injections de thérapie génique adénovirale ou médiée par AAV. Le moment du prélèvement de l’échantillon doit être ajusté au pic d’expression du transgène, qui dépend du vecteur viral utilisé. Par exemple, lors de l’exécution de transferts de gènes adénoviraux, l’heure du prélèvement de l’échantillon est fixée à 6 jours après le transfert de gènes.

1. Médicaments

1. Administrer une dose quotidienne de 200 mg d’amiodarone et 2,5 mg de bisoprolol pour prévenir les arythmies ventriculaires mortelles. Le médicament commence 1 semaine avant l’opération d’ischémie et est poursuivi quotidiennement jusqu’au suivi.
2. En outre, administrer des doses perorales de clopidogrel (300 mg) et d’acide acétylsalicylique (300 mg) aux animaux 1 jour avant l’opération d’ischémie pour prévenir la thrombose aiguë dans le stent après la pose de l’endoprothèse.
3. Administrer 100 mg de lidocaïne et 2,5 mL de (246 mg/mL) de_MgSO4 par voie intraveineuse aux animaux au début de l’opération d’ischémie pour prévenir les arythmies ventriculaires.
4. Administrer une injection intramusculaire de céfuroxime (500 mg) au début de chaque opération pour la prophylaxie de l’infection.
5. Administrer 30 mg d’énoxaparine par voie intraveineuse au début des opérations d’ischémie et par voie sous-cutanée après la procédure opératoire pour la prévention de la thrombose.
6. Pour l’anesthésie et l’analgésie, administrer 1,5 mL d’atropine, 6 mL d’azapérone (40 mg/mL), 20 mg/mL de propofol, à raison de 15 mg/kg/h, et 50 μg/mL de fentanyl à raison de 10 μg/kg/h. Les doses de médicament étaient les mêmes pour chaque porc. Consulter les lignes directrices locales sur l’utilisation des animaux pour l’administration de la dose.
7. Anesthésier les animaux pendant toutes les opérations. Toutes les opérations doivent être effectuées dans un environnement stérile en utilisant une technique stérile.

2. Échocardiographie transthoracique

1. Effectuer une échocardiographie transthoracique avant l’opération d’ischémie, le transfert de gènes et l’euthanasie pour évaluer tout liquide péricardique détectable et déterminer la souche myocardique.
2. Placez le transducteur dans le troisième ou quatrième espace intercostal sous l’aisselle du porc pour accéder aux vues parasternales à axe court au niveau de la valve mitrale, du muscle papillaire et de l’apical (vidéo 1). Le marqueur du transducteur doit pointer vers le sternum du porc. Pour enregistrer un clip, appuyez sur Acquérir.

3. Opérations endovasculaires sous guidage fluoroscopique

1. Effectuer l’imagerie du cinciné du ventricule gauche après des angiogrammes coronaires avant l’opération d’ischémie, le transfert de gènes et le prélèvement de tissus.
2. Préparation de l’opération
   1. Préparez-vous aux opérations en sédatif les porcs avec une injection intramusculaire de 1,5 mL d’atropine et de 6 mL d’azapérone.
   2. Après la sédation, induire une anesthésie générale au propofol et au fentanyl pour les procédures angiographiques chez les porcs avec des doses de 15 mg / kg / h et 10 μg / kg / h, respectivement.
      REMARQUE: Les porcs sont anesthésiés pendant toute la procédure.
   3. Soutenir la ventilation par intubation et ventilateur et surveiller les paramètres physiologiques vitaux, tels que l’ECG et les paramètres respiratoires.
3. Placement de la gaine d’introduction
   1. Placez une gaine d’introduction dans l’artère fémorale droite pour toutes les opérations comme pratique standard en cardiologie. Utilisez des ultrasons pour suivre l’artère fémorale et percez-la avec une aiguille d’entrée (18 G).
      REMARQUE: Utilisez une gaine d’introduction 8F pour les transferts de gènes intramyocardiques et une gaine 6F pour toutes les autres opérations. Introduisez le fil guide de la gaine à travers l’aiguille pour enfiler l’artère et maintenez le fil guide immobile tout en retirant l’aiguille.
   2. Insérez la gaine d’introduction le long du fil guide et, une fois placé, retirez le fil guide et administrez 1,25 mg de dinitrate sublingual au porc pour induire une vasodilatation coronaire.
4. Angiographie coronarienne
   1. Effectuer une angiographie coronarienne directement avant l’opération d’ischémie, le transfert de gènes et la collecte de tissus. La machinerie nécessaire pour les angiographies est représentée à la figure 2.
   2. Utilisez un cathéter 6F sous guidage fluoroscopique avec un agent de contraste iodé pour imager l’artère coronaire droite et l’artère coronaire ascendante gauche (vidéo 2).
5. Imagerie du ciné du ventricule gauche au repos et stress à la dobutamine
   1. Administrer un bolus de 21 mL d’agent de contraste iodé dans le ventricule gauche à l’aide d’un cathéter 5F en queue de cochon à l’aide d’un auto-injecteur. Tout d’abord, réglez la durée du bolus à 3 s et le volume total pour 21 mL. Ensuite, appuyez sur Single et Yes.
   2. Calculer la fraction d’éjection par le logiciel de mesure du poste de travail angiographique. Pour effectuer le calcul, sélectionnez Analyse ventriculaire de l’image en question. Faites défiler l’image pour sélectionner une période, une en diastole et une en systole. Sélectionnez un outil pour dessiner les contours ventriculaires de chaque période.
      REMARQUE: Le logiciel calcule maintenant la fraction d’éjection et le volume de course par la méthode de Simpson. La mesure de la fraction d’éjection est effectuée pendant le repos et sous contrainte induite par la dobutamine.
6. Imagerie du stress
   1. Administrer la dobutamine par voie intraveineuse à des doses croissantes de 10 μg/kg/min à 20 μg/kg/min pour l’imagerie du stress induite par la dobutamine jusqu’à ce que la fréquence cardiaque cible de 160 bpm soit atteinte. Ensuite, effectuez l’imagerie cinématographique.
7. Opération de l’ischémie
   1. Placez un stent goulot d’étranglement dans l’artère coronaire gauche (DAL) 14 jours avant le transfert de gène pour induire une ischémie myocardique chronique. Après la mise en place de l’endoprothèse goulotte, vérifiez si l’endoprothèse goulot est placée correctement, limitant ainsi le flux sanguin coronaire.
      REMARQUE: L’endoprothèse goulot est placée sur un cathéter de dilatation et consiste en une endoprothèse métallique nue recouverte d’un tube en polytétrafluoroéthylène formé en forme de goulot d’étranglement pour réduire le flux sanguin coronaire⁹.
8. Définition de la taille du stent
   1. Choisissez la taille de l’endoprothèse, soit 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, en fonction de la taille de l’artère coronaire ascendante gauche dans l’angiographie en utilisant le logiciel de mesure automatique du poste de travail angiographique (vidéo 3)¹².
9. Pose de l’endoprothèse
   1. Placez une bobine sur l’artère coronaire gauche et faites glisser l’endoprothèse goulot vers le DAL, en la plaçant distalement à la première diagonale.
   2. Gonfler l’endoprothèse à la pression nominale dans l’artère à l’aide d’un déflateur avec un rapport stent/lumen de 1,3, en ancrant le goulot d’étranglement en place. Après 15 s supplémentaires, dégonflez l’endoprothèse et retirez l’équipement de l’artère.
      REMARQUE: Confirmer l’emplacement correct de l’endoprothèse goulot par angiographie.

4. Imagerie TEP

REMARQUE: Un jour avant le transfert de gène, effectuez ¹⁵TEP / TDM radio-marquées O marquées (nécessite l’environnement hospitalier et des techniciens en radiologie).

1. Imagerie de référence
   1. Effectuer des tomodensitogrammes (TDM) avant le repos et l’imagerie du stress. Utilisez les informations CT pour la correction de l’atténuation.
2. ¹⁵Imagerie radioeau marquée O
   1. Effectuez une imagerie du repos et du stress à l’aide d’un bolus de 800 MBq ¹⁵H₂O.
3. Imagerie du stress
   1. Effectuer une imagerie de contrainte avec un bolus d’eau O supplémentaire de 800 MBq 15 après une désintégration radioactive appropriée de ¹²min.
      NOTE: L’hyperémie est induite par l’adénosine (200 μg / kg / min par voie intraveineuse), comme décrit précédemment¹².

5. Transfert de gènes

1. Cartographie électroanatomique
   1. Procéder à la cartographie électroanatomique après une angiographie coronaire et des mesures fonctionnelles (échocardiographie, imagerie cinématographique BT).
   2. Introduire un cathéter de cartographie dans le ventricule gauche via une gaine fémorale dans le guidage fluoroscopique.
      REMARQUE: Enregistrez environ 100-150 points autour du ventricule gauche avec le cathéter de cartographie pour créer la carte électroanatomique.
2. Terminer la carte électroanatomique
   1. Supprimer les points aberrants pour assurer une carte électroanatomique plus fiable du ventricule gauche.
   2. Pour ce faire, sélectionnez Clip Planes de la carte et supprimez les points qui diffèrent des points formant la forme ventriculaire. Ensuite, sélectionnez Trajectoires pour la vue cartographique et supprimez les points qui ont parcouru horizontalement lors de l’enregistrement des points.
      REMARQUE: Assurez-vous que les points restants couvrent le ventricule gauche et enregistrez plus de points si nécessaire.
3. Injections de transfert de gènes
   1. Introduire un cathéter d’injection intramyocardique dans le ventricule gauche via la gaine fémorale sous guidage fluoroscopique. Réglez la longueur de l’aiguille d’injection sur 3 mm.
4. Critères pour les injections intramyocardiques
   1. Guider les transferts de gènes par système de cartographie électroanatomique et cibler les injections dans les zones viables mais hypokinétiques du ventricule gauche.
      REMARQUE: Pour la viabilité, utilisez une tension unipolaire supérieure à 5 mV comme critère. Pour l’hypokinésie, choisir un raccourcissement linéaire local (LLS) aussi bas que possible, au moins inférieur à 12% mais de préférence inférieur à 6^%13.
5. Injections intramyocardiques
   1. Pendant 30 s, injecter le matériau vecteur au point de sélection (étape 5.4) et maintenir l’aiguille d’injection à l’intérieur du myocarde pendant 5 s supplémentaires avant de se rétracter pour éviter le reflux vers le ventricule gauche.

6. Euthanasie et prélèvement d’échantillons

REMARQUE : Après l’angiographie coronaire et les mesures de la fraction d’éjection décrites aux étapes 3.4.1 et 3.5.2, respectivement, administrer 50 mL de chlorure de potassium saturé par voie intraveineuse au porc anesthésié.

1. Fixation par perfusion du cœur
   1. Récoltez le cœur de la cavité thoracique. Rincer à l’eau. Placez une aiguille de 18 G au-dessus de la valve aortique et fixez l’aiguille à une pompe de perfusion. Perfuser le cœur avec 750 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 1 %.
2. Prélèvement d’échantillons
   1. Trancher le cœur en tranches de 1 cm d’épaisseur à l’aide d’un couteau de cuisine tranchant. Prélever les échantillons de la zone de transfert de gènes dans 4% PFA et azote liquide.
      REMARQUE : Pour prélever des témoins négatifs, prélever un échantillon témoin sur la paroi postérieure du ventricule gauche.
3. Collecte de tissus de sécurité
   1. Prélever des échantillons dans des tissus éloignés, tels que les poumons, le foie, les reins, la rate et les ovaires. Prélever des échantillons dans 4 % de PFA et d’azote liquide.

7. Stockage des échantillons

1. Conserver les échantillons pour les colorer dans du PFA à 4 % pendant 48 h à 4 °C.
   REMARQUE: Remplacez le PFA quotidiennement par un liquide frais.
   1. Après 48 h, remplacer le PFA par 15% de saccharose dans de l’eau désionisée. Conserver pendant au moins 24 heures avant d’incorporer les échantillons dans des blocs de paraffine. Les échantillons congelés sont conservés à -70 °C.

Résultats

Le succès de l’opération d’ischémie peut être confirmé par ce protocole par angiographie coronaire et par détermination de la zone hypokinétique par échographie transthoracique (Figure 1) avant de procéder à l’administration du gène. L’état de l’occlusion coronaire peut être évalué par angiographie coronaire, et la cartographie électroanatomique assure les zones ischémique et hibernante.

L’efficacité de la thérapie génique peut êtr...

Discussion

Les points temporels de ce protocole peuvent être modifiés en fonction du vecteur viral utilisé. Aussi, les analyses immunohistologiques peuvent être sélectionnées en fonction du gène thérapeutique. Il est également possible d’ajouter d’autres points de temps et points de terminaison au protocole si nécessaire.

Ce protocole comporte des étapes, essentielles pour réussir et impossibles à corriger par la suite. Premièrement, si l’on ne parvient pas à provoquer une ischémie ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips