Modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico

Riepilogo

La terapia genica miocardica per la cardiopatia ischemica è molto promettente per le terapie future. Qui, introduciamo un grande modello animale per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico.

Abstract

La malattia coronarica è una delle cause significative di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Nonostante la progressione delle attuali terapie, una percentuale considerevole di pazienti con malattia coronarica rimane sintomatica. L'angiogenesi terapeutica mediata dalla terapia genica offre un nuovo metodo terapeutico per migliorare la perfusione miocardica e alleviare i sintomi. La terapia genica con diversi fattori angiogenici è stata studiata in pochi studi clinici. A causa della novità del metodo, il progresso della terapia genica miocardica è un percorso continuo dal banco al letto del paziente. Pertanto, sono necessari modelli animali di grandi dimensioni per valutare la sicurezza e l'efficacia. Più il grande modello animale identifica la malattia originale e gli endpoint utilizzati nelle cliniche, più i risultati prevedibili sono dagli studi clinici. Qui, presentiamo un grande modello animale per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore suino ischemico. Utilizziamo metodi di imaging clinicamente rilevanti come l'ecografia e l'O-PET ¹⁵H₂. Per indirizzare i trasferimenti genici nell'area desiderata, viene utilizzata la mappatura elettroanatomica. Lo scopo di questo metodo è: (1) imitare la malattia coronarica cronica, (2) indurre l'angiogenesi terapeutica nelle aree ipossiche del cuore e (3) valutare la sicurezza e l'efficacia della terapia genica utilizzando endpoint rilevanti.

Introduzione

La malattia coronarica è responsabile della vasta percentuale di mortalità e carico di malattia in tutto il mondo¹. Le attuali strategie di trattamento sono interventi percutanei, trattamento farmacologico e chirurgia di bypass². Tuttavia, nonostante la progressione di queste attuali terapie, molti pazienti soffrono della cosiddetta angina refrattaria, sottolineando il bisogno insoddisfatto di nuovi approcci terapeutici³. L'angiogenesi terapeutica mediata dalla terapia genica potrebbe colpire questo gruppo di pazienti.

La terapia genica miocardica viene spesso somministrata utilizzando diversi vettori virali, più comunemente^{adenovirus 4} carente di replicazione. Come geni terapeutici, vengono utilizzati vari fattori di crescita angiogenici. I fattori di crescita angiogenici più studiati sono i fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF) che mediano la loro segnalazione angiogenica attraverso i recettori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR) e i loro co-recettori⁵. Diversi studi clinici hanno dimostrato il beneficio e la sicurezza della terapia genica cardiaca e hanno reso questo nuovo metodo di trattamento un'opzione realistica per il trattamento delle cardiopatie ischemiche ^6,7. Tuttavia, questo concetto ha ancora bisogno di migliorare i geni terapeutici e i vettori virali messi alla prova in modelli animali di grandi dimensioni prima di entrare nelle cliniche. Il maiale è stato spesso usato come animale da laboratorio poiché il suo cuore è molto simile al cuore umano. La dimensione del sistema cardiovascolare di un maiale consente l'utilizzo di invenzioni simili a quelle utilizzate negli esseri umani. Tutte le modalità di imaging disponibili per l'uomo possono essere utilizzate nei suini⁸.

Esistono diversi modelli animali di grandi dimensioni per l'ischemia cronica. Il più comunemente usato è il costrittore ameroide modello 9,10,11. Lo svantaggio di questo metodo è l'invasività poiché la toracotomia è necessaria per accedere alla vascolarizzazione coronarica. In precedenza nel nostro gruppo, è stato sviluppato un modello di stent mini-invasivo a collo di bottiglia per l'ischemia miocardica cronica¹². Questo metodo è anche usato in questo manoscritto per indurre ischemia miocardica.

L'usabilità dell'imaging a ultrasuoni si è evoluta sostanzialmente nonostante l'età della modalità di imaging. Ad esempio, il ceppo miocardico è ancora principalmente in uso nella ricerca a causa della sua novità. Lo sforzo miocardico riflette i cambiamenti nella funzione contrattile del cuore meglio della tradizionale misurazione della frazione di eiezione M-mode¹³. Pertanto, qui nel grande modello animale, viene utilizzata la misurazione dello sforzo miocardico. Per valutare la funzione del cuore, la gittata cardiaca viene misurata anche mediante imaging cinematografico del ventricolo sinistro durante l'angiografia. La gittata cardiaca viene misurata sia a riposo che sotto stress indotto da dobutamina per valutare la funzione miocardica sotto stress.

Oltre alle misurazioni della funzione cardiaca, le informazioni sulla perfusione miocardica sono essenziali negli studi di terapia genica finalizzati all'angiogenesi terapeutica. In questo modello animale, gli animali vengono ripresi con 15 tomografie ad emissione di positroni a radioacqua marcate O (¹⁵H₂O-PET) poiché questo è lo standard d'oro per misurare la perfusione miocardica. ¹⁵H₂O-PET è stato precedentemente validato per misurare la perfusione di cuore suino ischemico¹⁴.

Pertanto, i metodi e le modalità sopra menzionati costituiscono un'ottima prospettiva per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico.

Protocollo

Gli esperimenti presentati qui sono eseguiti utilizzando suini domestici femmina di circa 10 settimane e sono approvati dall'Animal Experiment Board in Finlandia. Gli animali pesano 30-40 kg all'inizio del protocollo, consentendo le stesse attrezzature procedurali e modalità di imaging possibili per gli esseri umani. L'ischemia cronica viene indotta 14 giorni prima del trasferimento genico e il tempo di follow-up dopo il trasferimento genico dipende dal vettore virale utilizzato. Il protocollo di studio è mostrato nella Figura 1. Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire iniezioni di terapia genica adenovirale o mediata da AAV. Il tempo di raccolta del campione deve essere adattato al picco di espressione del transgene, che dipende dal vettore virale utilizzato. Ad esempio, quando si eseguono trasferimenti di geni adenovirali, il tempo della raccolta del campione è impostato su 6 giorni dopo il trasferimento del genico.

1. Farmaci

1. Somministrare una dose giornaliera di 200 mg di amiodarone e 2,5 mg di bisoprololo per prevenire aritmie ventricolari fatali. Il farmaco inizia 1 settimana prima dell'operazione di ischemia e viene continuato quotidianamente fino al follow-up.
2. Inoltre, somministrare dosi perorali di clopidogrel (300 mg) e acido acetilsalicilico (300 mg) agli animali 1 giorno prima dell'operazione di ischemia per prevenire la trombosi acuta nello stent dopo il posizionamento dello stent.
3. Somministrare 100 mg di lidocaina e 2,5 ml di (246 mg/ml) di MgSO₄ per via endovenosa agli animali all'inizio dell'operazione di ischemia per prevenire le aritmie ventricolari.
4. Somministrare l'iniezione intramuscolare di cefuroxima (500 mg) all'inizio di ogni operazione per la profilassi dell'infezione.
5. Somministrare 30 mg di enoxaparina per via endovenosa all'inizio delle operazioni di ischemia e per via sottocutanea dopo la procedura operativa per la prevenzione della trombosi.
6. Per anestesia e analgesia, somministrare 1,5 ml di atropina, 6 ml di azaperone (40 mg/ml), propofol 20 mg/ml, in velocità di 15 mg/kg/h e fentanil 50 μg/ml in 10 μg/kg/h. I dosaggi dei farmaci erano gli stessi per ogni maiale. Fare riferimento alle linee guida locali per l'uso degli animali per la somministrazione della dose.
7. Anestetizzare gli animali durante tutte le operazioni. Tutte le operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile utilizzando una tecnica sterile.

2. Ecocardiografia transtoracica

1. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica prima dell'operazione di ischemia, del trasferimento genico e dell'eutanasia per valutare qualsiasi liquido pericardico rilevabile e determinare il ceppo miocardico.
2. Posizionare il trasduttore nel terzo o quarto spazio intercostale sotto l'ascella del maiale per accedere alle viste parasternali dell'asse corto a livello della valvola mitrale, del muscolo papillare e dei livelli apicali (Video 1). Il marcatore del trasduttore dovrebbe puntare allo sterno del maiale. Per salvare una clip, premere Acquisisci.

3. Operazioni endovascolari sotto guida fluoroscopica

1. Eseguire l'imaging cine del ventricolo sinistro dopo angiogrammi coronarici prima dell'operazione di ischemia, trasferimento genico e raccolta di tessuti.
2. Preparazione dell'operazione
   1. Prepararsi alle operazioni sedando i suini con un'iniezione intramuscolare di 1,5 ml di atropina e 6 ml di azaperone.
   2. Dopo la sedazione, indurre propofol generale e fentanil anestesia per le procedure angiografiche ai suini con dosi rispettivamente di 15 mg/kg/h e 10 μg/kg/h.
      NOTA: I maiali vengono anestetizzati per l'intera procedura.
   3. Sostenere la ventilazione mediante intubazione e ventilatore e monitorare i parametri fisiologici vitali, come ECG e parametri respiratori.
3. Posizionamento della guaina dell'introduttore
   1. Posizionare una guaina introduttrice nell'arteria femorale destra per tutte le operazioni come pratica standard in cardiologia. Utilizzare gli ultrasuoni per tracciare l'arteria femorale e perforarla con un ago di ingresso (18 G).
      NOTA: Utilizzare una guaina introduttrice 8F per i trasferimenti genici intramiocardici e una guaina 6F per tutte le altre operazioni. Introdurre il filo guida della guaina attraverso l'ago per infilare l'arteria e tenere fermo il filo guida mentre si rimuove l'ago.
   2. Inserire la guaina introduttrice lungo il filo guida e, una volta posizionata, rimuovere il filo guida e somministrare 1,25 mg di dinitrato sublinguale al maiale per indurre la vasodilatazione coronarica.
4. Angiografia coronarica
   1. Eseguire l'angiografia coronarica direttamente prima dell'operazione di ischemia, trasferimento genico e raccolta di tessuti. I macchinari necessari per gli angiogrammi sono mostrati nella Figura 2.
   2. Utilizzare un catetere 6F sotto guida fluoroscopica con un mezzo di contrasto allo iodio per visualizzare l'arteria coronaria destra e l'arteria coronaria ascendente sinistra (Video 2).
5. Imaging cine del ventricolo sinistro a riposo e stress da dobutamina
   1. Somministrare un bolo di 21 mL di mezzo di contrasto di iodio nel ventricolo sinistro tramite un catetere a coda di maiale 5F utilizzando un autoiniettore. Innanzitutto, impostare la durata del bolo a 3 s e il volume totale per 21 ml. Quindi, premere Single e Sì.
   2. Calcolare la frazione di eiezione mediante il software di misura della postazione angiografica. Per eseguire il calcolo, selezionare Analisi ventricolare dell'immagine in questione. Scorrere l'immagine per selezionare un intervallo di tempo, uno in diastole e uno in sistole. Selezionare uno strumento per disegnare i contorni ventricolari di ogni intervallo di tempo.
      NOTA: il software ora calcola la frazione di eiezione e il volume della corsa con il metodo Simpson. La misurazione della frazione di eiezione viene eseguita durante il riposo e sotto stress indotto dalla dobutamina.
6. Imaging dello stress
   1. Dosare dobutamina per via endovenosa in dosi crescenti da 10 μg/kg/min a 20 μg/kg/min per l'imaging da stress indotto da dobutamina fino al raggiungimento della frequenza cardiaca target di 160 bpm. Quindi, eseguire l'imaging cinematografico.
7. Operazione di ischemia
   1. Posizionare uno stent a collo di bottiglia nell'arteria coronaria sinistra (LAD) 14 giorni prima del trasferimento del gene per indurre ischemia miocardica cronica. Dopo il posizionamento dello stent a collo di bottiglia, controllare se lo stent a collo di bottiglia è posizionato correttamente, limitando il flusso sanguigno coronarico.
      NOTA: Lo stent a collo di bottiglia è posto su un catetere di dilatazione ed è costituito da uno stent in metallo nudo coperto da un tubo di politetrafluoroetilene formato a forma di collo di bottiglia per ridurre il flusso sanguigno coronarico⁹.
8. Definizione della dimensione dello stent
   1. Scegliere la dimensione dello stent, 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, in base alle dimensioni dell'arteria coronaria ascendente sinistra nell'angiogramma utilizzando il software di misurazione automatica nella workstation angiografica (Video 3)¹².
9. Posizionamento dello stent
   1. Posizionare una bobina sull'arteria coronaria sinistra e far scorrere lo stent a collo di bottiglia verso il LAD, posizionandolo distalmente alla prima diagonale.
   2. Gonfiare lo stent alla pressione nominale nell'arteria utilizzando un deflatore con un rapporto stent-lumen di 1,3, ancorando il collo di bottiglia in posizione. Dopo altri 15 s, sgonfiare lo stent e ritrarre l'apparecchiatura dall'arteria.
      NOTA: Confermare il corretto posizionamento dello stent a collo di bottiglia mediante angiogramma.

4. Imaging PET

NOTA: Un giorno prima del trasferimento genico, eseguire il riposo e lo stress ¹⁵scansioni PET / CT radiowater marcate O (richiede ambiente ospedaliero e tecnici radiologici).

1. Imaging di riferimento
   1. Eseguire scansioni di tomografia computerizzata (TC) prima del riposo e dell'imaging da stress. Utilizzare le informazioni CT per la correzione dell'attenuazione.
2. ¹⁵Imaging radiowater marcato O
   1. Eseguire l'imaging del riposo e dello stress utilizzando un bolo di 800 MBq ¹⁵H₂O.
3. Imaging dello stress
   1. Eseguire l'imaging da sforzo con un ulteriore bolo di 800 MBq 15 O-acqua dopo un decadimento radioattivo adeguato di ¹²min.
      NOTA: L'iperemia è indotta dall'adenosina (200 μg/kg/min per via endovenosa), come descritto in precedenza¹².

5. Trasferimento genico

1. Mappatura elettroanatomica
   1. Procedere alla mappatura elettroanatomica dopo un angiogramma coronarico e misurazioni funzionali (ecocardiografia, imaging LV cine).
   2. Introdurre un catetere di mappatura al ventricolo sinistro tramite guaina femorale nella guida fluoroscopica.
      NOTA: Registrare circa 100-150 punti attorno al ventricolo sinistro con il catetere di mappatura per creare la mappa elettroanatomica.
2. Completamento della mappa elettroanatomica
   1. Eliminare i punti anomali per garantire una mappa elettroanatomica più affidabile del ventricolo sinistro.
   2. A tale scopo, selezionare Piani di clip della mappa ed eliminare i punti che differiscono dai punti che formano la forma ventricolare. Quindi, selezionare Traiettorie per la vista mappa ed eliminare i punti che hanno percorso orizzontalmente durante la registrazione dei punti.
      NOTA: assicurarsi che i punti rimanenti coprano il ventricolo sinistro e registrare più punti, se necessario.
3. Iniezioni di trasferimento genico
   1. Introdurre un catetere per iniezione intramiocardica al ventricolo sinistro attraverso la guaina femorale sotto guida fluoroscopica. Impostare la lunghezza dell'ago per iniezione su 3 mm.
4. Criteri per le iniezioni intramiocardiche
   1. Guidare i trasferimenti genici mediante il sistema di mappatura elettroanatomica e indirizzare le iniezioni in aree vitali ma ipocinetiche del ventricolo sinistro.
      NOTA: per la vitalità, utilizzare una tensione unipolare superiore a 5 mV come criterio. Per l'ipocinesia, selezionare un accorciamento lineare locale (LLS) il più basso possibile, almeno al di sotto del 12% ma preferibilmente inferiore al 6%¹³.
5. Iniezioni intramiocardiche
   1. Durante 30 s, iniettare il materiale vettore nel punto di selezione (fase 5.4) e tenere l'ago per iniezione all'interno del miocardio per altri 5 secondi prima di ritrarsi per evitare il riflusso al ventricolo sinistro.

6. Eutanasia e raccolta di campioni

NOTA: Dopo le misurazioni dell'angiogramma coronarico e della frazione di eiezione descritte rispettivamente nei punti 3.4.1 e 3.5.2, somministrare 50 ml di cloruro di potassio saturo per via endovenosa al maiale anestetizzato.

1. Fissazione per perfusione del cuore
   1. Raccogli il cuore dalla cavità toracica. Risciacquare con acqua. Posizionare un ago da 18 G sopra la valvola aortica e collegare l'ago a una pompa di perfusione. Perfondere il cuore con 750 ml di paraformaldeide (PFA) all'1%.
2. Raccolta di campioni
   1. Tagliare il cuore a fette spesse 1 cm usando un coltello da cucina affilato. Raccogliere i campioni dall'area di trasferimento genico in PFA al 4% e azoto liquido.
      NOTA: Per raccogliere i controlli negativi, raccogliere un campione di controllo dalla parete posteriore del ventricolo sinistro.
3. Raccolta di tessuti di sicurezza
   1. Preleva campioni da tessuti remoti, come polmone, fegato, reni, milza e ovaie. Prelevare campioni in PFA al 4% e azoto liquido.

7. Conservazione dei campioni

1. Conservare i campioni per la colorazione in PFA al 4% per 48 ore a 4 °C.
   NOTA: Sostituire il PFA ogni giorno con un liquido fresco.
   1. Dopo 48 ore, sostituire il PFA con il 15% di saccarosio in acqua deionizzata. Conservare per almeno 24 ore prima di incorporare i campioni in blocchi di paraffina. I campioni congelati a scatto vengono conservati a -70 °C.

Risultati

Il successo dell'operazione di ischemia può essere confermato con questo protocollo mediante angiogramma coronarico e determinando l'area ipocinetica mediante ecografia transtoracica (Figura 1) prima di procedere alla consegna del gene. Lo stato dell'occlusione coronarica può essere valutato mediante angiogramma coronarico, e la mappatura elettroanatomica assicura le aree ischemiche e di ibernazione.

L'efficacia della terapia genica può essere analizzata misura...

Discussione

I timepoint di questo protocollo possono essere modificati in base al vettore virale utilizzato. Inoltre, le analisi immunoistologiche possono essere selezionate in base al gene terapeutico. È anche possibile aggiungere più timepoint ed endpoint al protocollo, se necessario.

Questo protocollo comprende fasi, che sono essenziali per avere successo e impossibili da correggere in seguito. In primo luogo, se non si riesce a indurre un'ischemia appropriata, l'animale deve essere escluso da ulteri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips