Una prueba conductual para las convulsiones inducidas por el calor en modelos de epilepsia en ratones

Resumen

El objetivo del método es detectar hipertermia o convulsiones inducidas por el calor en modelos de ratón. El protocolo describe el uso de una cámara personalizada con monitoreo continuo de la temperatura corporal para determinar si la temperatura corporal elevada conduce a convulsiones.

Resumen

Los modelos de ratones transgénicos han demostrado ser herramientas poderosas en el estudio de diversos aspectos de los trastornos neurológicos humanos, incluida la epilepsia. Las epilepsias genéticas asociadas a SCN1A comprenden un amplio espectro de trastornos convulsivos con penetrancia incompleta y variabilidad clínica. Las mutaciones scn1A pueden dar lugar a una gran variedad de fenotipos convulsivos que van desde convulsiones febriles (FS) simples y autolimitadas asociadas a la fiebre, epilepsia genética de nivel moderado con convulsiones febriles más (GEFS +) hasta el síndrome de Dravet (DS) más grave. Aunque las FS se observan comúnmente en niños menores de 6-7 años de edad que no tienen epilepsia genética, la FS en pacientes con GEFS+ continúa ocurriendo en la edad adulta. Tradicionalmente, los FS experimentales se han inducido en ratones al exponer al animal a una corriente de aire seco o lámparas de calefacción, y la tasa de cambio en la temperatura corporal a menudo no está bien controlada. Aquí, describimos una cámara de calefacción hecha a medida, con un frente de plexiglás, que está equipada con un controlador de temperatura digital y un ventilador eléctrico equipado con calentador, que puede enviar aire forzado calentado a la arena de prueba de una manera controlada por temperatura. La temperatura corporal de un ratón colocado en la cámara, monitoreada a través de una sonda rectal, se puede aumentar a 40-42 ° C de manera reproducible aumentando la temperatura dentro de la cámara. El monitoreo visual continuo de los animales durante el período de calentamiento demuestra la inducción de convulsiones inducidas por el calor en ratones portadores de una mutación FS a una temperatura corporal que no provoca convulsiones conductuales en compañeros de camada de tipo salvaje. Los animales se pueden sacar fácilmente de la cámara y colocarlos en una almohadilla de enfriamiento para devolver rápidamente la temperatura corporal a la normalidad. Este método proporciona un protocolo de detección simple, rápido y reproducible para la aparición de convulsiones inducidas por el calor en modelos de ratón con epilepsia.

Introducción

La epilepsia, la cuarta familia más común de trastornos neurológicos en los Estados ^Unidos1, se caracteriza por un desequilibrio del impulso excitatorio e inhibitorio en el SNC que conduce a convulsiones recurrentes. Las convulsiones febriles (FS) o las convulsiones asociadas a la fiebre pueden ocurrir en la población general, con mayor frecuencia en niños desde los 3 meses hasta los 6 -7 años de edad. Sin embargo, en algunos individuos con mutaciones genéticas, con mayor frecuencia en un gen del canal de sodio, FS puede persistir más allá de la edad de 7 años en la edad adulta. Esta condición se conoce como convulsiones febriles plus o FS +. Los rápidos avances en la secuenciación del genoma han identificado más de 1.300 mutaciones en el gen del canal iónico de sodio humano SCN1A, lo que lo convierte en un punto caliente para las mutaciones de la epilepsia. Las mutaciones de SCN1A se han relacionado con un amplio espectro de trastornos convulsivos, incluidas las convulsiones febriles (FS), la epilepsia genética con convulsiones febriles plus (GEFS+) y el síndrome de Dravet (DS)2,3,4,5,6. Alrededor del 20% de las mutaciones sin sentido scN1A conducen a GEFS+^5,7,8. Los antecedentes pediátricos de FS compleja o prolongada en la infancia pueden convertirse posteriormente en formas más debilitantes de epilepsia, como la epilepsia del lóbulo temporal (TLE)^9,10,11. El síndrome de Dravet surge debido a mutaciones de truncamiento o mutaciones de pérdida de función en SCN1A y es una forma grave de epilepsia intratable, con inicio en la infancia de convulsiones febriles que se convierten en convulsiones refractarias, y a menudo se asocia con deficiencias cognitivas, de desarrollo y motoras2,5,12 . Dado que muchas personas con GEFS+ y/o DS exhiben convulsiones febriles, se vuelve imperativo desarrollar nuevas terapias para combatir mejor estos trastornos convulsivos.

Los modelos animales de epilepsia asociada a SCN1A han demostrado ser invaluables para caracterizar diferentes tipos de convulsiones (febril vs generalizada) y diseccionar el mecanismo neuronal de la generación de convulsiones13,14,15,16,17,18. Si bien el estudio de las convulsiones espontáneas a través de registros de EEG / EMG en cerebros de roedores está bien establecido y es una herramienta muy útil, solo unos pocos estudios han intentado imitar las convulsiones febriles en modelos de ratón14,16,19,20,21,22,23 . Estudios anteriores han utilizado un chorro de aire seco calentado, o un cilindro de metacrilato equipado con un sistema térmico, o lámparas de calor con un controlador de temperatura en arenas de prueba cerradas9,16,21,22,23,24 para inducir convulsiones a través de la hipertermia. Con el fin de aumentar la temperatura corporal en un entorno más controlado, el protocolo descrito aquí utiliza una cámara personalizada con un sistema de calefacción de temperatura controlada que permitió tasas reproducibles de aumento de la temperatura corporal de un ratón dentro de la cámara. La cámara de calor fue construida de madera (largo 40 cm x ancho 34 cm x alto 31 cm) y fue equipado con un controlador de temperatura digital con un termopar K. Un pequeño ventilador axial equipado con un calentador en el panel posterior de la cámara dirige el aire caliente a la cámara regulada por un controlador de temperatura digital. Este sistema de calentamiento de aire forzado permite controlar la velocidad a la que aumenta la temperatura de la cámara. (Figura 1A,B). El termopar K ubicado dentro de la cámara de calor de madera envía retroalimentación al controlador de temperatura digital, para mantener temperaturas constantes dentro de la caja durante el ensayo. El ajuste de la temperatura en el controlador de temperatura digital permite que el ventilador eléctrico envíe aire forzado calentado a través de las rejillas de ventilación para calentar uniformemente la cámara (Figura 1A). El panel frontal de la cámara de calor es una lámina de plexiglás transparente para permitir una fácil grabación de video de los ensayos.

Para cada experimento se seleccionaron ratones adultos (P30-P40), heterocigotos para una mutación sin sentido en SCN1A que causa GEFS+ y un número igual de compañeros de camada de tipo salvaje para servir como grupo de control. Los animales, tanto machos como hembras, utilizados en estos estudios pesaron al menos 15 g, ya que los ratones de tipo salvaje que pesaban menos eran más sensibles a las convulsiones inducidas por el calor que los animales más pesados de la misma edad. En el estudio piloto, se observó que tanto los ratones mutantes como los de tipo salvaje buscaban las esquinas más frías de la cámara en la parte posterior y permanecieron allí durante períodos prolongados de tiempo. Para evitar esto, el tamaño efectivo del piso dentro de la arena de prueba de la cámara de calor se redujo a la longitud de 16.5 cm x ancho 21.5 cm x altura 27.5 cm colocando un bloque de madera B (dimensiones 20 cm x 8 cm x 7.2 cm) en el lado derecho de la cámara (Figura 1A). La cámara de calor se construyó a partir de madera contrachapada de 1,9 cm de espesor (largo 40 cm x ancho 34 cm x altura 31 cm) cubierta con laminado blanco y equipada con un controlador de temperatura digital con un termopar K. La superficie laminada de las paredes de la cámara es impermeable y se puede desinfectar fácilmente entre ensayos limpiando con etanol al 70%. La temperatura de la cámara de calor se fijó inicialmente en 50 °C y se precalentó durante al menos 1 h antes del inicio del experimento, para garantizar un calentamiento uniforme dentro de la cámara. A cada ratón se le equipó un termómetro rectal para el monitoreo continuo de la temperatura corporal durante todo el experimento. Se colocó un solo ratón en la cámara a la vez y la temperatura se mantuvo a 50 ° C entre el ^{minuto 1 y} el ^10. La temperatura se elevó a 55 ° C durante el ^minuto 11-20^, y finalmente se elevó a 60 ° C durante ^{el minuto} 21-30. Esto resultó en una tasa reproducible de aumento en la temperatura corporal del ratón (Figura 2A). Cada ensayo se grabó en video y el análisis del comportamiento se realizó fuera de línea.

El protocolo de calentamiento se puede modificar fácilmente para cambiar la temperatura inicial de la cámara de calor y la velocidad a la que se calienta la cámara, lo que a su vez cambia la rapidez con que se eleva la temperatura corporal del ratón durante el ensayo. Por lo tanto, este método proporciona más flexibilidad sobre los métodos tradicionales en la configuración de las pantallas de comportamiento que implican convulsiones inducidas por el calor. El protocolo de convulsiones inducidas por calor también se puede usar para detectar medicamentos antiepilépticos que hacen que los ratones mutantes sean más resistentes a las convulsiones inducidas por el calor o aumentan la temperatura umbral a la que se observan las convulsiones. Del mismo modo, los efectos beneficiosos de los regímenes de dieta restrictiva como la dieta ceto en las convulsiones inducidas por el calor se pueden examinar en ratones normales alimentados con chow vs cetoalimentados.

Figura 1: Descripción de la cámara de calor del ratón personalizada. (A) El panel frontal de la cámara de calor del ratón de madera muestra el panel de control lateral que contiene el interruptor de encendido / apagado que enciende el controlador de temperatura digital, el termopar K, el interruptor de encendido / apagado del calentador del ventilador y el indicador de calor. Las dimensiones exteriores de la caja y la arena de prueba interna se muestran en cm. También se muestra un bloque de madera B utilizado para reducir eficazmente la superficie de la arena de prueba. La parte inferior de la arena de prueba está cubierta con ropa de cama de mazorca para evitar que los ratones entren en contacto directo con las superficies de madera calentadas. (B) El panel posterior de la cámara de calor muestra el ventilador montado en la salida de aire superior y el cable de alimentación para suministrar electricidad a la cámara. Esta cifra se modifica de la Figura 3 en Das et al., 2021, eNeuro14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Irvine.

1. Preparación para el ensayo de convulsiones inducidas por calor

1. Encienda el botón de encendido en la cámara de calor, seguido del botón de encendido .
2. Ajuste la temperatura de la cámara de calor a 50 °C utilizando el teclado del controlador de temperatura digital.
3. Espere un mínimo de 1 h para precalentar la cámara a 50 °C antes de introducir el primer ratón en la cámara. El precalentamiento garantiza un calentamiento uniforme dentro de la cámara.
4. Forrar el suelo de la cámara de calor del ratón con ropa de cama de mazorca.
5. Monte una cámara de grabación de video frente a la cámara de calor para grabar cada ensayo de ensayo de convulsiones inducidas por calor.
6. Forra una placa de Petri de 140 mm de diámetro con capas gruesas de papel de seda y colócala sobre hielo para que sirva como almohadilla de enfriamiento.
   NOTA: Al final del ensayo, el ratón individual se transferirá en la almohadilla de enfriamiento preclasificada para ayudar a reducir su temperatura corporal elevada.

2. Preparación del ratón para el ensayo de convulsiones inducidas por calor

1. Seleccione 10 ratones adultos (P30-P40), 5 que portan la mutación causante de la epilepsia y 5 de los compañeros de camada de tipo salvaje para el ensayo de detección de convulsiones inducidas por el calor.
   NOTA: Los ratones de tipo salvaje, que no albergan ninguna mutación causante de epilepsia, no exhiben convulsiones inducidas por el calor a temperaturas inferiores a 44 ° C y sirven como grupo de control.
2. Pesar cada ratón que se utilizará para el ensayo de detección y registrar su peso corporal. Solo se deben usar ratones que pesen 15 g o más para el ensayo.
3. Pantalla un ratón a la vez en la cámara de calor del ratón.
4. Anestesia brevemente el ratón durante 10-15 s usando unas gotas de isoflurano en el fondo de un frasco de campana.
5. Saque al animal del frasco de la campana y colóquelo en una toalla de papel.
6. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado comprobando que el ratón no responde a un pellizco nocivo del dedo del pie.
7. Cubra la punta metálica de la sonda de temperatura rectal con un lubricante (como vaselina) e insértela suavemente en el ratón a una profundidad inferior o igual a 2 cm.
8. Asegure la sonda rectal a la cola del ratón con cinta adhesiva, para que la sonda no salga durante el ensayo.
   NOTA: Alternativamente, coloque al animal en un cono de restricción de ratón e inserte la sonda de temperatura rectal. Asegúrelo pegando con cinta adhesiva a la cola.
9. Asegúrese de que la sonda rectal esté conectada a un multímetro que muestre la temperatura corporal interna del ratón.
10. Coloque al animal en una jaula fresca forrada con ropa de cama de mazorca, es decir, la jaula de recuperación.
11. Inicie un temporizador y espere 5 minutos. Observe al ratón hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia y el ratón esté activo y acicalándose.
    1. Simultáneamente, controle la temperatura corporal central del ratón hasta que se estabilice a 35-36 ° C.
12. Al final de 5 minutos, observe la temperatura corporal del mouse. Esta es la temperatura corporal inicial en el tiempo "0" min.
    NOTA: Si la temperatura corporal central del ratón es inferior a 35 ° C, espere un tiempo adicional para que el animal se recupere de la hipotermia inducida por la anestesia.
13. Rápidamente, transfiera el ratón individual a la cámara del ratón precalentada. Esto marca el INICIO de la prueba del experimento. Solo se proyecta un ratón en un momento dado.

3. Ensayo de convulsiones inducidas por calor

1. Después de colocar suavemente el mouse en el piso de la cámara de calor del mouse precalentada, cierre la puerta de plexiglás y encienda la cámara para grabar en video el experimento.
2. Inicie el cronómetro. Registre la temperatura corporal del ratón desde el termómetro rectal a intervalos de 1 minuto durante la duración del experimento.
3. A intervalos regulares, aumente la temperatura de la cámara de calor del ratón de tal manera que la temperatura corporal del ratón aumente a una velocidad de 0.25-0.5 ° C / min.
   NOTA: Los aumentos rápidos en la temperatura corporal pueden provocar un golpe de calor o la muerte y deben evitarse.
4. Siguiendo este protocolo, aumente la temperatura de la cámara de calor del ratón en 5 °C cada 10 minutos como se muestra en la Figura 2A.
5. A los 9,5 min, ajuste la temperatura de la cámara de calor a 55 °C, para estabilizar la temperatura de la cámara de calor a 55 °C en ^{el minuto} 10 como se muestra en la pantalla digital de temperatura.
6. Del mismo modo, aumente la temperatura a 60 ° C a 19.5 min para estabilizar la temperatura de la cámara de calor a 60 ° C en ^{el minuto} 20. Cada ensayo de detección de convulsiones dura 30 minutos.
7. Si el ratón tiene una convulsión (vocaliza, muestra asintiendo con la cabeza, clonus de extremidades anteriores, extensión de las extremidades posteriores, caídas de lado o experimenta convulsiones tónicas / clónicas generalizadas), registre la siguiente información.
   1. Registre la temperatura corporal del ratón durante la convulsión (temperatura umbral de la convulsión) desde el termómetro de temperatura rectal.
   2. Registre las características del comportamiento convulsivo, como cabeceo, clonus de extremidad anterior, extensión de la extremidad posterior, caída lateral y / o convulsiones tónicas / clónicas generalizadas (GTCS) mostradas por el ratón.
8. Recoja rápida pero suavemente el ratón de la cámara y colóquelo en la almohadilla de enfriamiento preparada en el paso 1.6.
   NOTA: Si un ratón está experimentando convulsiones de la escala 5 de Racine y exhibe saltos incontrolados, puede ser difícil recoger al animal de la cámara de calor y transferirlo a la almohadilla de enfriamiento exterior. Sin embargo, una convulsión típica inducida por el calor dura entre 30 s y 60 s.Por lo tanto, el ratón debe ser sacado de la cámara de calor y puesto en la almohadilla de enfriamiento dentro de los 60 s posteriores al inicio del episodio de convulsiones inducidas por el calor.
9. Espere a que la temperatura corporal del ratón baje a 36-37 ° C, antes de transferirlo a una jaula de recuperación. Solo se coloca un ratón en una jaula de recuperación a la vez.
   NOTA: No mezcle ratones que aún no se han utilizado para la detección inducida por calor con el ratón que ya ha experimentado el ensayo del experimento de convulsiones inducidas por calor.
10. Suavemente y con cuidado, corte la cinta entre la cola del ratón y el alambre de la sonda rectal con un par de tijeras para quitar la sonda rectal del ratón.
11. Limpie la punta metálica de la sonda rectal con alcohol al 70% y toallitas de tejidos blandos para mantenerla lista para el próximo ensayo.
12. Continúe observando al ratón en la jaula de recuperación hasta que reanude su actividad normal (caminar, acicalarse, etc.), antes de devolver al ratón a su jaula de origen. Esto marca el FINAL del ensayo experimental para este ratón.
13. Registre el estado del animal después del ensayo vivo y recuperado de la sesión de prueba o muerto. Las convulsiones de alta intensidad que implican saltos incontrolados y convulsiones tónicas / clónicas generalizadas a veces pueden provocar la muerte del ratón.
14. Si un ratón no experimenta convulsiones inducidas por el calor dentro del período de observación de 30 minutos o la temperatura corporal del ratón alcanza los 44 °C, retire el ratón de la cámara de calor y colóquelo en la almohadilla de enfriamiento hasta que la temperatura corporal del ratón vuelva a 36-37 °C.
15. Restablezca la temperatura de la cámara de calor del ratón a 50 °C y permita que se equilibre hasta que la temperatura de visualización en el controlador de temperatura digital muestre 50 °C.
16. Cambie la cama de mazorca entre ensayos individuales con ratones.
17. Prepare el siguiente ensayo de ratón para el cribado como se describe en la sección 2 y repita los pasos de la sección 3.

4. Eutanasia de los animales

1. Aunque la mayoría de los animales se recuperan después de las convulsiones inducidas por el calor, en nuestra experiencia, algunos de los ratones se someten a SUDEP (muerte súbita inexplicable en EPilepsy) en su jaula doméstica dentro de las 24-48 horas de las convulsiones inducidas por el calor. Después de concluir la detección en todos los ratones individualmente para las convulsiones inducidas por el calor después del ensayo de 30 minutos, eutanasia a todos los ratones según las pautas de la IACUC de la institución.

5. Análisis de los datos de convulsiones inducidas por el calor

1. Después de completar el cribado de una cohorte de animales, calcule el porcentaje de ratones en un genotipo dado que muestran convulsiones utilizando la siguiente fórmula:
   
2. Estimar la temperatura media del umbral convulsivo de los ratones dentro de un genotipo dado promediando la temperatura umbral de convulsiones de todos los ratones (observados en el paso 3.7) en ese genotipo que exhiben convulsiones inducidas por el calor.
3. Mientras sigue siendo ciego a la identidad y el genotipo, reproduzca las grabaciones de video de cada uno de los ratones durante la evaluación del ensayo de convulsiones inducidas por calor en una pantalla de computadora para calificar la gravedad de los episodios de convulsiones.
4. Dar puntuaciones a ratones individuales que exhiben un comportamiento convulsivo inducido por el calor mediante el uso de la escala de Racine ^modificada13 descrita por estudios ^{anteriores13,14}. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.
5. Si un ratón, mientras experimenta convulsiones inducidas por el calor, solo muestra la cabeza asintiendo, dele una puntuación de 2. Si un ratón comienza un episodio de convulsiones con la cabeza asintiendo pero también exhibe clonus de extremidades anteriores, cayendo y / o saltando, déle una puntuación de 5.
6. Registre la puntuación máxima de cada ratón utilizando la escala de Racine ^modificada13 como se describió anteriormente.
7. Trazar un gráfico de dispersión de las puntuaciones máximas de Racine exhibidas por todos los ratones en un genotipo dado.
8. Compare estadísticamente las puntuaciones máximas de Racine entre diferentes grupos de ratones como método para determinar la gravedad de las convulsiones conductuales, como las convulsiones inducidas por el calor.
   NOTA: Las puntuaciones de racine son útiles para comparar las características de las convulsiones entre diferentes grupos de ratones mutantes o genotipos. Se espera que los ratones de tipo salvaje no sufran convulsiones inducidas por el calor y no tengan que ser considerados para las comparaciones de puntuación de Racine.
9. Sobre la base del diseño experimental, realice un análisis estadístico apropiado para determinar si el porcentaje de ratones que exhiben convulsiones entre ratones de tipo salvaje y mutantes, y sus valores medios de temperatura umbral de convulsiones son significativamente diferentes entre sí.

Puntuación de Racine	Características de las convulsiones
0	Sin convulsiones
1	Movimientos bucales y faciales
2	Cabeza asintiendo
3	Clonus de extremidad anterior, generalmente una extremidad
4	Clonus de extremidad anterior con cría
5	Convulsión tónico-clónica generalizada, crianza, salto, caída

Tabla 1: Puntuaciones de Racine.

Resultados

Se espera que los modelos animales con mutaciones convulsivas febriles sufran convulsiones inducidas por el calor a temperaturas corporales elevadas que no inducen convulsiones en las parejas de camada de tipo salvaje. Las mutaciones en SCN1A se han relacionado con convulsiones febriles, incluyendo pacientes con K1270T GEFS+, que presentan convulsiones generalizadas febriles y afebriles7. Examinamos ratones mutantes SCN1A K1270T GEFS+ generados por CRISPR recientemente descritos en un ^estudio14 para la aparición de convulsiones por calor en dos antecedentes genéticos: fondos resistentes a las convulsiones 129X1 / SvJ (129X1) y sensibles a las convulsiones C57BL / NJ (B6N). Los compañeros de camada de tipo salvaje emparejados por la edad en la cámara de calor del ratón que no albergan ninguna mutación GEFS + y, por lo tanto, no se espera que exhiban convulsiones inducidas por el calor, sirvieron como grupo de control. La tasa de cambio de temperatura corporal a lo largo del tiempo se evaluó trazando la temperatura corporal media de los ratones registrada cada minuto durante el ensayo. No hubo diferencias en la tasa de cambio de la temperatura corporal entre los ratones mutantes heterocigotos y los compañeros de camada de tipo salvaje probados en los respectivos antecedentes genéticos 129X1 y B6N (Figura 2B, C). Esto sugiere que la termorregulación no está alterada en ratones mutantes heterocigotos K1270T GEFS+.

Todos los ratones mutantes heterocigotos de 129X1 (n = 15) o B6N (n = 9) de fondos genéticos exhibieron convulsiones inducidas por el calor (Figura 2D). Ninguno de los ratones de tipo salvaje en el fondo enriquecido con 129X1 (n = 13) exhibió convulsiones inducidas por el calor (Figura 2D). En contraste, un tercio de los ratones probados (n = 3 de los 9 ratones) en el fondo B6N sensible a las convulsiones exhibieron convulsiones inducidas por el calor. La comparación estadística muestra que el porcentaje de ratones mutantes heterocigotos que exhibieron convulsiones inducidas por el calor fue significativamente mayor que sus respectivos ratones homólogos de tipo salvaje en los antecedentes genéticos 129X1 y B6N (Figura 2D, prueba exacta de Fisher, 129X1 p < 0.0001; B6NJ p = 0,009). La temperatura umbral de convulsión promedio entre los ratones mutantes heterocigotos en los fondos genéticos 129X1 y B6N fue similar. Los ratones mutantes 129X1 tienen una temperatura umbral convulsiva media de 42,6 ± 0,20 °C, que no fue significativamente diferente de la temperatura umbral convulsiva media de 42,7 ± 0,06 °C observada en ratones B6N (Figura 2E; prueba t de Student de dos colas sin aparear, p = 0,782). Es importante tener en cuenta que la temperatura media del umbral de convulsiones de tres ratones de tipo salvaje B6N que exhibieron convulsiones inducidas por el calor fue de 43,7 ± 0,08 ° C y significativamente más alta que el umbral convulsivo medio de 42,7 ± 0,06 ° C mostrado por ratones mutantes heterocigotos B6N (Figura 2E, prueba t de Student de dos colas sin aparear, p < 0,0001).

El frente de plexiglás de la cámara permite realizar grabaciones de vídeo continuas durante el ensayo que se pueden utilizar posteriormente para puntuar la gravedad de las convulsiones en cada ratón en una escala de Racine modificada como se describió ^{anteriormente14,20}. Durante un ensayo típico, los ratones mutantes heterocigotos mostrarían convulsiones inducidas por el calor con vocalización y / o asintiendo con la cabeza (puntuación de Racine 2), y rápidamente pasarían al clonus de extremidad anterior, cayendo de lado, saltando, extensión de las extremidades posteriores y / o convulsiones tónicas / clónicas generalizadas (puntuaciones de Racine 3-5) cuando la temperatura corporal alcanzó aproximadamente 42 ° C. La puntuación máxima de Racine representa el comportamiento convulsivo inducido por el calor más grave entre los ratones mutantes. La puntuación máxima de Racine de ratones mutantes heterocigotos en fondo enriquecido con 129X1 (n = 15) no es diferente de la de ratones mutantes heterocigotos en fondo genético B6N (n = 9) (Figura 2F; Prueba de Mann-Whitney, p > 0,9999). Esto sugiere que las características del comportamiento convulsivo inducido por el calor en ratones mutantes K1270T GEFS+ son independientes del fondo de la cepa.

Tomados en conjunto, los datos demuestran que todos los ratones mutantes exhiben convulsiones inducidas por el calor con frecuencia similar, temperatura umbral de convulsiones y gravedad de las convulsiones conductuales de una manera independiente de la tensión. La mayoría de los compañeros de camada de tipo salvaje no exhiben tales convulsiones a 44 ° C o menos. Alrededor de un tercio de los ratones de control de tipo salvaje en un fondo B6N sensible a las convulsiones mostraron convulsiones inducidas por el calor (posiblemente debido a los efectos genéticos de fondo), pero la temperatura umbral de las convulsiones fue significativamente más alta en comparación con los ratones mutantes en el mismo fondo. Estos resultados sugieren que los ratones mutantes en el fondo genético B6N son susceptibles a las convulsiones inducidas por el calor a umbrales de temperatura más bajos debido a la mutación SCN1A GEFS + que albergan. Por lo tanto, utilizando este protocolo, se pueden evaluar las convulsiones inducidas por el calor en ratones mutantes de epilepsia y distinguirlos de los ratones de pareja de camada de tipo salvaje, que no sufren convulsiones inducidas por el calor o muestran convulsiones por calor a temperaturas significativamente más altas.

Figura 2: Los ratones mutantes exhiben convulsiones inducidas por el calor. (A) El protocolo de calentamiento para la detección conductual de las convulsiones inducidas por el calor en ratones. (B-C) Temperatura corporal media de ratones a lo largo del tiempo en ratones de tipo salvaje (Scn1a ^+/+ - triángulos negros) y mutantes heterocigotos (Scn1aKT ^{/ +} - círculos naranjas) en dos fondos genéticos 129X1 y B6N, respectivamente. (D) Porcentaje de ratones que muestran convulsiones inducidas por el calor en ambos antecedentes genéticos. Los ratones de tipo salvaje (Scn1a^+/+) y heterocigotos (Scn1aKT^/+) están representados por barras negras y naranjas, respectivamente. Los mutantes heterocigotos en fondos 129X1 y B6N se muestran en barras sólidas naranjas y barras naranjas con rayas negras, respectivamente. (E) Umbral de temperatura de convulsión para convulsiones inducidas por calor en ratones de tipo salvaje (Scn1a ^+/+) y mutantes heterocigotos (Scn1aKT ^{/ +}) en ambas cepas. (F) Distribución por dispersión de las puntuaciones máximas de Racine de convulsiones inducidas por calor exhibidas por ratones heterocigotos (Scn1aKT ^{/ +}) en ambos fondos genéticos. Cada punto representa la puntuación máxima de Racine en un solo ratón. El número de animales en cada genotipo se muestra entre paréntesis. Los datos que se muestran en los paneles B-F son ± media s.e.M. Esta cifra se modifica de la Figura 3 en Das et al., 2021, eNeuro14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Describimos un protocolo simple y efectivo para detectar la aparición de convulsiones inducidas por el calor en ratones, el equivalente conductual de las convulsiones febriles en pacientes humanos. El ensayo evalúa varios parámetros, incluido el porcentaje de ratones que muestran convulsiones, el umbral de convulsiones, la gravedad de las convulsiones en una escala de Racine, para comparar la sensibilidad de los grupos de ratones de control y prueba con los aumentos de la temperatura corporal.

Un paso crítico en este protocolo implica aumentar el calor en la cámara mientras se monitorea continuamente la temperatura corporal del ratón. Es imperativo que la temperatura corporal máxima que los ratones experimentarán en estos ensayos sea de 44 ° C porque los animales de tipo salvaje pueden sufrir convulsiones inducidas por el calor a temperaturas corporales >44 ° C. El pretratamiento con anestesia general o analgésicos podría reducir la temperatura corporal central de los animales o interferir con la termorregulación, lo que a su vez confundiría la recopilación de datos de temperatura umbral de convulsiones. Por lo tanto, los ratones bajo este protocolo de detección no pudieron ser provistos de estos agentes durante la ventana de ensayo de 30 minutos. Todos los procedimientos deben ser aprobados por el comité IACUC de la institución. Para garantizar un monitoreo continuo de la temperatura corporal central del ratón durante el ensayo, pegue de forma segura la sonda de temperatura rectal a la cola de los ratones. Si durante el ensayo, se descubre que la temperatura corporal del ratón permanece sin cambios durante períodos prolongados de tiempo, incluso después de aumentar la temperatura de la cámara del ratón, asegúrese de que la sonda de temperatura rectal no haya salido del ratón o esté unida libremente a la cola.

Los antecedentes genéticos de los modelos de ratón pueden afectar la sensibilidad a la mutación SCN1A y las convulsiones inducidas farmacológicamente18,25,26,27. Como se discutió en los resultados anteriores, los antecedentes genéticos de los ratones pueden influir en su susceptibilidad a las convulsiones inducidas por el calor. Scn1a Los ratones mutantes K1270T GEFS + se probaron en dos antecedentes genéticos: 129X1 y B6NJ, y también se observó que un pequeño porcentaje de ratones de tipo salvaje (33%) en el fondo B6NJ sensible a las convulsiones sufría convulsiones inducidas por el calor. Sin embargo, en comparación con los ratones mutantes heterocigotos Scn1aKT ^{/ +}, los ratones de tipo salvaje B6NJ experimentaron convulsiones inducidas por el calor a un umbral de temperatura significativamente más alto. Esto confirma que la mutación genética (Scn1a K1270T) que fue introducida por CRISPR knock-in hace que los ratones mutantes sean más susceptibles a las convulsiones inducidas por hipertermia.

Hay varias ventajas de adoptar este protocolo, que se resumen a continuación. En primer lugar, a diferencia del uso de corrientes de aire seco o lámparas calentadas, un aire forzado con temperatura controlada establecido dentro de un espacio cerrado proporciona al experimentador más control sobre el calentamiento de la arena de prueba a una velocidad deseada. Los pasos en el protocolo de calentamiento se pueden modificar fácilmente para aumentar / disminuir la temperatura inicial, la duración de cada paso, etc. para detectar ratones más viejos que son roedores más pesados o más grandes, como las ratas. En segundo lugar, el monitoreo continuo de la temperatura corporal del ratón a través de la sonda rectal adjunta, proporciona información valiosa sobre la tasa de cambio de temperatura corporal en ratones individuales, a lo largo del ensayo. Esto permite al experimentador observar de cerca que la tasa de cambio de temperatura en el ratón no supera los 0,25-0,5 °C/min (lo que podría ser estresante para los animales), al adaptar este protocolo a otros ámbitos de prueba. Es importante destacar que la tasa de cambio de la temperatura corporal a lo largo del tiempo en diferentes grupos de ratones puede arrojar luz sobre su capacidad para termorregular y podría ser útil para comprender si las convulsiones febriles que causan mutaciones que también alteran la termorregulación en ratones. En tercer lugar, el monitoreo continuo de la temperatura corporal garantiza que las mediciones de la temperatura del umbral de convulsiones utilizando este protocolo sean precisas, ya que se registran simultáneamente con el primer ataque de convulsiones experimentado por el ratón. Si la temperatura corporal del animal no se controla continuamente o se mide la temperatura del umbral de convulsión después de sacar al animal del campo de prueba, los valores del umbral de convulsión pueden variar debido al tiempo necesario para manejar a los ratones después de las convulsiones. Finalmente, este método evita la necesidad de utilizar métodos invasivos para inducir fiebre (mediante la inyección de patógenos) en ratones para imitar las convulsiones febriles en pacientes humanos.

Una de las limitaciones de este protocolo es que es difícil detectar ratones juveniles (menos de P30 de edad) para detectar convulsiones inducidas por el calor. El protocolo se desarrolló para detectar la sensibilidad de ratones adultos (P30-P40 y superiores) a las convulsiones inducidas por calor o hipertermia. En nuestra experiencia, los ratones de tipo salvaje más jóvenes, especialmente aquellos que pesan menos de 15 g, tienen más probabilidades de sufrir convulsiones inducidas por el calor, lo que podría deberse a mecanismos de termorregulación subdesarrollados, estrés térmico fisiológico o una combinación de ambos. Por lo tanto, no es ideal realizar la prueba de convulsiones inducidas por calor en ratones juveniles utilizando este protocolo.

Los estudios futuros que combinan la monitorización del EEG mientras someten al ratón a convulsiones inducidas por el calor pueden arrojar luz sobre los patrones de convulsiones del EEG de las convulsiones inducidas por el calor, similar a un estudio ^anterior19. La actividad neuronal en áreas específicas en el cerebro del ratón se puede rastrear combinando enfoques optogenéticos y estudios basados en inmunohistoquímica después de la recolección del tejido cerebral. Además, los efectos de las dietas restrictivas como la dieta ceto en la reducción de las convulsiones febriles se pueden evaluar sometiendo a los ratones alimentados con ceto y a los ratones normales alimentados con chow al protocolo de convulsiones inducidas por el calor. Del mismo modo, se pueden desarrollar paradigmas de detección de medicamentos para la epilepsia para probar e identificar fármacos antiepilépticos candidatos que mejoren o supriman las convulsiones inducidas por el calor en ratones alimentados con medicamentos o tratados en comparación con ratones alimentados con vehículos o de control.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axial fan	Farnam	AF20-200-120-xx10-3.1	Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan
Digital temperature controller	Inkbird	ITC-100RH	Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple
Mouse rectal temperature probe	ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc	RET-3	Mouse rectal temperature probe with thermometer