Uso de cambios en la transmisión de hojas para investigar el movimiento de cloroplastos en Arabidopsis thaliana

Resumen

Muchas especies de plantas cambian el posicionamiento de los cloroplastos para optimizar la absorción de la luz. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para investigar el movimiento del cloroplasto en las hojas de Arabidopsis thaliana utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como proxy.

Resumen

Se ha demostrado que el movimiento del cloroplasto en las hojas ayuda a minimizar la fotoinhibición y aumentar el crecimiento bajo ciertas condiciones. Se puede aprender mucho sobre el movimiento del cloroplasto estudiando el posicionamiento del cloroplasto en las hojas utilizando, por ejemplo, microscopía de fluorescencia confocal, pero el acceso a este tipo de microscopía es limitado. Este protocolo describe un método que utiliza los cambios en la transmisión de las hojas como un proxy para el movimiento del cloroplasto. Si los cloroplastos se extienden para maximizar la intercepción de la luz, la transmisión será baja. Si los cloroplastos se mueven hacia las paredes celulares anticlinales para evitar la luz, la transmisión será mayor. Este protocolo describe cómo usar un instrumento sencillo y casero para exponer las hojas a diferentes intensidades de luz azul y cuantificar los cambios dinámicos en la transmisión de las hojas. Este enfoque permite a los investigadores describir cuantitativamente el movimiento del cloroplasto en diferentes especies y mutantes, estudiar los efectos de los productos químicos y los factores ambientales en él, o detectar nuevos mutantes, por ejemplo, para identificar los componentes faltantes en el proceso que conduce desde la percepción de la luz hasta el movimiento de los cloroplastos.

Introducción

La luz es esencial para la fotosíntesis, el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Es uno de los factores abióticos más dinámicos, ya que las intensidades de luz no solo cambian en el transcurso de una estación o día, sino también de manera rápida e impredecible dependiendo de la cubierta de nubes. A nivel de la hoja, las intensidades de luz también están influenciadas por la densidad y la naturaleza de la vegetación circundante y el propio dosel de la planta. Un mecanismo importante que permite a las plantas optimizar la intercepción de la luz en condiciones de luz variables es la capacidad de los cloroplastos para moverse en respuesta a los estímulos de la luz ^azul1,2. En condiciones de poca luz, los cloroplastos se extienden perpendicularmente a la luz (a lo largo de las paredes celulares periclinales) en una llamada respuesta de acumulación, maximizando la intercepción de la luz y, por lo tanto, la fotosíntesis. En condiciones de alta luz, los cloroplastos se mueven hacia la pared celular anticlinal en una llamada respuesta de evitación, minimizando la intercepción de la luz y el peligro de fotoinhibición. En muchas especies, los cloroplastos también asumen una posición oscura específica, que es distinta de las posiciones de acumulación y evitación y a menudo intermediaria entre esas ^dos3,4. Diversos estudios han demostrado que el movimiento del cloroplasto no solo es importante para la tolerancia al estrés a corto plazo de las hojas5,6,7, sino también para el crecimiento y éxito reproductivo de las plantas, especialmente en condiciones de luz ^variable8,9.

El movimiento del cloroplasto se observa fácilmente en tiempo real en ciertos especímenes vivos (por ejemplo, algas o plantas de hojas delgadas como Elodea) utilizando microscopía de ^luz1. Sin embargo, el estudio del movimiento del cloroplasto en la mayoría de las hojas requiere un pretratamiento para inducir el movimiento del cloroplasto, la fijación química y la preparación de secciones transversales antes de ver las muestras bajo un microscopio de ^luz10. Con la introducción de la microscopía láser confocal, también fue posible obtener imágenes de la disposición 3D de cloroplastos en hojas intactas o fijas4,11,12. Estas técnicas de imagen ayudan en gran medida a la comprensión del movimiento del cloroplasto al proporcionar información cualitativa importante. Cuantificar el posicionamiento del cloroplasto (por ejemplo, como porcentaje de cloroplastos en las posiciones periclinal o anticlinal en estas imágenes o el porcentaje de área cubierta por cloroplastos por superficie celular total) también es posible pero requiere bastante tiempo, especialmente si se realiza a los intervalos necesarios para capturar cambios rápidos en el ^{posicionamiento10,8} . La forma más sencilla de mostrar si las hojas adaptadas a la oscuridad de una determinada especie o mutantes son capaces de mover el cloroplasto en la respuesta de evitación es cubriendo la mayor parte del área de una hoja para mantener los cloroplastos en la oscuridad mientras se expone una tira de la hoja a la luz alta. Después de un mínimo de 20 minutos de alta exposición a la luz, los cloroplastos en el área expuesta se habrán movido a la posición de evitación, y la tira expuesta será visiblemente más clara en color que el resto de la hoja. Esto es cierto para el tipo salvaje A. thaliana, pero no para algunos de los mutantes del movimiento del cloroplasto descritos con más detalle más ^adelante13. Este método y sus modificaciones (por ejemplo, invertir qué partes de la hoja están expuestas, cambiar las intensidades de la luz) son útiles para detectar un gran número de mutantes e identificar mutantes nulos que carecen de la capacidad de exhibir una respuesta de evitación o acumulación o ambas. Sin embargo, no proporciona información sobre los cambios dinámicos en el movimiento del cloroplasto.

En contraste, el método descrito aquí permite la cuantificación del movimiento del cloroplasto en hojas intactas utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como un proxy para el movimiento general del cloroplasto: en condiciones en que los cloroplastos se extienden en las células mesófilas en la respuesta de acumulación, se transmite menos luz a través de la hoja que cuando muchos cloroplastos están en una respuesta de evitación, posicionándose a lo largo de las paredes celulares anticlinales. Por lo tanto, los cambios en la transmisión pueden ser utilizados como un proxy para el movimiento general del cloroplasto en las ^hojas14. Los detalles del instrumento se describen en otra parte (consulte el Archivo complementario), pero básicamente, el instrumento utiliza luz azul para activar el movimiento del cloroplasto y mide cuánta luz roja se transmite a través de esa hoja a intervalos establecidos. Más recientemente, se ha descrito una modificación de este sistema, que utiliza un lector de microplacas modificado de 96 pocillos, un LED azul, una computadora y una incubadora de temperatura ^controlada15.

La opción de utilizar una combinación de métodos, incluida la evaluación óptica de las hojas para el cribado, seguida de la medición de los cambios dinámicos en la transmisión y el uso de la microscopía, ha ayudado en gran medida a nuestra comprensión tanto de los mecanismos subyacentes como de la importancia fisiológica / ecológica del movimiento del cloroplasto. Por ejemplo, condujo al descubrimiento y caracterización de varios mutantes, que se ven afectados en aspectos específicos de sus movimientos. Por ejemplo, los mutantes de A. thaliana phot 1 carecen de la capacidad de acumular sus cloroplastos con poca luz, mientras que los mutantes de phot 2 carecen de la capacidad de realizar una reacción de evitación. Estos fenotipos se deben a un deterioro en dos receptores de luz azul respectivos16,17,18. Por el contrario, los mutantes chup1 carecen de la capacidad de formar filamentos de actina adecuados alrededor de los cloroplastos, que son esenciales para mover los cloroplastos a la posición deseada dentro de una ^célula11,19. Además de los estudios mutantes, los investigadores han evaluado los efectos de varios inhibidores en el movimiento del cloroplasto para dilucidar los aspectos mecanicistas del proceso. Por ejemplo, se utilizaron sustancias químicas como el _H2O2 y varios antioxidantes para investigar los efectos de esta molécula de señalización en el movimiento del cloroplasto20. Se utilizaron diversos inhibidores para dilucidar el papel del calcio en el movimiento del ^{cloroplasto21}. Además de ayudar a descubrir los mecanismos del movimiento del cloroplasto, estos métodos se pueden utilizar para comparar el movimiento del cloroplasto en varias especies o mutantes cultivados en diferentes condiciones en un intento de comprender el contexto ecológico y evolutivo de este comportamiento. Por ejemplo, se ha demostrado que el alcance de los efectos de diversas mutaciones en la vía de movimiento del cloroplasto depende de las condiciones ^{de crecimiento7,9}, y que las plantas adaptadas al sol no parecen mover mucho sus cloroplastos. Por el contrario, el movimiento es muy importante para las plantas de sombra10,22,23.

Este documento de métodos, centrado en la planta modelo A. thaliana, describe cómo utilizar un dispositivo de transmisión que es una versión actualizada de un instrumento desarrollado ^previamente9. Si bien este instrumento no está disponible comercialmente, las personas con una comprensión básica de la electrónica o la ayuda de colegas y estudiantes de ingeniería o física podrán construir el instrumento utilizando piezas asequibles y siguiendo las instrucciones detalladas (consulte el Archivo complementario). La plataforma de código abierto utilizada para construir el instrumento tiene un amplio soporte web y un foro comunitario que ofrece ayuda en caso de que surjan ^problemas24.

El protocolo se centra en cómo usar el instrumento para determinar los cambios en la transmisión de la hoja en una carrera exploratoria estándar que expone una hoja a una amplia gama de condiciones de luz y captura las reacciones de oscuridad, acumulación y evitación de A. thaliana. Estas tiradas se pueden modificar dependiendo del objetivo del experimento y se pueden utilizar con la mayoría de las especies de plantas. El documento proporciona ejemplos de datos de transmisión de A. thaliana wildtype y varios mutantes y muestra cómo analizar más a fondo los datos.

Protocolo

1. Preparación de hojas para una carrera

1. Coloque 8 plantas de A. thaliana en la oscuridad durante la noche (> 6 h funciona para la mayoría de las especies) para asegurarse de que los cloroplastos se muevan a su posición oscura. Todas las réplicas comienzan con valores de transmisión comparables.
2. Alternativamente, coloque 8 hojas completas en una placa de Petri con un papel de filtro húmedo en la parte inferior, cierre la placa de Petri y envuélvala con papel de aluminio.

2. Probar si el dispositivo de transmisión funciona

1. Conecte el dispositivo de transmisión a una fuente de alimentación estable y pulse el interruptor de encendido (botón ON/OFF) del dispositivo para restablecer el instrumento (Figura 1A,B).
2. Conecte el iPad a una fuente de alimentación estable, presione el botón Pantalla de inicio para activar la pantalla e ingrese el código de acceso para iniciar sesión.
3. Presione el ícono Configuración , presione el ícono Pantalla y brillo , presione Bloqueo automático y seleccione Nunca presionando esta opción para asegurarse de que la pantalla permanezca encendida permanentemente. De lo contrario, el programa dejará de ejecutarse cuando la pantalla entre en reposo. Presione el botón Pantalla de inicio para volver a la pantalla principal.
4. Presione dos veces el botón Pantalla de inicio para ver qué aplicaciones están abiertas y ciérrelas todas deslizándolas hacia la parte superior de la pantalla. Presione el botón Pantalla de inicio para volver a la pantalla principal.
   1. Busque la aplicación LeafSensor en la pantalla principal o deslizando el dedo hacia la izquierda o hacia la derecha. Pulse el icono de la app para abrirla (ver Archivo Complementario). Aparecerá una pantalla verde con texto y campos blancos para ingresar la información.
   2. Asegúrese de que la palabra Conectado se vea en la parte inferior de la pantalla, ya que indica que la aplicación se está comunicando con el dispositivo de transmisión. Si aparece el mensaje 'Adafruit NOT Found', verifique que el dispositivo esté enchufado y presione el botón de inicio en el dispositivo nuevamente.
5. Rellene los primeros 4 campos de la página de la aplicación para nombrar el experimento y configurar las condiciones para una breve prueba sin hojas y con los clips de hojas abiertos:
   1. Asigne un nombre al experimento (use 8 o menos letras o números en mayúsculas), por ejemplo, escribiendo TEST en el campo llamado Expt Name.
   2. Elija cuántas intensidades de luz azul diferentes se utilizarán en el experimento, por ejemplo, escribiendo 3 en el campo llamado # Intensidades de luz.
   3. Elija las intensidades de luz azul para esta ejecución (elija un entero entre 0 y 3000 y separe cada número del siguiente con una coma; consulte Archivo complementario sobre cómo convertir estos números en intensidades de luz azul reales de LED), por ejemplo, escribiendo 0,100,1000 en el campo llamado Intensidades azules.
   4. Elija el período de tiempo que cada intensidad de luz azul brillará en la hoja (separe cada número del siguiente con una coma), por ejemplo, escribiendo 2,2,2 en el campo llamado Duración azul (minutos).
6. Presione Iniciar experimento en la sección central de la pantalla. En la parte inferior de la pantalla aparecerán 8 guiones y el mensaje Iniciando experimento .
   1. Asegúrese de que no se emita luz desde los LED durante los primeros dos minutos, luego se emita luz azul débil y después de 2 minutos la intensidad de la luz azul está aumentando.
   2. Asegúrese de que los LED emitan luz roja intensa una vez por minuto para las mediciones.
      NOTA: A medida que se ejecuta el experimento, los números aparecerán en la página de la aplicación para cada uno de los ocho sensores, y los datos se actualizarán una vez por minuto. Asegúrese de que los números de salida de los fotodiodos sean alrededor de 1000-1023 (si la habitación está oscura). Una actualización en la parte inferior izquierda muestra cuántas mediciones se realizaron hasta ahora, por ejemplo, se realizó 1 de 6 mediciones (una medición por minuto).
   3. Cuando termine el experimento, compruebe la apariencia del experimento finalizado en la parte inferior izquierda de la página de la aplicación. Ahora el instrumento está listo para una carrera con hojas.
7. Presione dos veces el botón de la pantalla de inicio, deslice el dedo hacia fuera de la aplicación y ábrala nuevamente. Pulse el botón ON/OFF del instrumento para restablecerlo.

3. Configuración de hojas en los clips de hojas

NOTA: Este paso debe hacerse en la oscuridad con una fuente de luz verde (por ejemplo, coloque un filtro verde frente a una bombilla) para evitar inducir el movimiento del cloroplasto. Alternativamente, use luz blanca muy baja y un período oscuro prolongado en los clips de las hojas. Recuerde, una parte del clip de hoja contiene el LED (abertura más grande), mientras que la otra sostiene el fototransistor (Figura 1C).

1. Si las plantas están enteras adaptadas a la oscuridad, elija 8 hojas lo suficientemente anchas como para cubrir los LED. De lo contrario, retire las hojas de la placa de Petri. Prepare 8 tiras de papel de filtro de aproximadamente la longitud de un clip de hoja y con un orificio perforado en la parte superior para no cubrir el LED.
   1. Humedezca el papel de filtro y colóquelo en la parte del clip de hoja que sostiene el LED. Repita esto para cada uno de los clips de ocho hojas.
2. Coloque cada hoja en la parte superior del papel de filtro húmedo de su clip de hoja. Asegúrese de que el lado correcto de la hoja esté orientado hacia el LED (generalmente los experimentos se realizan con la superficie de la hoja adaxial frente al LED).
   1. Evite colocar las costillas medias de la hoja encima de los LED y, para obtener resultados más consistentes, coloque partes similares de cada hoja (por ejemplo, la sección más ancha de la hoja) sobre el LED.
   2. Coloque la otra parte del clip de hoja con el fototransistor en la parte superior. Use una banda elástica para mantener unidas las dos partes del clip de hoja si es necesario (Figura 1C, D).
3. Coloque cada clip de hoja en su "bote" y llene los depósitos con agua con una pipeta. Asegúrese de que la hoja o al menos el papel de filtro toque el agua para evitar la deshidratación de las hojas durante la carrera (Figura 1D).

4. Realización de una carrera

NOTA: Para una carrera exploratoria estándar, comience con 4 h de oscuridad (0 μmol de fotón ^{m-2 s-1}), seguido de 7 h de luz azul baja (2 μmol de fotón ^{m-2 s-1}), seguido de 60 min cada uno de 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol de fotón ^{m-2 s-1} de luz azul. Esto inducirá a las hojas a exhibir su transmisión oscura, inducirá el movimiento del cloroplasto hacia la acumulación máxima y mostrará diferentes grados de respuesta de evitación.

1. Configure la aplicación LeafSensor en el iPad siguiendo los pasos que se describen a continuación.
   1. Escriba EXPLORA1 en el campo denominado Expt Name.
   2. Escriba 10 en el campo denominado # Intensidades de luz.
   3. Escriba 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 en el campo llamado Intensidades azules.
   4. Escriba 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 en el campo denominado Duración azul.
2. Presione Iniciar experimento. Después del primer minuto, los valores de salida (generalmente entre 990 y 820) aparecerán en la pantalla. Si los valores están lejos, compruebe si las hojas se colocaron correctamente en los clips de las hojas.
3. Cuando finalice la ejecución, asegúrese de que el mensaje Experimento finalizado aparezca en la parte inferior izquierda de la pantalla. Los datos se guardarán automáticamente.
   1. Coloque la pantalla en posición vertical (no horizontal). Dos nuevas opciones aparecerán en la pantalla, a saber, Guardar y Utilidades.
   2. Presione Utilidades y aparecerá una lista de archivos guardados. Seleccione el archivo de interés, en este caso, EXPLORA1.
   3. Debajo de la lista de archivos, busque Selected Expt: EXPLORA1. Presione Correo electrónico, ingrese una dirección de correo electrónico y el archivo de datos se adjuntará automáticamente al mensaje. Pulse Enviar.
      NOTA: Si hay un retraso prolongado hasta que lleguen los archivos, reinicie la aplicación y envíe el archivo nuevamente.
4. Si se anuló una ejecución, pero los datos hasta ese momento son de interés, presione Guardar antes de seleccionar Utilidades. Después de varias ejecuciones, limpie el espacio de memoria: presione Utilidades, seleccione un archivo a la vez, deslice el dedo hacia la izquierda junto al archivo y presione Eliminar para eliminar el archivo.
5. Presione Atrás para ejecutar otro experimento o, si ha terminado, presione el botón Pantalla de inicio, deslice el dedo a la pantalla principal, presione Configuración, presione Pantalla y brillo, presione Bloqueo automático y presione 2 minutos.

5. Análisis de datos

1. Descargue el archivo EXPLORA1 desde el correo electrónico, agregue la extensión .csv al archivo, haga doble clic en el archivo. Los datos se ordenarán en una hoja de cálculo con los datos de los ocho sensores diferentes ordenados en columnas separadas. La última columna muestra el tiempo (en segundos) en el que se recopilaron los datos. Elimine la primera fila debajo de los encabezados (Sensor1-8) si contiene datos sin sentido.
2. Configure una hoja de datos maestra que contendrá los resultados de cada sensor en una hoja separada y que convierte los valores de salida en valores de transmisión de % utilizando las ecuaciones obtenidas de la calibración de cada clip de hoja y sensor (consulte Archivo complementario).
   1. Copie cada conjunto de datos en una hoja de datos independiente (por ejemplo, la columna A contiene la hora; la columna C contiene los datos del sensor1).
   2. Configure la columna B para que convierta el tiempo de segundos a minutos. Configure la columna D para que contenga la fórmula para convertir el voltaje a % de transmisión utilizando la ecuación de la calibración.
   3. Configure una hoja de datos similar para cada sensor y recuerde que la fórmula utilizada para convertir la salida de voltaje en % los valores de transmisión pueden ser diferentes para cada sensor.
3. Gráfico % transmisión (T) contra el tiempo, min (Figura 2).
4. Guarde la hoja de datos con un nuevo nombre para que la hoja de datos maestra se pueda reutilizar.
5. Para analizar más a fondo los datos (Figura 2), calcule la acumulación de ΔT (%) (por ejemplo, el cambio de T en la acumulación máxima en comparación con T en la oscuridad), la evitación de ΔT ( %) (por ejemplo, el cambio de T en la evitación máxima en comparación con T en la oscuridad ) o dT / dt (% / h) (por ejemplo, el cambio en T durante la parte más rápida de la reacción de acumulación o evitación). Para más detalles, véase ⁸.

Resultados

Las diferentes partes del dispositivo de transmisión se muestran en la Figura 1. El microcontrolador es la unidad de control del dispositivo y controla las condiciones de luz que experimentan las hojas, aseguradas en clips de hojas negras, y almacena los datos de transmisión de luz que recibe (Figura 1A, B). Un primer plano de la unidad de control del instrumento muestra el botón ON/ OFF, la tarjeta SD para la capacidad de almacenamiento de d...

Discusión

El dispositivo es extremadamente fácil de usar, pero es de crucial importancia calibrar cada configuración de clip de hoja del dispositivo de transmisión de forma independiente, ya que el posicionamiento de los LED y fototransistores puede variar ligeramente de un clip de hoja a otro. Asegúrese de que los LED y los fototransistores se inserten de manera estable y vuelva a verificar la calibración si los datos parecen estar apagados. Evite que entre agua en el dispositivo. Las hojas en los clips de las hojas se coloc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water