Arabidopsis thaliana'daki Kloroplast Hareketini Araştırmak için Yaprak İletiminde Değişiklikleri Kullanma

Özet

Birçok bitki türü, ışık emilimini optimize etmek için kloroplastların konumunu değiştirir. Bu protokol, Arabidopsis thaliana yapraklarındaki kloroplast hareketini araştırmak için basit, ev yapımı bir aletin, ışığın bir yapraktan vekaleten iletilmesindeki değişiklikleri kullanarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

Yapraklardaki kloroplast hareketinin fotoinhibisyasyonu en aza indirmeye ve belirli koşullar altında büyümeyi artırmaya yardımcı olduğu gösterilmiştir. Kloroplast hareketi hakkında, örneğin konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak yapraklardaki kloroplast konumlandırması incelenerek çok şey öğrenilebilir, ancak bu tür mikroskopiye erişim sınırlıdır. Bu protokol, yaprak iletimi değişikliklerini kloroplast hareketi için proxy olarak kullanan bir yöntemi açıklar. Kloroplastlar ışık kesmeyi en üst düzeye çıkarmak için yayılırsa, iletim düşük olacaktır. Kloroplastlar ışıktan kaçınmak için anticlinal hücre duvarlarına doğru hareket ederse, iletim daha yüksek olacaktır. Bu protokol, yaprakları farklı mavi ışık yoğunluklarına maruz bırakmak ve yaprak iletimindeki dinamik değişiklikleri ölçmek için basit, ev yapımı bir cihazın nasıl kullanılacağını açıklar. Bu yaklaşım, araştırmacıların farklı türlerde ve mutantlarda kloroplast hareketini nicel olarak tanımlamalarına, kimyasalların ve çevresel faktörlerin üzerindeki etkilerini incelemelerine veya örneğin ışık algısından kloroplastların hareketine yol açan süreçte eksik bileşenleri belirlemek için yeni mutantları taramalarına olanak tanır.

Giriş

Işık fotosentez, bitki büyümesi ve gelişme için gereklidir. Işık yoğunlukları sadece bir mevsim veya gün boyunca değil, aynı zamanda bulut örtüsüne bağlı olarak hızlı ve öngörülemeyen şekillerde değiştiği için en dinamik abiyotik faktörlerden biridir. Yaprak seviyesinde, ışık yoğunlukları da çevredeki bitki örtüsünün ve bitkinin kendi gölgeliğinin yoğunluğundan ve doğasından etkilenir. Bitkilerin değişken ışık koşullarında ışık kesmeyi optimize etmelerini sağlayan önemli bir mekanizma, kloroplastların mavi ışık uyaranlarına yanıt olarak hareket ^{edebilmesidir1,2}. Düşük ışık koşullarında, kloroplastlar ışığa (periclinal hücre duvarları boyunca) dik olarak, sözde bir biriktirme tepkisiyle yayılır, ışık kesmeyi ve dolayısıyla fotosentezi en üst düzeye çıkarır. Yüksek ışık koşullarında, kloroplastlar anticlinal hücre duvarına doğru kaçınma tepkisi olarak hareket eder ve ışık kesmeyi ve fotoinhibisyon tehlikesini en aza indirir. Birçok türde, kloroplastlar ayrıca birikim ve kaçınma pozisyonlarından farklı ve genellikle ^{bu ikisi arasında} aracı olan belirli bir karanlık pozisyon üstlenir^. Çeşitli çalışmalar kloroplast hareketinin sadece yaprakların kısa süreli stres toleransı için değil^, aynı zamanda bitkilerin büyümesi ve üreme başarısı için, özellikle değişken ışık koşullarında önemli olduğunu ^{göstermiştir8,9}.

Kloroplast hareketi, hafif mikroskopi1 kullanılarak bazı canlı örneklerde (örneğin, algler veya Elodea gibi ince yapraklı bitkiler) gerçek zamanlı olarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, çoğu yapraktaki kloroplast hareketini incelemek, örnekleri hafif bir mikroskop altında görüntülemeden önce kloroplast hareketini, kimyasal fiksasyonu ve kesitlerin hazırlanmasını teşvik etmek için bir ön işlem ^gerektirir10. Konfokal lazer mikroskopinin devreye girmesiyle kloroplastların 3D düzenini sağlam veya sabit yapraklarda görüntüleyebilmiştir4,11,12. Bu görüntüleme teknikleri önemli nitel bilgiler sağlayarak kloroplast hareketinin anlaşılmasına büyük ölçüde yardımcı olmaktır. Kloroplast konumlandırmasının ölçülmesi (örneğin, bu görüntülerdeki periklinal veya anticlinal pozisyonlardaki kloroplastların yüzdesi veya toplam hücre yüzeyi başına kloroplastların kapladığı alan yüzdesi olarak) da mümkündür, ancak özellikle konumlandırmada hızlı değişiklikleri yakalamak için gerekli aralıklarla yapılırsa oldukça zaman ^{alıcıdır10,8} . Belirli bir türün veya mutantların koyu adapte olmuş yapraklarının kaçınma tepkisine kloroplast hareketi yapıp yapamayacağını göstermenin en basit yolu, yaprağın bir şeridini yüksek ışığa maruz bırakırken kloroplastları karanlıkta tutmak için bir yaprağın alanının çoğunu örtmektir. En az 20 dakikalık yüksek ışığa maruz kaldıktan sonra, maruz kalan bölgedeki kloroplastlar kaçınma pozisyonuna taşınmış olacak ve açık şerit yaprağın geri kalanından gözle görülür şekilde daha açık renkte olacaktır. Bu, vahşi A tipi A. thaliana için geçerlidir, ancak daha sonra ^13'te daha ayrıntılı olarak açıklanan bazı kloroplast hareketi mutantları için geçerli değildir. Bu yöntem ve modifikasyonları (örneğin, yaprağın hangi kısımlarının açığa çıktığı, ışık yoğunluklarını değiştirmek) çok sayıda mutantın taranması ve kaçınma veya biriktirme yanıtı veya her ikisi de sergilenebilme yeteneğinden yoksun boş mutantları tanımlamak için yararlıdır. Ancak kloroplast hareketlerindeki dinamik değişiklikler hakkında bilgi vermez.

Buna karşılık, burada açıklanan yöntem, genel kloroplast hareketi için bir proxy olarak bir yaprak aracılığıyla ışık iletiminde değişiklikler kullanarak bozulmamış yapraklarda kloroplast hareketinin nicelleştirilmesine izin verir: kloroplastların birikim yanıtındaki mezofil hücrelerinde yayıldığı koşullarda, yaprak yoluyla birçok kloroplastın kaçınma tepkisinde olduğundan daha az ışık iletilir, kendilerini anticlinal hücre duvarları boyunca konumlandırmak. Bu nedenle, iletimdeki değişiklikler ^{leaves14'teki} genel kloroplast hareketi için bir proxy olarak kullanılabilir. Cihazın ayrıntıları başka bir yerde açıklanmıştır (bkz. Tamamlayıcı Dosya), ancak temel olarak, cihaz kloroplast hareketini tetiklemek için mavi ışık kullanır ve belirli aralıklarla bu yapraktan ne kadar kırmızı ışık geçtiğini ölçer. Daha yakın zamanda, değiştirilmiş bir 96 kuyu mikro plaka okuyucusu, mavi bir LED, bir bilgisayar ve sıcaklık kontrollü bir ^{inkübatör15} kullanan bu sistemin bir modifikasyonu tanımlanmıştır.

Tarama için yaprakların optik değerlendirmesi, ardından iletimdeki dinamik değişikliklerin ölçülmesi ve mikroskopi kullanımı da dahil olmak üzere yöntemlerin bir kombinasyonunu kullanma seçeneği, hem alttaki mekanizmaları hem de kloroplast hareketinin fizyolojik / ekolojik önemini anlamamıza büyük ölçüde yardımcı olmuştur. Örneğin, hareketlerinin belirli yönlerinde bozulan çeşitli mutantların keşfedilmesine ve karakterizasyonuna yol açtı. Örneğin, A. thaliana phot 1 mutantları kloroplastlarını düşük ışıkta biriktirme yeteneğinden yoksunken, phot 2 mutantları kaçınma reaksiyonu gerçekleştirme yeteneğinden yoksundir. Bu fenotipler, ilgili iki mavi ışık reseptöründeki bir bozulmadan kaynaklanmaktadır16,17,18. Buna karşılık, chup1 mutantları, kloroplastları bir hücre içinde istenen konuma taşımak için gerekli olan kloroplastların etrafında uygun aktivasyon filamentleri oluşturma yeteneğinden ^{yoksundur11,19}. Mutant çalışmalara ek olarak, araştırmacılar sürecin mekanistik yönlerini aydınlatmak için çeşitli inhibitörlerin kloroplast hareketi üzerindeki etkilerini değerlendirmişlerdir. Örneğin, bu sinyal molekülünün kloroplast hareketi üzerindeki etkilerini araştırmak için _H2O2 ve çeşitli antioksidanlar gibi kimyasallar ^{kullanılmıştır20}. Kloroplast hareketinde kalsiyumun rolünü aydınlatmak için çeşitli inhibitörler ^{kullanılmıştır21}. Kloroplast hareketinin mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olup, bu yöntemler, bu davranışın ekolojik ve evrimsel bağlamını anlamak amacıyla çeşitli türlerde veya farklı koşullarda yetişen mutantlardaki kloroplast hareketini karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, kloroplast hareket yolundaki çeşitli mutasyonların etkilerinin boyutunun büyüme koşullarına bağlı olduğu ^{gösterilmiştir7,9} ve güneşe uyarlanmış bitkilerin kloroplastlarını çok fazla hareket ettirmiyor gibi görünmektedir. Buna karşılık, gölge bitkileri için hareket çok önemlidir10,22,23.

Bu yöntemler kağıt, model bitki A. thaliana odaklanmış, daha önce geliştirilmiş bir ^{enstrümanın} güncellenmiş bir sürümü olan bir iletim cihazının nasıl kullanılacağını açıklar9. Bu cihaz ticari olarak mevcut olmasa da, temel bir elektronik anlayışına veya mühendislik veya fizik meslektaşlarının ve öğrencilerin yardımına sahip kişiler, uygun fiyatlı parçalar kullanarak ve ayrıntılı talimatları izleyerek cihazı inşa edebilecektir (bkz. Enstrümanı oluşturmak için kullanılan açık kaynaklı platform, kapsamlı bir web desteğine ve sorunlar ortaya çıktığında yardım sunan bir topluluk forumuna ^sahiptir24.

Protokol, bir yaprağı çok çeşitli ışık koşullarına maruz bırakan ve A. thaliana'nın karanlık, birikim ve kaçınma reaksiyonlarını yakalayan standart bir keşif çalışmasında yaprak iletimindeki değişiklikleri belirlemek için aletin nasıl kullanılacağına odaklanır. Bu çalıştırmalar deneyin amacına bağlı olarak değiştirilebilir ve çoğu bitki türüyle kullanılabilir. Makale, A. thaliana wildtype ve birkaç mutantın iletim verilerine örnekler sunar ve verilerin nasıl daha fazla analizılacağını gösterir.

Protokol

1. Yaprakları koşuya hazırlama

1. Kloroplastların karanlık konumlarına geçmesini sağlamak için 8 A. thaliana bitkilerini bir gecede karanlıkta yerleştirin (> 6 saat çoğu tür için çalışır). Tüm yinelemeler karşılaştırılabilir iletim değerleriyle başlar.
2. Alternatif olarak, 8 tam yaprağı altta nemli bir filtre kağıdı olan bir Petri kabına yerleştirin, Petri kabını kapatın ve alüminyum folyo ile sarın.

2. İletim cihazının çalışıp çalışmadığını test etme

1. İletim cihazını kararlı bir güç kaynağına bağlayın ve cihazı sıfırlamak için cihazın güç anahtarına (KAPA/KAPA DÜĞMESI) basın (Şekil 1A,B).
2. iPad'i kararlı bir güç kaynağına bağlayın, ekranı etkinleştirmek için Ana Ekran düğmesine basın ve giriş yapmak için şifreyi girin.
3. Ayarlar simgesine basın, Ekran ve Parlaklık simgesine basın, Otomatik Kilitle'ye basın ve ekranın kalıcı olarak açık kalmasını sağlamak için bu seçeneğe basarak Hiçbir zaman'ı seçin. Aksi takdirde, ekran uyku moduna geçtiğinde program çalışmayı durdurur. Ana ekrana dönmek için Ana Ekran düğmesine basın.
4. Hangi uygulamaların açık olduğunu görmek için Ana Ekran düğmesine çift basın ve hepsini ekranın üst kısmına doğru kaydırarak kapatın. Ana ekrana dönmek için Ana Ekran düğmesine basın.
   1. LeafSensor uygulamasını ana ekranda veya sola veya sağa kaydırarak bulun. Açmak için uygulamanın simgesine basın (bkz. Ek Dosya). Bilgileri girmek için metin ve beyaz alanları içeren yeşil bir ekran görünecektir.
   2. Uygulamanın iletim cihazıyla iletişim kurduğunu gösterdiğinden Bağlı kelimesinin ekranın alt kısmında görüldüğünden emin olun. 'Adafruit BULUNAMADı' mesajı görüntülenirse, cihazın takılı olup olmadığını kontrol edin ve cihazdaki başlat düğmesine tekrar basın.
5. Denemeyi adlandırmak ve yapraksız ve yaprak klipleri açık kısa bir test çalışması için koşulları ayarlamak için uygulama sayfasındaki ilk 4 alanı doldurun:
   1. Denemeyi adlandırın (örneğin, Expt Name adlı alana TEST yazarak 8 veya daha az büyük harf veya sayı kullanın).
   2. Deneyde kaç farklı mavi ışık yoğunluğu kullanılacağını seçin, örneğin # Işık Yoğunlukları adlı alana 3 yazarak.
   3. Bu çalıştırma için mavi ışık yoğunluklarını seçin (0 ile 3000 arasında bir tamsayı seçin ve her sayıyı virgülle bir sonrakinden ayırın; örneğin Mavi Yoğunluklar adlı alana 0.100.1000 yazarak bu sayıların LED'lerin gerçek mavi ışık yoğunluklarına nasıl dönüştürüleceğine ilişkin Ek Dosya'ya bakın.
   4. Her mavi ışık yoğunluğunun yaprak üzerinde parlayacağı süreyi seçin (her sayıyı virgülle bir sonrakinden ayırın), örneğin Mavi Süre (dakika) adlı alana 2,2,2 yazarak.
6. Ekranın orta bölümünde Denemeyi Başlat'a basın. Ekranın alt kısmında 8 tire ve Başlangıç Deneyi mesajı görünecektir.
   1. İlk iki dakika LED'lerden ışık yayılmadığından, daha sonra zayıf mavi ışık yayıldığından ve 2 dakika sonra mavi ışık yoğunluğunun arttığından emin olun.
   2. Ölçümler için dakikada bir kez LED'lerden yoğun kırmızı ışık yayıldığından emin olun.
      NOT: Deneme çalışırken, sekiz sensörün her biri için uygulama sayfasında sayılar görünecek ve veriler dakikada bir kez güncellenecektir. Fotodiyotlardan çıkış numaralarının 1000-1023 civarında olduğundan emin olun (oda karanlıksa). Sol alttaki bir güncelleme, şimdiye kadar kaç ölçüm yapıldığını gösterir, örneğin, 6 ölçümden 1'ini yaptı (her dakika bir ölçüm).
   3. Deneme tamamlandığında, uygulama sayfasının sol alt tarafında tamamlanan Denemenin görünümünü kontrol edin. Şimdi enstrüman yapraklarla koşmaya hazır.
7. Ana Ekran düğmesine iki kez basın, uygulamadan çekin ve tekrar açın. Sıfırlamak için cihazın açık/KAPA düğmesini basılın.

3. Yaprak klipslerinde yaprakların ayarlanması

NOT: Bu adım, kloroplast hareketinin teşvikini önlemek için karanlıkta yeşil bir ışık kaynağıyla (örneğin, bir ampulun önüne yeşil bir filtre yerleştirin) yapılmalıdır. Alternatif olarak, yaprak klipslerinde çok düşük beyaz ışık ve uzun bir karanlık dönem kullanın. Unutmayın, yaprak klibinin bir kısmı LED'i (daha büyük açıklık) tutarken, diğeri fototransistörü tutar (Şekil 1C).

1. Bitkiler tamamen koyuya uyarlanmışsa, LED'leri kaplayacak kadar geniş 8 yaprak seçin. Aksi takdirde, yaprakları Petri kabından çıkarın. Bir yaprak klipsinin uzunluğu hakkında ve LED'i örtmemek için üstte bir delik açarak 8 şerit filtre kağıdı hazırlayın.
   1. Filtre kağıdını nemlendirin ve LED'i tutan yaprak klipsi kısmına yerleştirin. Sekiz yaprak klipsinin her biri için bunu tekrarlayın.
2. Her yaprağı yaprak klibinin ıslak filtre kağıdının üstüne yerleştirin. Doğru yaprak tarafının LED'e doğru dönük olduğundan emin olun (genellikle deneyler LED'e bakan adaxial yaprak yüzeyi ile yapılır).
   1. Yaprağın ortalarını LED'lerin üzerine yerleştirmekten kaçının ve daha tutarlı sonuçlar için, her yaprağın benzer kısımlarını (örneğin, yaprağın en geniş bölümü) LED'in üzerine yerleştirin.
   2. Diğer yaprak klipsi kısmını fototransistörün üzerine yerleştirin. Gerekirse iki yaprak klipsi parçasını bir arada tutmak için bir lastik bant kullanın (Şekil 1C,D).
3. Her yaprak klipsini 'teknesine' yerleştirin ve rezervuarları bir pipet kullanarak suyla doldurun. Çalışma sırasında yaprakların susuz kalmasını önlemek için yaprağın veya en azından filtre kağıdının suya değmesini sağlayın (Şekil 1D).

4. Bir koşunun yürütülmesi

NOT: Standart bir keşif çalışması için, 4 saat karanlıkla başlayın (0 μmol foton ^{m-2 s-1}), ardından 7 saat düşük mavi ışık (2 μmol foton ^{m-2 s-1}), ardından 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol foton ^{m-2 s-1} mavi ışığın her biri 60 dk. Bu, yaprakların koyu iletimlerini sergilemeye, kloroplast hareketini maksimum birikime teşvik etmeye ve farklı derecelerde kaçınma tepkisi göstermeye teşvik edecektir.

1. Aşağıda açıklanan adımları kullanarak iPad'de LeafSensor uygulamasını ayarlayın.
   1. Expt Adı adlı alana EXPLORA1 yazın.
   2. # Işık Yoğunlukları adlı alana 10 yazın.
   3. Mavi yoğunluklar adlı alana 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 yazın.
   4. Mavi Süre adlı alana 240.420.60.60.60.60.60.60.60.60 yazın.
2. Denemeyi Başlat'a basın. İlk dakikadan sonra, çıkış değerleri (genellikle 990 ile 820 arasında) ekranda görünecektir. Değerler uzaksa, yaprakların yaprak klipslerine doğru yerleştirilmiş olup olmadığını kontrol edin.
3. Çalıştırma tamamlandığında, Deneme Tamamlandı iletisinin ekranın sol alt kısmında göründüğünden emin olun. Veriler otomatik olarak kaydedilecektir.
   1. Ekranı dik konuma getirin (yatay değil). Ekranda Kaydet ve Yardımcı Programlar olmak üzere iki yeni seçenek görünecektir.
   2. Yardımcı Programlar'a basın ve kaydedilen dosyaların listesi görüntülenir. İlgi çekici dosyayı seçin, bu durumda EXPLORA1.
   3. Dosya listesinin altında , Selected Expt: EXPLORA1'i arayın. E-posta'ya basın, bir e-posta adresi girin ve veri dosyası otomatik olarak iletiye eklenir. Gönder'e basın.
      NOT: Dosyalar gelene kadar uzun bir gecikme olursa, uygulamayı yeniden başlatın ve dosyayı yeniden gönderin.
4. Bir çalıştırma iptal edildiyse, ancak bu noktaya kadar olan veriler ilgi çekiciyse, Yardımcı Programlar'ı seçmeden önce Kaydet'e basın. Birkaç çalıştırmadan sonra bellek alanını temizleyin: Yardımcı Programlar'a basın, her seferinde bir dosya seçin, dosyanın yanında sola kaydırın ve dosyayı kaldırmak için Delete tuşuna basın.
5. Başka bir deneme çalıştırmak için Geri tuşuna basın veya yapılırsa, Ana Ekran düğmesine basın, ana ekrana kaydırın, Ayarlar'a basın, Ekran ve Parlaklık'a basın, Otomatik Kilitle'ye basın ve 2 Dakika'ya basın.

5. Veri analizi

1. EXPLORA1 dosyasını e-postadan indirin, dosyaya uzantı .csv ekleyin, dosyayı çift tıklatın. Veriler, sekiz farklı sensörün verileri ayrı sütunlara ayrı olarak sıralanmış bir elektronik tabloya sıralanır. Son sütun, verilerin toplandığı zamanı (saniye olarak) gösterir. Anlamsız veriler içeriyorsa, başlıklar altındaki ilk satırı (Sensor1-8) silin.
2. Her sensörün sonuçlarını ayrı bir sayfada içerecek ve her yaprak klibinin ve sensörün kalibrasyonundan elde edilen denklemleri kullanarak çıkış değerlerini % iletim değerlerine dönüştüren bir ana veri sayfası ayarlayın (bkz.
   1. Her veri kümesini ayrı bir veri sayfasına kopyalayın (örneğin, A sütunu saati içerir; C sütunu Sensor1 verilerini içerir).
   2. B sütununu, zamanı saniyelerden dakikalara dönüştürecek şekilde ayarlayın. D sütununu, kalibrasyondaki denklemi kullanarak voltajı % iletimine dönüştürmek için formülü içeren şekilde ayarlayın.
   3. Her sensör için benzer bir veri sayfası kurun ve voltaj çıkışını % iletim değerlerine dönüştürmek için kullanılan formülün her sensör için farklı olabileceğini unutmayın.
3. Arsa % iletim (T) zamana karşı, min (Şekil 2).
4. Ana veri sayfasının yeniden kullanılabilmesi için veri sayfasını yeni bir adla kaydedin.
5. Verileri daha fazla analiz etmek için (Şekil 2), ΔT (%) birikimini (örneğin, karanlıkta T'ye kıyasla maksimum birikimde T değişimi), ΔT (%) kaçınmayı (örneğin, karanlıkta T'ye kıyasla maksimum kaçınmada T değişimi) veya dT/dt (%/h) (örneğin, birikimin veya kaçınma reaksiyonunun en hızlı kısmı sırasında T'deki değişim) hesaplayın. Daha fazla ayrıntı için ^bkz.

Sonuçlar

İletim cihazının farklı parçaları Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikrodenetleyici cihazın kontrol ünitesidir ve siyah yaprak klipsleriyle sabitlenerek yaprakların yaşadığı ışık koşullarını kontrol eder ve aldığı ışık iletim verilerini saklar (Şekil 1A,B). Cihazın kontrol ünitesinin yakın çekiminde AÇMA/KAPALI düğmesi, veri depolama özelliği için SD kart, Bluetooth kalkanı (verileri LeafSensor uygulama...

Tartışmalar

Cihazın kullanımı son derece kolaydır, ancak LED'lerin ve fototransistörlerin konumlandırılması yaprak klipsinden yaprak klipsine biraz değişebileceğinden, iletim cihazının her yaprak klipsi kurulumunu bağımsız olarak kalibre etmek çok önemlidir. LED'lerin ve fototransistörlerin saptanarak yerleştirildiğinden emin olun ve veriler kapalı görünüyorsa kalibrasyonu yeniden kontrol edin. Cihaza su almaktan kaçının. Yaprak klipslerindeki yapraklar, su stresini önlemek için su dolu 'teknelere' yerl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water