Usando mudanças na transmissão de folhas para investigar movimento de cloroplasto em Arabidopsis thaliana

Resumo

Muitas espécies de plantas alteram o posicionamento de cloroplastos para otimizar a absorção de luz. Este protocolo descreve como usar um instrumento simples e caseiro para investigar o movimento do cloroplasto nas folhas arabidopsis thaliana usando mudanças na transmissão da luz através de uma folha como proxy.

Resumo

O movimento do cloroplasto nas folhas tem sido mostrado para ajudar a minimizar a fotoinibição e aumentar o crescimento sob certas condições. Muito pode ser aprendido sobre o movimento do cloroplasto estudando o posicionamento do cloroplasto nas folhas usando, por exemplo, microscopia de fluorescência confocal, mas o acesso a esse tipo de microscopia é limitado. Este protocolo descreve um método que usa as mudanças na transmissão de folhas como um proxy para o movimento do cloroplasto. Se os cloroplastos se espalharem para maximizar a interceptação de luz, a transmissão será baixa. Se os cloroplastos se moverem em direção às paredes celulares anticlinais para evitar a luz, a transmissão será maior. Este protocolo descreve como usar um instrumento simples e caseiro para expor as folhas a diferentes intensidades de luz azul e quantificar as mudanças dinâmicas na transmissão de folhas. Essa abordagem permite que os pesquisadores descrevam quantitativamente o movimento do cloroplasto em diferentes espécies e mutantes, estudem os efeitos de produtos químicos e fatores ambientais sobre ele, ou tela para novos mutantes, por exemplo, para identificar componentes ausentes no processo que leva da percepção da luz ao movimento de cloroplastos.

Introdução

A luz é essencial para fotossíntese, crescimento das plantas e desenvolvimento. É um dos fatores abióticos mais dinâmicos, pois as intensidades de luz não só mudam ao longo de uma estação ou dia, mas também de forma rápida e imprevisível, dependendo da cobertura da nuvem. No nível da folha, as intensidades de luz também são influenciadas pela densidade e natureza da vegetação circundante e do próprio dossel da planta. Um mecanismo importante que permite que as plantas otimizem a interceptação de luz em condições de luz variável é a capacidade de os cloroplastos se moverem em resposta aos estímulos da luz ^azul1,2. Sob condições de baixa luz, os cloroplastos se espalham perpendicularmente à luz (ao longo das paredes celulares periclínicas) em uma chamada resposta de acumulação, maximizando a interceptação de luz e, portanto, a fotossíntese. Sob altas condições de luz, os cloroplastos se movem em direção à parede celular anticlinal em uma chamada resposta de evasão, minimizando a interceptação de luz e o perigo de fotoinibição. Em muitas espécies, os cloroplastos também assumem uma posição escura específica, que é distinta das posições de acumulação e evasão e muitas vezes intermediária entre esses ^dois3,4. Vários estudos têm demonstrado que o movimento do cloroplasto não é apenas importante para a tolerância ao estresse de curto prazo das ^folhas5,6,7, mas também para o crescimento e sucesso reprodutivo das plantas, especialmente em condições de luz ^variável8,9.

O movimento do cloroplasto é facilmente observado em tempo real em certos espécimes vivos (por exemplo, algas ou plantas de folhas finas como Elodea) usando microscopia ^leve1. Estudar o movimento do cloroplasto na maioria das folhas, no entanto, requer um pré-tratamento para induzir o movimento do cloroplasto, fixação química e preparação de seções transversais antes de visualizar as amostras sob um microscópio ^leve10. Com a introdução da microscopia a laser confocal, também tornou-se possível a imagem do arranjo 3D de cloroplastos em folhas intactas ou fixas4,11,12. Essas técnicas de imagem auxiliam muito a compreensão do movimento do cloroplasto, fornecendo informações qualitativas importantes. Quantificar o posicionamento de cloroplasto (por exemplo, como uma porcentagem de cloroplastos nas posições periclínicas ou anticlinais nestas imagens ou a porcentagem de área coberta por cloroplastos por superfície celular total) também é possível, mas bastante demorado, especialmente se realizado nos intervalos necessários para capturar mudanças rápidas no ^{posicionamento10,8} . A maneira mais simples de mostrar se as folhas adaptadas escuras de uma determinada espécie ou mutantes são capazes de movimento de cloroplasto na resposta de evasão é cobrindo a maior parte da área de uma folha para manter os cloroplastos no escuro enquanto expõe uma tira da folha à luz alta. Após um mínimo de 20 minutos de alta exposição à luz, os cloroplastos na área exposta terão se movido para a posição de evasão, e a faixa exposta será visivelmente mais clara em cores do que o resto da folha. Isso é verdade para o tipo selvagem A. thaliana, mas não para alguns dos mutantes do movimento cloroplasto descritos com mais detalhes mais tarde em ¹³. Este método e modificações dele (por exemplo, invertendo quais partes da folha estão expostas, mudando a intensidade da luz) são úteis para a triagem de um grande número de mutantes e para identificar mutantes nulos que não têm a capacidade de exibir uma resposta de evasão ou acumulação ou ambos. No entanto, não fornece informações sobre as mudanças dinâmicas no movimento do cloroplasto.

Em contraste, o método aqui descrito permite a quantificação do movimento do cloroplasto em folhas intactas usando mudanças na transmissão de luz através de uma folha como proxy para o movimento global de cloroplasto: em condições em que cloroplastos são espalhados nas células de mesófila na resposta de acumulação, menos luz é transmitida através da folha do que quando muitos cloroplastos estão em resposta de evasão, posicionando-se ao longo das paredes celulares anti-cílicas. Assim, mudanças na transmissão podem ser usadas como proxy para o movimento global de cloroplasto nas ^folhas14. Os detalhes do instrumento são descritos em outros lugares (ver Arquivo Suplementar), mas basicamente, o instrumento usa luz azul para desencadear o movimento do cloroplasto e mede a quantidade de luz vermelha transmitida através dessa folha em intervalos definidos. Mais recentemente, foi descrita uma modificação deste sistema, que usa um leitor modificado de microplaca de 96 poços, um LED azul, um computador e uma incubadora controlada pela ^{temperatura15}.

A opção de utilizar uma combinação de métodos, incluindo a avaliação óptica das folhas para triagem, seguida pela medição de mudanças dinâmicas na transmissão e no uso da microscopia, tem ajudado muito a nossa compreensão tanto dos mecanismos subjacentes quanto da significância fisiológica/ecológica do movimento cloroplasto. Por exemplo, levou à descoberta e caracterização de vários mutantes, que são prejudicados em aspectos específicos de seus movimentos. Por exemplo, os mutantes A. thaliana phot 1 não têm a capacidade de acumular seus cloroplastos com pouca luz, enquanto os mutantes phot 2 não têm a capacidade de realizar uma reação de evasão. Esses fenótipos são devidos a um prejuízo em dois respectivos receptores de luz azul16,17,18. Em contraste, os mutantes chup1 não têm a capacidade de formar filamentos de actina adequados ao redor dos cloroplastos que são essenciais para mover os cloroplastos para a posição desejada dentro de uma ^célula11,19. Além de estudos mutantes, pesquisadores têm avaliado os efeitos de vários inibidores no movimento do cloroplasto para elucidar os aspectos mecanicistas do processo. Por exemplo, produtos químicos como _H2O2 e vários antioxidantes foram usados para investigar os efeitos desta molécula de sinalização no movimento do cloroplasto20. Vários inibidores foram usados para elucidar o papel do cálcio no movimento ^{cloroplasto21}. Além de ajudar a descobrir os mecanismos do movimento do cloroplasto, esses métodos podem ser usados para comparar o movimento do cloroplasto em várias espécies ou mutantes cultivados em diferentes condições na tentativa de entender o contexto ecológico e evolutivo desse comportamento. Por exemplo, foi demonstrado que a extensão dos efeitos de várias mutações na via de movimento do cloroplasto dependem das condições de ^{crescimento7,9}, e que as plantas adaptadas ao sol não parecem mover muito seus cloroplastos. Em contrapartida, o movimento é muito importante para as plantas de sombra10,22,23.

Este artigo de métodos, focado na planta modelo A. thaliana, descreve como usar um dispositivo de transmissão que é uma versão atualizada de um instrumento previamente ^{desenvolvido9}. Embora este instrumento não esteja disponível comercialmente, pessoas com uma compreensão básica da eletrônica ou da ajuda de colegas de engenharia ou física e estudantes poderão construir o instrumento usando peças acessíveis e seguindo as instruções detalhadas (ver Arquivo Suplementar). A plataforma de código aberto usada para construir o instrumento tem amplo suporte web e um fórum comunitário que oferece ajuda caso surjam ^problemas24.

O protocolo se concentra em como usar o instrumento para determinar mudanças na transmissão de folhas em uma execução exploratória padrão que expõe uma folha a uma ampla gama de condições de luz e captura as reações escuras, de acumulação e evasão de A. thaliana. Essas corridas podem ser modificadas dependendo do objetivo do experimento e podem ser usadas com a maioria das espécies vegetais. O artigo fornece exemplos de dados de transmissão de A. thaliana wildtype e vários mutantes e mostra como analisar melhor os dados.

Protocolo

1. Preparar folhas para uma corrida

1. Coloque 8 plantas de A. thaliana no escuro durante a noite (> 6 h funciona para a maioria das espécies) para garantir que os cloroplastos se movam para sua posição escura. Todas as réplicas começam com valores de transmissão comparáveis.
2. Alternativamente, coloque 8 folhas completas em uma placa de Petri com um papel filtro úmido na parte inferior, feche a placa de Petri e enrole-a com papel alumínio.

2. Teste se o dispositivo de transmissão funcionar

1. Conecte o dispositivo de transmissão a uma fonte de alimentação estável e pressione o interruptor de alimentação (botão LIGAR/DESLIGAR) do dispositivo para redefinir o instrumento (Figura 1A,B).
2. Conecte o iPad a uma fonte de alimentação estável, pressione o botão Home Screen para ativar a tela e digite a senha para fazer login.
3. Pressione o ícone Configurações , pressione o ícone Display & Brightness , pressione Auto-Lock e selecione Nunca pressionando esta opção para garantir que a tela permaneça permanentemente. Caso contrário, o programa deixará de funcionar quando a tela dormir. Pressione o botão Home Screen para retornar à tela principal.
4. Pressione duas vezes o botão Home Screen para ver quais aplicativos estão abertos e feche todos eles deslizando-os para a parte superior da tela. Pressione o botão Home Screen para retornar à tela principal.
   1. Encontre o aplicativo LeafSensor na tela principal ou deslizando para a esquerda ou para a direita. Pressione o ícone do aplicativo para abri-lo (consulte Arquivo Suplementar). Uma tela verde com texto e campos brancos aparecerá para inserir as informações.
   2. Certifique-se de que a palavra Connected é vista na parte inferior da tela, pois indica que o aplicativo está se comunicando com o dispositivo de transmissão. Se a mensagem 'Adafruit NÃO Encontrado' aparecer, verifique se o dispositivo está conectado e pressione novamente o botão de partida no dispositivo.
5. Preencha os 4 primeiros campos na página do aplicativo para nomear o experimento e configurar as condições para um breve teste executado sem folhas e com os clipes de folha abertos:
   1. Nomeie o experimento (use 8 ou menos letras ou números maiúsculas) por exemplo, digitando TEST no campo chamado Expt Name.
   2. Escolha quantas intensidades diferentes de luz azul serão usadas no experimento, por exemplo, digitando 3 no campo chamado # Intensidades de Luz.
   3. Escolha as intensidades de luz azul para esta corrida (escolha um inteiro entre 0 e 3000 e separe cada número do próximo com uma círia; consulte Arquivo Suplementar sobre como converter esses números em intensidades reais de luz azul de LEDs) por exemplo, digitando 0,100.1000 no campo chamado Intensidades Azuis.
   4. Escolha o tempo que cada intensidade de luz azul brilhará sobre a folha (separe cada número do próximo com uma círgula), por exemplo, digitando 2,2,2 no campo chamado Duração Azul (minutos).
6. Pressione o Experimento iniciar na seção intermediária da tela. Na parte inferior da tela aparecerão 8 hífens e a mensagem Iniciar experimento.
   1. Certifique-se de que nenhuma luz está sendo emitida dos LEDs durante os primeiros dois minutos, então a luz azul fraca está sendo emitida, e depois de 2 minutos a intensidade da luz azul está aumentando.
   2. Certifique-se de que a luz vermelha intensa está sendo emitida dos LEDs uma vez por minuto para as medições.
      NOTA: À medida que o experimento estiver sendo executado, os números aparecerão na página do aplicativo para cada um dos oito sensores, e os dados serão atualizados uma vez por minuto. Certifique-se de que os números de saída dos fotodiodos estão em torno de 1000-1023 (se a sala estiver escura). Uma atualização na parte inferior esquerda mostra quantas medidas foram feitas até agora, por exemplo, Done 1 de 6 medidas (uma medição a cada minuto).
   3. Quando o experimento estiver concluído, verifique se o aparecimento do Experimento terminou no lado inferior esquerdo da página do aplicativo. Agora o instrumento está pronto para uma corrida com folhas.
7. Pressione duas vezes o botão Home Screen, deslize para fora do aplicativo e abra-o novamente. Pressione o botão ON/OFF no instrumento para reiniciá-lo.

3. Configuração de folhas nos clipes de folha

NOTA: Este passo deve ser feito no escuro com uma fonte de luz verde (por exemplo, coloque um filtro verde na frente de uma lâmpada) para evitar induzir o movimento do cloroplasto. Alternativamente, use luz branca muito baixa e um período escuro prolongado nos clipes de folha. Lembre-se, uma parte do clipe da folha contém o LED (abertura maior), enquanto a outra segura o fototransistor (Figura 1C).

1. Se as plantas forem inteiras adaptadas ao escuro, escolha 8 folhas largas o suficiente para cobrir os LEDs. Caso contrário, remova as folhas da placa de Petri. Prepare 8 tiras de papel filtro sobre o comprimento de um clipe de folha e com um furo perfurado na parte superior para não cobrir o LED.
   1. Umedeça o papel do filtro e coloque-o sobre a parte do clipe da folha que segura o LED. Repita isso para cada um dos oito clipes de folha.
2. Coloque cada folha na parte superior do papel filtro molhado de seu clipe de folha. Certifique-se de que o lado da folha correto está voltado para o LED (geralmente os experimentos são feitos com a superfície da folha adárquia voltada para o LED).
   1. Evite colocar as mestiços da folha em cima dos LEDs e, para resultados mais consistentes, coloque partes semelhantes de cada folha (por exemplo, a seção mais larga da folha) sobre o LED.
   2. Coloque a outra parte do clipe da folha com o fototransistor em cima. Use um elástico para segurar as duas partes do clipe da folha, se necessário (Figura 1C,D).
3. Coloque cada clipe de folha em seu 'barco' e encha os reservatórios com água usando uma pipeta. Certifique-se de que a folha ou pelo menos o papel filtro toque na água para evitar a desidratação das folhas durante a corrida (Figura 1D).

4. Conduzindo uma corrida

NOTA: Para uma corrida exploratória padrão, comece com 4h de escuridão (0 μmol fóton ^{m-2 s-1}), seguido por 7h de luz azul baixa (2 μmol fóton ^{m-2 s-1}), seguido por 60 min cada um de 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol fóton ^{m-2 s-1} de luz azul. Isso induzirá as folhas a exibir sua transmissão escura, induzir o movimento do cloroplasto no acúmulo máximo e mostrar diferentes graus de resposta de evasão.

1. Configure o aplicativo LeafSensor no iPad usando as etapas descritas abaixo.
   1. Digite EXPLORA1 no campo chamado Expt Name.
   2. Tipo 10 no campo chamado # Intensidades leves.
   3. Tipo 0,1.60.160.550.750.950.1150.1350.1950 no campo chamado intensidade azul.
   4. Tipo 240.420,60,60,60,60,60,60,60,60 no campo chamado Duração Azul.
2. Pressione o Experimento de Início de Imprensa. Após o primeiro minuto, os valores de saída (geralmente entre 990 e 820) aparecerão na tela. Se os valores estiverem distantes, verifique se as folhas foram colocadas corretamente nos clipes de folha.
3. Quando a execução estiver concluída, certifique-se de que a mensagem Experiment Finished será exibida no canto inferior esquerdo da tela. Os dados serão salvos automaticamente.
   1. Coloque a tela na posição vertical (não horizontal). Duas novas opções aparecerão na tela, como Save e Utilities.
   2. Press Utilities e uma lista de arquivos salvos serão exibidos. Selecione o arquivo de interesse, neste caso, EXPLORA1.
   3. Abaixo a lista de arquivos, procure por Selected Expt: EXPLORA1. Pressione o E-mail, digite um endereço de e-mail e o arquivo de dados será automaticamente anexado à mensagem. Pressione enviar.
      NOTA: Se houver um longo atraso até que os arquivos cheguem, reinicie o aplicativo e envie o arquivo novamente.
4. Se uma execução foi abortada, mas os dados até esse ponto são de interesse, pressione Salvar antes de selecionar Utilitários. Depois de várias corridas, limpe o espaço de memória: Pressione utilitários, selecione um arquivo de cada vez, deslize para a esquerda ao lado do arquivo e pressione Excluir para remover o arquivo.
5. Pressione de volta para executar outro experimento ou se feito, pressione o botão Home Screen, deslize para a tela principal, pressione Configurações, pressione Display & Brightness, pressione Auto-Lock e pressione 2 Minutos.

5. Análise de dados

1. Baixe o arquivo EXPLORA1 do e-mail, adicione extensão .csv ao arquivo, clique duas vezes no arquivo. Os dados serão classificados em uma planilha com os dados dos oito sensores diferentes classificados em colunas separadas. A última coluna mostra a hora (em segundos) em que os dados foram coletados. Exclua a primeira linha sob os títulos (Sensor1-8) se ele contiver dados sem sentido.
2. Configure uma ficha técnica mestre que conterá os resultados de cada sensor em uma folha separada e que converte os valores de saída em valores de transmissão de % usando as equações obtidas a partir da calibração de cada clipe de folha e sensor (ver Arquivo Suplementar).
   1. Copie cada conjunto de dados em uma folha de dados separada (por exemplo, a coluna A contém o tempo; a coluna C contém os dados do Sensor1).
   2. Configure a coluna B para converter o tempo de segundos para minutos. Configure a coluna D para que contenha a fórmula para converter tensão em % de transmissão usando a equação da calibração.
   3. Configure uma ficha técnica semelhante para cada sensor e lembre-se que a fórmula usada para converter a saída de tensão em valores de transmissão % pode ser diferente para cada sensor.
3. Parcela % transmissão (T) contra o tempo, min (Figura 2).
4. Salve a ficha de dados sob um novo nome para que a ficha de dados mestre possa ser reutilizada.
5. Para analisar melhor os dados (Figura 2), calcular o acúmulo de ΔT (por exemplo, alteração de T no acúmulo máximo em relação a T no escuro), ΔT (perfumia) ( por exemplo, alteração de T na evasão máxima em relação a T no escuro) ou dT/dt (%/h) (por exemplo, alteração em T durante a parte mais rápida da reação de acumulação ou evasão). Para mais detalhes, consulte ⁸.

Resultados

As diferentes partes do dispositivo de transmissão são mostradas na Figura 1. O microcontrolador é a unidade de controle do dispositivo e controla as condições de luz que as folhas, presas em clipes de folha preta, estão experimentando, e armazena os dados de transmissão de luz que recebe (Figura 1A,B). Um close-up da unidade de controle do instrumento mostra o botão ON/OFF, o cartão SD para capacidade de armazenamento de dados, o escud...

Discussão

O dispositivo é extremamente fácil de usar, mas é de fundamental importância calibrar cada configuração de clipe de folha do dispositivo de transmissão independentemente, uma vez que o posicionamento dos LEDs e fototransistores pode variar ligeiramente de clipe de folha para clipe de folha. Certifique-se de que os LEDs e os fototransistores estão inseridos de forma estável e verifique novamente a calibração se os dados parecerem desligados. Evite colocar água no dispositivo. As folhas nos clipes de folhas sã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water