Utilisation de changements dans la transmission des feuilles pour étudier le mouvement des chloroplastes chez Arabidopsis thaliana

Résumé

De nombreuses espèces végétales modifient le positionnement des chloroplastes pour optimiser l’absorption de la lumière. Ce protocole décrit comment utiliser un instrument simple et fait maison pour étudier le mouvement des chloroplastes dans les feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant les changements dans la transmission de la lumière à travers une feuille comme proxy.

Résumé

Il a été démontré que le mouvement des chloroplastes dans les feuilles aide à minimiser la photoinhibition et à augmenter la croissance dans certaines conditions. On peut en apprendre beaucoup sur le mouvement des chloroplastes en étudiant le positionnement des chloroplastes dans les feuilles en utilisant, par exemple, la microscopie à fluorescence confocale, mais l’accès à ce type de microscopie est limité. Ce protocole décrit une méthode qui utilise les changements dans la transmission des feuilles comme indicateur du mouvement des chloroplastes. Si les chloroplastes sont étalés afin de maximiser l’interception de la lumière, la transmission sera faible. Si les chloroplastes se déplacent vers les parois cellulaires anticlinales pour éviter la lumière, la transmission sera plus élevée. Ce protocole décrit comment utiliser un instrument simple et fait maison pour exposer les feuilles à différentes intensités de lumière bleue et quantifier les changements dynamiques dans la transmission des feuilles. Cette approche permet aux chercheurs de décrire quantitativement le mouvement des chloroplastes chez différentes espèces et mutants, d’étudier les effets des produits chimiques et des facteurs environnementaux sur celui-ci, ou de dépister de nouveaux mutants, par exemple, pour identifier les composants manquants dans le processus qui mène de la perception de la lumière au mouvement des chloroplastes.

Introduction

La lumière est essentielle à la photosynthèse, à la croissance et au développement des plantes. C’est l’un des facteurs abiotiques les plus dynamiques, car les intensités lumineuses changent non seulement au cours d’une saison ou d’une journée, mais aussi rapidement et de manière imprévisible en fonction de la couverture nuageuse. Au niveau des feuilles, les intensités lumineuses sont également influencées par la densité et la nature de la végétation environnante et de la canopée de la plante. Un mécanisme important qui permet aux plantes d’optimiser l’interception de la lumière dans des conditions de lumière variables est la capacité des chloroplastes à se déplacer en réponse aux stimuli de lumière ^bleue1,2. Dans des conditions de faible luminosité, les chloroplastes se propagent perpendiculairement à la lumière (le long des parois cellulaires périclinales) dans une réponse dite d’accumulation, maximisant l’interception de la lumière et donc la photosynthèse. Dans des conditions de forte luminosité, les chloroplastes se déplacent vers la paroi cellulaire anticlinale dans une réponse dite d’évitement, minimisant l’interception de la lumière et le danger de photoinhibition. Chez de nombreuses espèces, les chloroplastes adoptent également une position sombre spécifique, qui est distincte des positions d’accumulation et d’évitement et souvent intermédiaire entre ces ^deux3,4. Diverses études ont démontré que le mouvement des chloroplastes est important non seulement pour la tolérance au stress à court terme des feuilles5,6,7, mais aussi pour la croissance et le succès de reproduction des plantes, en particulier dans des conditions de lumière ^variables8,9.

Le mouvement des chloroplastes est facilement observé en temps réel dans certains spécimens vivants (p. ex. algues ou plantes à feuilles minces comme Elodea) à l’aide de la microscopie ^optique1. L’étude du mouvement des chloroplastes dans la plupart des feuilles, cependant, nécessite un prétraitement pour induire le mouvement des chloroplastes, la fixation chimique et la préparation des sections transversales avant de visualiser les échantillons au microscope ^optique10. Avec l’introduction de la microscopie laser confocale, il est également devenu possible d’imager la disposition 3D des chloroplastes dans des feuilles intactes ou fixes4,11,12. Ces techniques d’imagerie aident grandement à comprendre le mouvement des chloroplastes en fournissant des informations qualitatives importantes. La quantification du positionnement des chloroplastes (par exemple, en pourcentage des chloroplastes dans les positions périclinale ou anticlinale dans ces images ou en pourcentage de la surface couverte par les chloroplastes par surface cellulaire totale) est également possible, mais prend beaucoup de temps, surtout si elle est effectuée aux intervalles nécessaires pour capturer les changements rapides de ^{positionnement10,8} . Le moyen le plus simple de montrer si les feuilles adaptées à l’obscurité d’une certaine espèce ou de mutants sont capables de mouvement des chloroplastes dans la réponse d’évitement est de couvrir la majeure partie de la surface d’une feuille pour garder les chloroplastes dans l’obscurité tout en exposant une bande de la feuille à une lumière élevée. Après un minimum de 20 minutes d’exposition à la lumière élevée, les chloroplastes dans la zone exposée se seront déplacés en position d’évitement et la bande exposée sera visiblement de couleur plus claire que le reste de la feuille. Cela est vrai pour le type sauvage A. thaliana, mais pas pour certains des mutants du mouvement des chloroplastes décrits plus en détail plus ^loin13. Cette méthode et ses modifications (p. ex., inverser les parties de la feuille exposées, modifier l’intensité lumineuse) sont utiles pour dépister un grand nombre de mutants et pour identifier les mutants nuls qui n’ont pas la capacité de présenter une réponse d’évitement ou d’accumulation ou les deux. Cependant, il ne fournit pas d’informations sur les changements dynamiques dans le mouvement des chloroplastes.

En revanche, la méthode décrite ici permet de quantifier le mouvement des chloroplastes dans les feuilles intactes en utilisant les changements dans la transmission de la lumière à travers une feuille comme indicateur du mouvement global des chloroplastes: dans des conditions où les chloroplastes sont étalés dans les cellules mésophylles dans la réponse d’accumulation, moins de lumière est transmise à travers la feuille que lorsque de nombreux chloroplastes sont dans une réponse d’évitement, se positionner le long des parois cellulaires anticlinales. Par conséquent, les changements de transmission peuvent être utilisés comme indicateur du mouvement global des chloroplastes dans les ^feuilles14. Les détails de l’instrument sont décrits ailleurs (voir Dossier supplémentaire), mais fondamentalement, l’instrument utilise la lumière bleue pour déclencher le mouvement du chloroplaste et mesure la quantité de lumière rouge transmise à travers cette feuille à intervalles définis. Plus récemment, une modification de ce système a été décrite, qui utilise un lecteur de microplaques modifié de 96 puits, une LED bleue, un ordinateur et un incubateur à température ^{contrôlée15}.

L’option d’utiliser une combinaison de méthodes, y compris l’évaluation optique des feuilles pour le dépistage, suivie de la mesure des changements dynamiques dans la transmission et l’utilisation de la microscopie, a grandement aidé notre compréhension des mécanismes sous-jacents et de l’importance physiologique / écologique du mouvement des chloroplastes. Par exemple, cela a conduit à la découverte et à la caractérisation de divers mutants, qui sont altérés dans des aspects spécifiques de leurs mouvements. Par exemple, les mutants d’A. thaliana phot 1 n’ont pas la capacité d’accumuler leurs chloroplastes en basse lumière, tandis que les mutants de phot 2 n’ont pas la capacité d’effectuer une réaction d’évitement. Ces phénotypes sont dus à une altération de deux récepteurs de lumière bleue respectifs16,17,18. En revanche, les mutants chup1 n’ont pas la capacité de former des filaments d’actine appropriés autour des chloroplastes qui sont essentiels pour déplacer les chloroplastes dans la position souhaitée dans une ^cellule11,19. En plus des études mutantes, les chercheurs ont évalué les effets de divers inhibiteurs sur le mouvement des chloroplastes afin d’élucider les aspects mécanistes du processus. Par exemple, des produits chimiques tels que _H2O2 et divers antioxydants ont été utilisés pour étudier les effets de cette molécule de signalisation sur le mouvement des chloroplastes20. Divers inhibiteurs ont été utilisés pour élucider le rôle du calcium dans le mouvement des ^{chloroplastes21}. En plus d’aider à découvrir les mécanismes du mouvement des chloroplastes, ces méthodes peuvent être utilisées pour comparer le mouvement des chloroplastes chez diverses espèces ou mutants cultivés dans différentes conditions afin de tenter de comprendre le contexte écologique et évolutif de ce comportement. Par exemple, il a été démontré que l’étendue des effets de diverses mutations dans la voie de mouvement des chloroplastes dépend des conditions de ^{croissance7,9}, et que les plantes adaptées au soleil ne semblent pas beaucoup déplacer leurs chloroplastes. En revanche, le mouvement est très important pour les plantes d’ombrage10,22,23.

Ce document sur les méthodes, axé sur la plante modèle A. thaliana, décrit comment utiliser un dispositif de transmission qui est une version mise à jour d’un instrument précédemment ^développé9. Bien que cet instrument ne soit pas disponible dans le commerce, les personnes ayant une compréhension de base de l’électronique ou l’aide de collègues et d’étudiants en ingénierie ou en physique seront en mesure de construire l’instrument en utilisant des pièces abordables et en suivant les instructions détaillées (voir Fichier supplémentaire). La plate-forme open source utilisée pour construire l’instrument dispose d’un support Web étendu et d’un forum communautaire qui offre de l’aide en cas de ^problème24.

Le protocole se concentre sur la façon d’utiliser l’instrument pour déterminer les changements dans la transmission des feuilles dans une série exploratoire standard qui expose une feuille à un large éventail de conditions de lumière et capture les réactions d’obscurité, d’accumulation et d’évitement d’A. thaliana. Ces pistes peuvent être modifiées en fonction de l’objectif de l’expérience et peuvent être utilisées avec la plupart des espèces végétales. L’article fournit des exemples de données de transmission de A. thaliana wildtype et de plusieurs mutants et montre comment analyser plus en détail les données.

Protocole

1. Préparer les feuilles pour une course

1. Placez 8 plantes d’A. thaliana dans l’obscurité pendant la nuit (> 6 h fonctionne pour la plupart des espèces) pour s’assurer que les chloroplastes se déplacent dans leur position sombre. Tous les réplicas commencent par des valeurs de transmission comparables.
2. Alternativement, placez 8 feuilles complètes dans une boîte de Petri avec un papier filtre humide au fond, fermez la boîte de Petri et enveloppez-la avec du papier d’aluminium.

2. Vérifier si le dispositif de transmission fonctionne

1. Connectez le périphérique de transmission à une source d’alimentation stable et appuyez sur l’interrupteur d’alimentation (bouton ON/OFF) de l’appareil pour réinitialiser l’instrument (Figure 1A,B).
2. Connectez l’iPad à une source d’alimentation stable, appuyez sur le bouton Écran d’accueil pour activer l’écran et entrez le code d’accès pour vous connecter.
3. Appuyez sur l’icône Paramètres , appuyez sur l’icône Affichage et luminosité , appuyez sur Verrouillage automatique, puis sélectionnez Jamais en appuyant sur cette option pour vous assurer que l’écran reste allumé en permanence. Sinon, le programme cessera de fonctionner lorsque l’écran se mettra en veille. Appuyez sur le bouton Écran d’accueil pour revenir à l’écran principal.
4. Appuyez deux fois sur le bouton Écran d’accueil pour voir quelles applications sont ouvertes et fermez-les toutes en les faisant glisser vers le haut de l’écran. Appuyez sur le bouton Écran d’accueil pour revenir à l’écran principal.
   1. Trouvez l’application LeafSensor sur l’écran principal ou en balayant vers la gauche ou la droite. Appuyez sur l’icône de l’application pour l’ouvrir (voir Fichier supplémentaire). Un écran vert avec du texte et des champs blancs apparaîtra pour entrer les informations.
   2. Assurez-vous que le mot Connecté est visible dans la partie inférieure de l’écran car il indique que l’application communique avec le périphérique de transmission. Si le message 'Adafruit NOT Found' apparaît, vérifiez que l’appareil est branché et appuyez à nouveau sur le bouton de démarrage de l’appareil.
5. Remplissez les 4 premiers champs de la page de l’application pour nommer l’expérience et configurer les conditions d’un bref test sans feuilles et avec les clips de feuille ouverts :
   1. Nommez l’expérience (utilisez 8 lettres majuscules ou chiffres ou moins), par exemple en tapant TEST dans le champ nommé Expt Name.
   2. Choisissez combien d’intensités de lumière bleue différentes seront utilisées dans l’expérience, par exemple, en tapant 3 dans le champ nommé # Intensités de lumière.
   3. Choisissez les intensités de lumière bleue pour cette exécution (choisissez un entier compris entre 0 et 3000 et séparez chaque nombre du suivant par une virgule; voir Fichier supplémentaire sur la façon de convertir ces nombres en intensités réelles de lumière bleue des LED), par exemple, en tapant 0,100,1000 dans le champ nommé Intensités bleues.
   4. Choisissez la durée pendant laquelle chaque intensité de lumière bleue brillera sur la feuille (séparez chaque numéro du suivant par une virgule), par exemple en tapant 2,2,2 dans le champ nommé Durée bleue (minutes).
6. Appuyez sur Démarrer l’expérience dans la section centrale de l’écran. Dans la partie inférieure de l’écran, 8 traits d’union et le message Démarrage de l’expérience apparaîtront.
   1. Assurez-vous qu’aucune lumière n’est émise par les LED pendant les deux premières minutes, puis qu’une faible lumière bleue est émise et, après 2 minutes, l’intensité de la lumière bleue augmente.
   2. Assurez-vous que la lumière rouge intense est émise par les LED une fois par minute pour les mesures.
      REMARQUE: Pendant que l’expérience est en cours, des chiffres apparaîtront sur la page de l’application pour chacun des huit capteurs et les données seront mises à jour une fois par minute. Assurez-vous que les numéros de sortie des photodiodes sont autour de 1000-1023 (si la pièce est sombre). Une mise à jour en bas à gauche montre combien de mesures ont été effectuées jusqu’à présent, par exemple, effectué 1 des 6 mesures (une mesure par minute).
   3. Une fois l’expérience terminée, vérifiez l’apparence de l’expérience terminée en bas à gauche de la page de l’application. Maintenant, l’instrument est prêt pour une course avec des feuilles.
7. Appuyez deux fois sur le bouton Écran d’accueil, balayez hors de l’application et ouvrez-la à nouveau. Appuyez sur le bouton ON/OFF de l’instrument pour le réinitialiser.

3. Mise en place des feuilles dans les clips de feuilles

REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans l’obscurité avec une source de lumière verte (par exemple, placez un filtre vert devant une ampoule) pour éviter d’induire un mouvement de chloroplaste. Alternativement, utilisez une lumière blanche très faible et une période d’obscurité prolongée dans les clips de feuilles. N’oubliez pas qu’une partie du clip à feuilles contient la LED (ouverture plus grande), tandis que l’autre contient le phototransistor (Figure 1C).

1. Si les plantes sont entières adaptées à l’obscurité, choisissez 8 feuilles assez larges pour couvrir les LED. Sinon, retirez les feuilles de la boîte de Pétri. Préparez 8 bandes de papier filtre sur la longueur d’un clip à feuilles et avec un trou perforé en haut pour ne pas couvrir la LED.
   1. Humidifiez le papier filtre et placez-le sur la partie du clip à feuilles qui maintient la LED. Répétez cette opération pour chacun des huit clips de feuilles.
2. Placez chaque feuille sur le dessus du papier filtre humide de son clip à feuilles. Assurez-vous que le bon côté de la feuille est orienté vers la LED (généralement des expériences sont faites avec la surface de la feuille adaxiale face à la LED).
   1. Évitez de placer les nervures médianes de la feuille sur les LED et, pour des résultats plus cohérents, placez des parties similaires de chaque feuille (par exemple, la section la plus large de la feuille) sur la LED.
   2. Placez l’autre partie du clip de feuille avec le phototransistor sur le dessus. Utilisez un élastique pour maintenir les deux parties du clip de feuille ensemble si nécessaire (Figure 1C,D).
3. Placez chaque clip de feuille dans son « bateau » et remplissez les réservoirs d’eau à l’aide d’une pipette. Assurez-vous que la feuille ou au moins le papier filtre touche l’eau pour éviter la déshydratation des feuilles pendant la course (Figure 1D).

4. Effectuer une course

REMARQUE: Pour une course exploratoire standard, commencez par 4 h d’obscurité (photon ^{m-2 s-1} de 0 μmol), suivi de 7 h de faible lumière bleue (photon ^{m-2 s-1} de 2 μmol), suivi de 60 min chacun de 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 photons μmol ^{m-2 s-1} de lumière bleue. Cela incitera les feuilles à présenter leur transmission sombre, induira le mouvement des chloroplastes dans l’accumulation maximale et montrera différents degrés de réponse d’évitement.

1. Configurez l’application LeafSensor sur l’iPad en suivant les étapes décrites ci-dessous.
   1. Tapez EXPLORA1 dans le champ nommé Nom Expt.
   2. Tapez 10 dans le champ nommé # Intensités lumineuses.
   3. Tapez 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 dans le champ nommé Intensités bleues.
   4. Tapez 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60 dans le champ nommé Blue Duration.
2. Appuyez sur Démarrer l’expérience. Après la première minute, les valeurs de sortie (généralement entre 990 et 820) apparaîtront à l’écran. Si les valeurs sont éloignées, vérifiez si les feuilles ont été placées correctement dans les clips de feuilles.
3. Une fois l’exécution terminée, assurez-vous que le message Expérience terminée apparaît en bas à gauche de l’écran. Les données seront enregistrées automatiquement.
   1. Placez l’écran en position verticale (et non horizontale). Deux nouvelles options apparaîtront à l’écran, à savoir Enregistrer et Utilitaires.
   2. Appuyez sur Utilitaires et une liste des fichiers enregistrés apparaîtra. Sélectionnez le fichier d’intérêt, dans ce cas, EXPLORA1.
   3. Sous la liste des fichiers , recherchez Selected Expt: EXPLORA1. Appuyez sur E-mail, entrez une adresse e-mail et le fichier de données sera automatiquement joint au message. Appuyez sur Envoyer.
      REMARQUE: S’il y a un long délai jusqu’à ce que les fichiers arrivent, redémarrez l’application et envoyez le fichier à nouveau.
4. Si une exécution a été interrompue, mais que les données jusqu’à ce point présentent un intérêt, appuyez sur Enregistrer avant de sélectionner Utilitaires. Après plusieurs exécutions, nettoyez l’espace mémoire : appuyez sur Utilitaires, sélectionnez un fichier à la fois, balayez vers la gauche à côté de fichier, puis appuyez sur Suppr pour supprimer le fichier.
5. Appuyez sur Précédent pour exécuter une autre expérience ou, si vous avez terminé, appuyez sur le bouton Écran d’accueil, balayez jusqu’à l’écran principal, appuyez sur Paramètres, appuyez sur Affichage et luminosité, appuyez sur Verrouillage automatique et appuyez sur 2 Minutes.

5. Analyse des données

1. Téléchargez le fichier EXPLORA1 à partir de l’e-mail, ajoutez l’extension .csv au fichier, double-cliquez sur le fichier. Les données seront triées dans une feuille de calcul avec les données des huit capteurs différents triées dans des colonnes séparées. La dernière colonne indique l’heure (en secondes) à laquelle les données ont été collectées. Supprimez la première ligne sous les en-têtes (Sensor1-8) si elle contient des données absurdes.
2. Configurez une fiche technique de base qui contiendra les résultats pour chaque capteur dans une feuille distincte et qui convertit les valeurs de sortie en % des valeurs de transmission à l’aide des équations obtenues à partir de l’étalonnage de chaque clip de feuille et capteur (voir Fichier supplémentaire).
   1. Copiez chaque ensemble de données dans une feuille de données distincte (par exemple, la colonne A contient l’heure ; la colonne C contient les données de Sensor1).
   2. Configurez la colonne B de sorte qu’elle convertisse le temps de quelques secondes en minutes. Configurez la colonne D de manière à ce qu’elle contienne la formule permettant de convertir la tension en % de transmission à l’aide de l’équation de l’étalonnage.
   3. Configurez une fiche technique similaire pour chaque capteur et rappelez-vous que la formule utilisée pour convertir la tension de sortie en % des valeurs de transmission peut être différente pour chaque capteur.
3. Tracer % de transmission (T) par rapport au temps, min (Figure 2).
4. Enregistrez la feuille de données sous un nouveau nom afin que la feuille de données de base puisse être réutilisée.
5. Pour analyser plus en détail les données (figure 2), calculer l’accumulation de ΔT (%) (p. ex., changement de T à l’accumulation maximale par rapport à T à l’obscurité), l’évitement de ΔT ( p. ex., changement de T à l’évitement maximal par rapport à T à l’obscurité) ou dT/dt (%/h) (p. ex., changement de T pendant la partie la plus rapide de l’accumulation ou de la réaction d’évitement). Pour plus de détails, voir ⁸.

Résultats

Les différentes parties du dispositif de transmission sont illustrées à la figure 1. Le microcontrôleur est l’unité de commande de l’appareil et contrôle les conditions d’éclairage que les feuilles, fixées dans des clips à feuilles noires, connaissent, et stocke les données de transmission de la lumière qu’elles reçoivent (Figure 1A, B). Un gros plan de l’unité de commande de l’instrument montre le bouton ON/OFF, la cart...

Discussion

L’appareil est extrêmement facile à utiliser, mais il est d’une importance cruciale de calibrer chaque configuration de clip de feuille du dispositif de transmission indépendamment, car le positionnement des LED et des phototransistors peut varier légèrement d’un clip à feuille à l’autre. Assurez-vous que les LED et les phototransistors sont insérés de manière stable et vérifiez à nouveau l’étalonnage si les données semblent désactivées. Évitez d’avoir de l’eau sur l’appareil. Les feuille...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water