葉透過の変化を用いて、シロイヌナズナの葉緑体運動を調べる

要約

多くの植物種は、光吸収を最適化するために葉芽細胞の位置を変更します。このプロトコルは、シ ロイヌナズナ の葉緑体の動きを、葉を介した光の伝達の変化をプロキシとして使用して、簡単で自家製の楽器を使用して調べる方法を説明します。

要約

葉の葉の葉芽球運動は、光抑制を最小限に抑え、特定の条件下で成長を増加させるのに役立つものが示されている。葉の位置を研究することによって葉芽球の動きについて多くを学ぶことができますが、例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査は、このタイプの顕微鏡へのアクセスが制限されています。このプロトコルは葉の伝達の変化を葉緑体運動のプロキシとして使用する方法を記述する。光のインターセプトを最大化するために葉芽が広がると、伝達は低くなります。光を避けるために葉膜が反柱状細胞壁に向かって移動すると、透過が高くなります。このプロトコルは、簡単な、家庭製の楽器を使用して、葉を異なる青色光強度に公開し、リーフ伝送の動的変化を定量化する方法を説明します。このアプローチにより、研究者は、異なる種および突然変異体における葉芽細胞の動きを定量的に記述し、化学物質や環境要因がそれに及ぼす影響を研究したり、新しい変異体のスクリーニングを行ったりして、光知覚から葉芽細胞の動きにつながる過程で欠けている成分を特定することができます。

概要

光合成、植物の成長、開発には光が不可欠です。これは、光強度が季節や日の間に変化するだけでなく、クラウドカバーに応じて迅速かつ予測不可能な方法で変化するので、最もダイナミックな不生物的要因の1つです。葉のレベルでは、光の強度はまた、周囲の植生の密度と性質と植物自身のキャノピーの影響を受けます。植物が可変光条件下で光の遮断を最適化することを可能にする重要なメカニズムの1つは、青色光刺激に応答して動く葉芽体の能力^である。低光条件下では、葉葉体はいわゆる蓄積応答で光に垂直に広がり(終円細胞壁に沿って)、光のインターセプトを最大化し、光合成を最大化する。高い光条件下では、葉膜はいわゆる回避応答で反クリナル細胞壁に向かって移動し、光の傍受と光抑制の危険性を最小限に抑えます。多くの種では、葉芽細胞はまた、蓄積および回避位置とは異なり、しばしばそれらの2^つの間の中間である特定の暗い位置を仮定する^3,4。葉芽球体の動きは葉^の短期的なストレス耐性のために重要^{であるだけでなく、植物}の成長と生殖の成功、特に可変光条件下での増殖と生殖の成功のために、様々な研究が示されている^8,9。

光顕微鏡1を用いた特定の生きた標本(例えば、藻類や葉の薄葉植物など)では、葉緑体の動きがリアルタイムで容易に観察^される。しかし、ほとんどの葉の葉の動きを研究するには、光顕微鏡¹⁰でサンプルを見る前に葉芽球運動、化学固定、および断面の調製を誘導するための前処理が必要です。共焦点レーザー顕微鏡の導入により、葉巻の3D配置を無傷または^{固定葉4,11,12}に画像化することも可能になりました。これらのイメージング技術は、重要な定性的情報を提供することで、葉芽細胞の運動の理解を大いに助ける。クロロプラスト位置の定量化(例えば、これらの画像のペリクリンまたはアンチクリナル位置の葉芽細胞の割合、または全細胞表面あたりの葉ロプラストで覆われた領域の割合)も可能であるが、特に位置の急激な変化を捉えるために必要な間隔で行われる場合は非常に時間がかかる^10,8.特定の種または突然変異体の暗く適合した葉が回避応答に葉緑体の動きが可能かどうかを示す最も簡単な方法は、葉のストリップを高光にさらしながら、葉の領域のほとんどを覆って葉の領域を暗闇の中に保つことです。最低20分の高光露光の後、露出した領域の葉緑体は回避位置に移動し、露出したストリップは葉の残りの部分よりも目に見えて色が明るくなります。これは野生のA型thalianaには当てはまりますが、後で詳細に説明する葉芽球運動変異体の一部には当てはま^{りません。}この方法およびその修飾(例えば、葉のどの部分が露出しているか逆転、光強度を変化させる)は、多数の突然変異体をスクリーニングし、回避または蓄積応答または両方を示す能力を欠くヌル突然変異体を同定するのに有用である。しかし、葉芽球運動の動的変化に関する情報は提供しない。

対照的に、ここで説明する方法は、葉を通る光透過の変化を全体的な葉緑体運動の代理として使用して無傷の葉の葉の葉緑体運動を定量化することを可能にする:葉緑体が蓄積応答で中胞細胞に広がる条件下で、多くの葉緑体が回避応答している場合よりも葉を通してより少ない光が送出される。 反皮細胞壁に沿って自分自身を配置します。したがって、送信の変化は、葉¹⁴における全体的な葉葉芽細胞運動のプロキシとして使用することができる。器械の詳細は他の場所で説明されている( 補足ファイルを参照)、基本的には、器具は青い光を使用して葉緑体の動きをトリガし、設定された間隔でその葉を通してどれだけの赤い光が透過するかを測定する。さらに最近では、このシステムの改変が記載されており、これは、改変された96ウェルマイクロプレートリーダー、青色LED、コンピュータ、および温度制御インキュベー^ター15を使用する。

スクリーニングのための葉の光学的評価を含む方法の組み合わせを使用するオプションは、伝達の動的変化と顕微鏡の使用を測定することによって、基底のメカニズムと葉葉芽細胞運動の生理学的/生態学的意義の両方の理解を大いに助けました。例えば、それは、その動きの特定の側面で損なわれている様々な突然変異体の発見と特徴付けにつながった。例えば、A.タリアナphot1変異体は低光で葉葉芽を蓄積する能力を欠いているが、phot2変異体は回避反応を行う能力を欠いている。これらの型は、2つの青色光受容体^16,17,18における障害によるものである。対照的に、chup1変異体は、葉巻を^cell11,19内の所望の位置に移動させるために不可欠な葉巻の周りに適切なアクチンフィラメントを形成する能力を欠^いている。変異体研究に加えて、研究者は、プロセスの機械学的側面を解明するために葉芽球運動に対する様々な阻害剤の影響を評価しました。例えば、_H2O2および種々の抗酸化物質などの化学物質を用いて、このシグナル伝達分子が葉ロプラスト運動²⁰に及ぼす影響を調べた。葉芽細胞運動²¹におけるカルシウムの役割を解明するために種々の阻害剤が用いられた。これらの方法は、葉芽球運動のメカニズムを明らかにするのに役立つだけでなく、この行動の生態学的および進化的文脈を理解するために、異なる条件で成長した様々な種または突然変異体における葉ロプラストの動きを比較するために使用することができる。例えば、葉葉芽球の移動経路における様々な突然変異の影響の程度は、成長条件^に依存していること^7,9、そして太陽に適応した植物が葉ロプラストをあまり動かさないように見えることがわかっています。対照的に、動きは、木陰植物^10、22、23のために非常に重要です。

この方法論文は、モデルプラント A.thalianaに焦点を当て、以前に開発された機器⁹の更新版である伝送装置の使用方法を説明しています。この機器は市販されていませんが、エレクトロニクスの基本的な理解や工学や物理学の同僚や学生の助けを借りて、手頃な価格の部品を使用して、詳細な指示に従って楽器を構築することができます( 補足ファイルを参照)。機器を構築するために使用されるオープンソースプラットフォームは、広範なWebサポートと問題が発生した場合のヘルプを提供するコミュニティフォーラムを持っています²⁴。

このプロトコルは、幅広い光の条件にリーフを露出させ、A.タリアナの暗い、蓄積、および回避反応を捕捉する標準的な探索的実行における葉の伝達の変化を決定するために装置を使用する方法 に焦点を当てています。これらのランは、実験の目的に応じて変更することができ、ほとんどの植物種で使用することができます。本論文は 、A.タリアナ 野生型およびいくつかの変異体の伝送データの例を提供し、さらにデータを分析する方法を示す。

プロトコル

1. 走行用の葉の準備

1. 8 A.タリアナ 植物を暗闇の中に一晩置き(>6 hはほとんどの種で働く)、葉芽が暗い位置に移動することを保証します。すべてのレプリカは、同等の転送値で始まります。
2. あるいは、8つの完全な葉を底に湿ったろ過紙を入れたペトリ皿に入れ、ペトリ皿を閉じて、アルミホイルで包みます。

2. 伝送装置が動作するかどうかのテスト

1. 伝送装置を安定した電源に接続し、デバイスの電源スイッチ(オン/オフボタン)を押して機器をリセットします(図1A、B)。
2. iPadを安定した電源に接続し、ホーム画面ボタンを押して画面を有効にし、パスコードを入力してログインします。
3. [設定] アイコンを押し、画面と明るさアイコンを押し、自動ロックを押して、このオプションを押して [しない] を選択して、画面が永続的に表示されるようにします。そうしないと、画面がスリープ状態になるとプログラムの実行が停止します。ホーム画面ボタンを押して、メイン画面に戻ります。
4. ホーム画面ボタンをダブル押して、開いているアプリケーションを確認し、画面の上部に向かってスワイプしてすべてのアプリケーションを閉じます。 ホーム画面 ボタンを押して、メイン画面に戻ります。
   1. メイン画面で、または左右にスワイプして 、LeafSensor アプリを見つけます。アプリのアイコンを押して開きます( 補足ファイルを参照)。テキストと白のフィールドを含む緑色の画面が表示され、情報が入力されます。
   2. アプリが送信デバイスと通信していることを示すとおり、画面の下部に 「Connected 」という単語が表示されていることを確認します。「Adafruit NOT Found」というメッセージが表示された場合は、デバイスが接続されていることを確認し、デバイスの開始ボタンをもう一度押します。
5. アプリページの最初の4つのフィールドに記入して、実験に名前を付け、葉のない短いテスト実行の条件を設定し、リーフクリップを開きます。
   1. たとえば、Expt Name というフィールドに TEST と入力して、実験に名前を付けます (8 文字以下の大文字または数字を使用)。
   2. #光強度という名前のフィールドに 3 を入力して、実験で使用される青色 光の強度の数を選択します。
   3. この実行の青色光強度を選択します(0から3000の整数を選択し、カンマで次の数字から各数値を区切ります。これらの数値をLEDの実際の青色光強度に変換する方法については補足ファイルを参照してください)。
   4. 青い光の強度が葉に輝く時間の長さを選択します(各数値をカンマで区切ります)、例えば、Blue Duration(分)という名前のフィールドに2,2,2と入力します。
6. 画面中央のセクションで [実験の開始 ]を押します。画面の下部に8ハイフンとメッセージ「 実験 開始」が表示されます。
   1. 最初の2分間、LEDから光が出ないようにし、弱い青色光が発色し、2分後に青色光強度が増加していることを確認します。
   2. 測定のために、LEDから1分間に1回強い赤色光が出ることを確認します。
      注: 実験が実行されると、8 つのセンサーのそれぞれに対してアプリ ページに数字が表示され、1 分に 1 回データが更新されます。フォトダイオードからの出力番号が1000-1023程度であることを確認します(部屋が暗い場合)。左下の更新は、これまでに行われた測定の数を示しています。
   3. 実験が完了したら、アプリ ページの左下で 実験が終了 した外観を確認します。これで、楽器は葉で実行する準備が整いました。
7. ホーム画面ボタンを2回押し、アプリの外にスワイプしてもう一度開きます。機器のオン/オフボタンを押してリセットします。

3. リーフクリップの葉の設定

注:このステップは、緑の光源(例えば、電球の前に緑色のフィルターを置く)で暗闇の中で行われ、葉緑体の動きを誘発しないようにする必要があります。または、非常に低い白色光と葉クリップの暗い期間を延長して使用します。リーフクリップの一部はLED(大きな開口部)を保持し、もう一方はフォトトランジスタを保持します(図1C)。

1. 植物が全体に暗く適応している場合は、LEDをカバーするのに十分な幅の8つの葉を選びます。それ以外の場合は、ペトリ皿から葉を取り除きます。葉クリップの長さについて8枚のフィルターペーパーを用意し、LEDを覆わないには上部に穴を開けて準備します。
   1. フィルターペーパーを湿らせ、LED を保持しているリーフ クリップ部分に置きます。8 つのリーフ クリップのそれぞれについて、この手順を繰り返します。
2. 各葉をリーフクリップの湿ったフィルター用紙の上に置きます。正しいリーフ側が LED に向かっていることを確認します(通常、実験は、LED に面したアダクシャルリーフサーフェスで行われます)。
   1. LEDの上に葉のミドリブを置くことを避け、より一貫した結果を得るには、各葉の類似部分(例えば、葉の最も広い部分)をLEDの上に置きます。
   2. フォトトランジスタを上に置いて、もう一方のリーフクリップパーツを置きます。必要に応じて、2 つのリーフ クリップ パーツを一緒に保持するために、ラバー バンドを使用します(図 1C、D)。
3. 各葉クリップを「ボート」に入れ、ピペットを使って貯水池に水を入れます。葉の中に葉の脱水を避けるために、葉または少なくとも濾紙が水に触れていることを確認してください(図1D)。

4. 実行を実行する

注:標準的な探索的な実行のために、暗闇の4 h(0 μmol光子^{m-2 s-1})から始め、低い青色光の7時間(2 μmol photon ^{m-2 s-1})、続いて5、10、30、40、50、60、90、100 μmol photon ^m-1-1の青い光のそれぞれ60分続きます。これは、葉が暗い透過を示し、葉葉の動きを最大蓄積に誘導し、異なる程度の回避応答を示すことを誘導する。

1. iPad で、次の手順に従って LeafSensor アプリをセットアップします。
   1. Expt 名という名前のフィールドに、EXPLORA1 と入力します。
   2. #光強度という名前のフィールドに 10 を入力します。
   3. 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 を「青強度」というフィールドに入力します。
   4. 「ブルーデュレーション」フィールドに「240,420,60,60,60,60,60,60」と入力します。
2. [実験の開始] を押します。最初の分の後、出力値(通常は 990 ~ 820)が画面に表示されます。値が遠く離れている場合は、リーフクリップに正しく配置されているかどうかを確認します。
3. 実行が完了したら、画面の左下に「 実験完了 」というメッセージが表示されていることを確認します。データは自動的に保存されます。
   1. 画面を(水平ではなく)直立した位置に配置します。画面には、 保存 とユーティリティという 2 つの新しいオプション が表示されます。
   2. ユーティリティを押すと、保存されたファイルのリストが表示されます。対象となるファイル (この場合は、EXPLORA1) を選択します。
   3. ファイルの一覧の下にある [選択された Expt: EXPLORA1] を探します。 [電子メール]を押して メールアドレスを入力すると、データファイルが自動的にメッセージに添付されます。 [送信] を押します。
      注:ファイルが到着するまでの時間が長い場合は、アプリを再起動し、ファイルをもう一度送信します。
4. 実行が中止されたが、その時点までのデータが対象となる場合は、[ユーティリティ]を選択する前に[保存]を押します。数回実行した後、メモリ領域をクリーンアップする:ユーティリティを押して、一度に1つのファイルを選択し、ファイルの隣で左にスワイプし、Deleteキーを押してファイルを削除します。
5. 別の実験を実行するには 、または 完了した場合は、ホーム画面ボタンを押して、メイン画面にスワイプし、 設定を押し、 画面と明るさを押し、 オートロックを押し、 2分を押します。

5. データ分析

1. 電子メールからファイル EXPLORA1 をダウンロードし、ファイルに拡張子.csvを追加し、ファイルをダブルクリックします。データは、8つの異なるセンサーのデータを別々の列にソートしたスプレッドシートにソートされます。最後の列には、データが収集された時刻 (秒) が表示されます。見出しの下の最初の行 (Sensor1-8) に無意味なデータが含まれている場合は削除します。
2. 各センサーの結果を別々のシートに含め、各リーフクリップとセンサーのキャリブレーションから得られた式を使用して出力値を % 伝送値に変換するマスターデータシートを設定 します (補足ファイルを参照)。
   1. 各データ セットを別々のデータ シートにコピーします (たとえば、列 A には時刻が含まれ、列 C には Sensor1 のデータが含まれます)。
   2. 列 B を設定して、時間を秒から分に変換します。列 D を設定して、キャリブレーションの式を使用して電圧を % 伝送に変換する式を含めます。
   3. 各センサに同様のデータシートを設定し、電圧出力を%伝送値に変換するために使用される式は、センサごとに異なる場合があります。
3. 時間に対するプロット%伝送(T)、分(図2)。
4. マスター データ シートを再利用できるように、新しい名前でデータ シートを保存します。
5. さらにデータを分析するには(図2)、 ΔT( 例えば、暗い時のTと比較して最大蓄積時のTの変化)、 ΔT( 例えば、暗い時のTと比較して最大回避時のTの変化)、または dT/dt(%/h) (例えば、蓄積または反応の最も速い部分の間にTの変化)を計算する。詳細については ^、8 を参照してください。

結果

伝送装置の異なる部分を 図1に示します。マイクロコントローラはデバイスの制御ユニットであり、黒い葉クリップで固定された葉が発生している光の状態を制御し、受け取った光伝送データを格納します(図1A、B)。計測器の制御ユニットのクローズアップには、オン/オフボタン、データストレージ機能用のSDカード、Bluetoothシールド(...

ディスカッション

デバイスは非常に使いやすいですが、LEDとフォトトランジスタの位置がリーフクリップからリーフクリップにわずかに異なる場合があるため、伝送デバイスの各リーフクリップの設定を独立して較正することが重要です。LEDとフォトトランジスタが安定して挿入されていることを確認し、データがオフに見える場合はキャリブレーションを再確認します。デバイスに水を入れないようにして?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water