שימוש בשינויים בהעברת עלים כדי לחקור את תנועת הכלורופלסט בתאליאנה של Arabidopsis

Summary

מינים רבים של צמחים משנים את המיקום של כלורופלסטים כדי לייעל את ספיגת האור. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בכלי פשוט, ביתי שנבנה כדי לחקור את התנועה כלורופלסט עלים טאליאנה Arabidopsis באמצעות שינויים בהעברת אור דרך עלה כמו פרוקסי.

Abstract

תנועת כלורופלסט בעלים הוכח כמסייעת למזער את הפוטו-חיסון ולהגדיל את הצמיחה בתנאים מסוימים. ניתן ללמוד רבות על תנועת הכלורופלסט על ידי לימוד מיקום הכלורופלסט בעלים באמצעות למשל, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית, אך הגישה לסוג זה של מיקרוסקופיה מוגבלת. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת בשינויים בהעברת עלים כ- Proxy לתנועת כלורופלסט. אם כלורופלסטים פרושים על מנת למקסם את יירוט האור, השידור יהיה נמוך. אם כלורופלסטים נעים לכיוון קירות התא האנטיקלינלי כדי למנוע אור, השידור יהיה גבוה יותר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בכלי ביתי פשוט כדי לחשוף עלים לעוצמות אור כחול שונות ולכמת את השינויים הדינמיים בהעברת עלים. גישה זו מאפשרת לחוקרים לתאר כמותית את תנועת הכלורופלסט במינים ומוטנטים שונים, לחקור את ההשפעות של כימיקלים וגורמים סביבתיים עליה, או למסך עבור מוטציות חדשניות למשל, כדי לזהות רכיבים חסרים בתהליך שמוביל מתפיסת אור לתנועה של כלורופלסטים.

Introduction

אור חיוני לפוטוסינתזה, לצמיחת צמחים ולהתפתחות. זהו אחד הגורמים האביוטיים הדינמיים ביותר שכן עוצמות האור לא רק משתנות במהלך עונה או יום, אלא גם במהירות ובדרכים בלתי צפויות בהתאם לכיסוי הענן. בגובה העלים, עוצמות האור מושפעות גם מהצפיפות והאופי של הצמחייה שמסביב והחופה של הצמח עצמו. מנגנון חשוב אחד המאפשר לצמחים לייעל את יירוט האור בתנאי אור משתנים הוא היכולת של כלורופלסטים לנוע בתגובה לגירויים של אור כחול ^1,2. בתנאי תאורה חלשה, כלורופלסטים התפשטו בניצב לאור (לאורך קירות התאים הפריקלינליים) במה שמכונה תגובת הצטברות, תוך מקסום יירוט האור ומכאן הפוטוסינתזה. בתנאי אור גבוהים, כלורופלסטים נעים לכיוון דופן התא האנטיקלינלי במה שמכונה תגובת הימנעות, מזעור יירוט אור ואת הסכנה של photoinhibition. במינים רבים, כלורופלסטים גם להניח עמדה כהה ספציפית, אשר נבדלת מעמדות הצטברות והימנעות ולעתים קרובות מתווך בין שני אלה ^3,4. מחקרים שונים הראו כי תנועת כלורופלסט חשובה לא רק לסובלנות הלחץ לטווח קצר של עלים ^5,6,7, אלא גם לצמיחה ולהצלחת הרבייה של צמחים, במיוחד בתנאי אור ^{משתנים8,9}.

תנועת כלורופלסט נצפית בקלות בזמן אמת בדגימות חיות מסוימות (למשל, אצות או צמחים בעלי עלים דקים כמו אלודה) באמצעות מיקרוסקופיה ^קלה1. עם זאת, לימוד תנועת הכלורופלסט ברוב העלים דורש טיפול מקדים כדי לגרום לתנועת כלורופלסט, קיבוע כימי והכנת חתכים לפני צפייה בדגימות תחת מיקרוסקופ ^אור10. עם כניסתו של מיקרוסקופיית לייזר קונפוקל, זה גם הפך להיות אפשרי לדמיין את הסידור 3D של כלורופלסטים בעלים שלמים או קבועים4,11,12. טכניקות הדמיה אלה מסייעות מאוד להבנת תנועת הכלורופלסט על ידי מתן מידע איכותי חשוב. כימות מיקום כלורופלסט (למשל, כאחוז של כלורופלסטים בתנוחות הפריקלינליות או האנטיקלינליות בתמונות אלה או אחוז השטח המכוסה בכלורופלסטים לכל משטח תא כולל) אפשרי גם הוא אך גוזל זמן רב למדי, במיוחד אם נערך במרווחי הזמן הדרושים כדי ללכוד שינויים מהירים ^{במיצוב10,8} . הדרך הפשוטה ביותר להראות אם עלים כהים מותאמים של מין מסוים או מוטציות מסוגלים לתנועת כלורופלסט לתגובת ההימנעות היא על ידי כיסוי רוב שטח העלה כדי לשמור על הכלורופלסטים בחושך תוך חשיפת רצועה של העלה לאור גבוה. לאחר מינימום של 20 דקות של חשיפה לאור גבוה, הכלורופלסטים באזור החשוף יעברו לתנוחת ההימנעות, והרצועה החשופה תהיה בהירה יותר באופן ניכר בצבע משאר העלה. זה נכון לגבי סוג הפרא א. טאליאנה, אבל לא עבור חלק ממוטנטי תנועת הכלורופלסט המתוארים בפירוט רב יותר בהמשך ¹³. שיטה זו ושינויים של זה (למשל, היפוך מה חלקים של העלה חשופים, שינוי עוצמות אור) שימושיים לסינון מספר גדול של מוטציות ולזיהוי מוטציות ריקות חסרות יכולת להפגין תגובת הימנעות או הצטברות או שניהם. עם זאת, הוא אינו מספק מידע על השינויים הדינמיים בתנועת הכלורופלסט.

לעומת זאת, השיטה המתוארת כאן מאפשרת כימות של תנועת כלורופלסט בעלים שלמים באמצעות שינויים בהעברת אור דרך עלה כפרוקסי לתנועת כלורופלסט הכוללת: בתנאים שבהם כלורופלסטים מפוזרים בתאי המזופילז בתגובת הצטברות, פחות אור מועבר דרך העלה מאשר כאשר כלורופלסטים רבים נמצאים בתגובת הימנעות, ממקמים את עצמם לאורך קירות התא האנטיקלינלי. לפיכך, שינויים בשידור יכול לשמש פרוקסי עבור התנועה הכללית כלורופלסט ^בעלים14. פרטי המכשיר מתוארים במקום אחר (ראה קובץ משלים), אך בעיקרון, המכשיר משתמש באור כחול כדי להפעיל את תנועת הכלורופלסט ומודד כמה אור אדום מועבר דרך עלה זה במרווחי זמן קבועים. לאחרונה, תואר שינוי של מערכת זו, המשתמשת בקורא מיקרו-פלטה שונה של 96 בארות, נורית LED כחולה, מחשב וחממה מבוקרת ^{טמפרטורה15}.

האפשרות להשתמש בשילוב של שיטות, כולל הערכה אופטית של עלים להקרנה, ואחריו מדידת שינויים דינמיים בשידור ושימוש במיקרוסקופיה, סייעה מאוד להבנתנו הן את המנגנונים הבסיסיים והן את המשמעות הפיזיולוגית /אקולוגית של תנועת הכלורופלסט. לדוגמה, זה הוביל לגילוי ואפיון של מוטנטים שונים, אשר לקויים בהיבטים ספציפיים של תנועותיהם. לדוגמה, למוטנטים של A. thaliana phot 1 אין את היכולת לצבור את הכלורופלסטים שלהם באור נמוך, בעוד שמוטנטים פוט 2 חסרים את היכולת לבצע תגובת הימנעות. פנוטיפים אלה נובעים מפגיעה בשני קולטני אור כחול בהתאמה16,17,18. לעומת זאת, מוטציות chup1 חסרות את היכולת ליצור חוטי אקטין נאותים סביב הכלורופלסטים החיוניים להעברת הכלורופלסטים לתנוחה הרצויה בתוך תא ^11,19. בנוסף למחקרים מוטנטיים, חוקרים העריכו את ההשפעות של מעכבים שונים על תנועת הכלורופלסט כדי להבהיר את ההיבטים המכניסטיים של התהליך. לדוגמה, כימיקלים כגון _H2O2 ונוגדי חמצון שונים שימשו כדי לחקור את ההשפעות של מולקולת איתות זו על תנועת כלורופלסט20. מעכבים שונים שימשו כדי להבהיר את התפקיד של סידן בתנועה כלורופלסט21. בנוסף לסיוע בחשיפת המנגנונים של תנועת הכלורופלסט, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי להשוות בין תנועת כלורופלסט במינים שונים או מוטציות הגדלות בתנאים שונים בניסיון להבין את ההקשר האקולוגי והאבולוציוני של התנהגות זו. לדוגמה, הוכח כי היקף ההשפעות של מוטציות שונות במסלול התנועה כלורופלסט תלויים בתנאי ^{הצמיחה7,9}, וכי צמחים מותאמי שמש לא נראה להזיז את הכלורופלסטים שלהם הרבה. לעומת זאת, התנועה חשובה מאוד לצמחי צל10,22,23.

נייר שיטות זה, המתמקד בצמח המודל A. thaliana, מתאר כיצד להשתמש במכשיר שידור שהוא גרסה מעודכנת של מכשיר שפותח ^בעבר9. בעוד מכשיר זה אינו זמין מסחרית, אנשים עם הבנה בסיסית של אלקטרוניקה או את העזרה של עמיתים הנדסה או פיזיקה וסטודנטים יוכלו לבנות את המכשיר באמצעות חלקים סבירים ולעקוב אחר ההוראות המפורטות (ראה קובץ משלים). פלטפורמת הקוד הפתוח המשמשת לבניית המכשיר כוללת תמיכה נרחבת באינטרנט ופורום קהילתי המציע עזרה במקרה של בעיות ^{להתעורר24}.

הפרוטוקול מתמקד באופן השימוש במכשיר כדי לקבוע שינויים בהעברת עלים בריצת גישוש סטנדרטית החושפת עלה למגוון רחב של תנאי אור ולוכדת את תגובות החושך, ההצטברות וההימנעות של א. טאליאנה. ריצות אלה ניתן לשנות בהתאם למטרה של הניסוי והוא יכול לשמש עם רוב מיני הצמחים. המאמר מספק דוגמאות לנתוני שידור של א. טאליאנה wildtype וכמה מוטציות ומראה כיצד לנתח עוד יותר את הנתונים.

Protocol

1. הכנת עלים לריצה

1. מניחים 8 A. צמחי טאליאנה בחושך בן לילה (> 6 שעות עובד עבור רוב המינים) כדי להבטיח כי כלורופלסטים לעבור למיקום הכהה שלהם. כל העותקים המשוכפלים מתחילים בערכי שידור דומים.
2. לחלופין, מניחים 8 עלים שלמים בצלחת פטרי עם נייר סינון לח בתחתית, סוגרים את צלחת הפטרי ועוטפים אותה בנייר אלומיניום.

2. בדיקה אם התקן השידור פועל

1. חברו את התקן השידור למקור מתח יציב ולחצו על מתג ההפעלה (לחצן הפעלה/כיבוי) של ההתקן כדי לאפס את המכשיר (איור 1A, B).
2. חברו את ה-iPad למקור מתח יציב, לחצו על כפתור מסך הבית כדי להפעיל את המסך והזינו את קוד הגישה כדי להיכנס.
3. הקש על סמל הגדרות , הקש על סמל תצוגה ובהירות , הקש נעילה אוטומטית ובחר לעולם לא על-ידי הקשה על אפשרות זו כדי להבטיח שהמסך יישאר פעיל לצמיתות. אחרת התוכנית תפסיק לפעול כאשר המסך עובר למצב שינה. לחץ על לחצן מסך הבית כדי לחזור למסך הראשי.
4. לחץ פעמיים על לחצן מסך הבית כדי לראות אילו יישומים פתוחים וסגור את כולם על-ידי החלקתם לכיוון החלק העליון של המסך. לחץ על לחצן מסך הבית כדי לחזור למסך הראשי.
   1. מצא את היישום LeafSensor במסך הראשי או על-ידי החלקה שמאלה או ימינה. לחץ על סמל האפליקציה כדי לפתוח אותה (ראה קובץ משלים). מסך ירוק עם טקסט ושדות לבנים יופיע כדי להזין את המידע.
   2. ודא שהמילה מחובר נראית בחלק התחתון של המסך מכיוון שהיא מציינת שהאפליקציה מקיימת תקשורת עם התקן השידור. אם מופיעה ההודעה 'Adafruit NOT Found', ודא שההתקן מחובר לחשמל ולחץ שוב על לחצן ההתחלה בהתקן.
5. מלא את ארבעת השדות הראשונים בדף האפליקציה כדי לתת שם לניסוי ולהגדיר את התנאים לריצת מבחן קצרה ללא עלים ועם קליפי העלה פתוחים:
   1. תן שם לניסוי (השתמש ב- 8 או פחות אותיות רישיות או מספרים) לדוגמה, על-ידי הקלדת TEST בשדה בשם Expt Name.
   2. בחר כמה עוצמות אור כחול שונות ישמשו בניסוי, למשל, על ידי הקלדת 3 לתוך השדה בשם # עוצמות אור.
   3. בחר את עוצמות האור הכחול עבור ריצה זו (בחר מספר שלם בין 0 ל- 3000 והפרד כל מספר מהמספר הבא באמצעות פסיק; ראה קובץ משלים על אופן ההמרה של מספרים אלה לעוצמות אור כחול בפועל של נורות LED) לדוגמה, על-ידי הקלדת 0,100,100,1000 בשדה בשם עוצמות כחולות.
   4. בחר את משך הזמן שבו כל עוצמת אור כחול תזרח על העלה (הפרד כל מספר מהשני באמצעות פסיק) לדוגמה, על-ידי הקלדת 2,2,2,2 בשדה בשם Blue Duration (דקות).
6. לחץ על התחל ניסוי בחלק האמצעי של המסך. בחלק התחתון של המסך 8 מקפים וההודעה התחלת ניסוי יופיעו.
   1. ודא כי שום אור לא נפלט מן נוריות במשך שתי הדקות הראשונות, אז אור כחול חלש נפלט, ואחרי 2 דקות עוצמת האור הכחול גדלה.
   2. ודא כי אור אדום אינטנסיבי נפלט מן נוריות ה-LED פעם בדקה עבור המדידות.
      הערה: במהלך הניסוי, מספרים יופיעו בדף האפליקציה עבור כל אחד משמונת החיישנים, והנתונים יעודכנו פעם בדקה. ודא שמספרי הפלט מהפוטודיודות הם בסביבות 1000-1023 (אם החדר חשוך). עדכון בפינה השמאלית התחתונה מראה כמה מדידות בוצעו עד כה, למשל, נעשה 1 מתוך 6 מדידות (מדידה אחת בכל דקה).
   3. לאחר סיום הניסוי, בדוק אם מראה הניסוי הסתיים בפינה הימנית התחתונה של דף האפליקציה. עכשיו המכשיר מוכן לריצה עם עלים.
7. לחץ פעמיים על לחצן מסך הבית, החלק במהירות אל מחוץ לאפליקציה ופתח אותה שוב. לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי במכשיר כדי לאפס אותו.

3. הגדרת עלים במהדקי העלים

הערה: שלב זה צריך להיעשות בחושך עם מקור אור ירוק (למשל, למקם מסנן ירוק מול נורה) כדי למנוע גרימת תנועת כלורופלסט. לחלופין, יש להשתמש באור לבן נמוך מאוד ובתקופה כהה ממושכת במהדקי העלים. זכרו, חלק אחד של קליפ העלה מכיל את נורית ה-LED (פתח גדול יותר), ואילו החלק השני מכיל את הפוטוטרנזיסטור (איור 1C).

1. אם הצמחים מותאמים בחושך שלמים, בחרו 8 עלים רחבים מספיק כדי לכסות את נורות ה-LED. אחרת, להסיר את העלים מצלחת פטרי. הכן 8 רצועות של נייר סינון על אורך של מהדק עלה עם חור ניקוב בחלק העליון כדי לא לכסות את נורית ה- LED.
   1. הרטיבו את נייר הסינון והניחו אותו על חלק קליפ העלים שמחזיק את נורית ה-LED. חזור על פעולה זו עבור כל אחד משמונת קליפי העלים.
2. מניחים כל עלה על החלק העליון של נייר הסינון הרטוב של קליפ העלה שלו. ודא שצד העלה הנכון פונה לכיוון ה- LED (בדרך כלל הניסויים נעשים עם משטח העלה האדאקסיאלי הפונה ל- LED).
   1. הימנעו מהנחת הקורות האמצעיות של העלה על גבי נוריות ה-LED, ולקבלת תוצאות עקביות יותר, הניחו חלקים דומים של כל עלה (למשל, החלק הרחב ביותר של העלה) מעל נורית ה-LED.
   2. מניחים את חלק קליפ העלה השני עם phototransistor על גבי. השתמשו בגומייה כדי להחזיק את שני חלקי קליפ העלים יחד במידת הצורך (איור 1C, D).
3. מניחים כל קליפ עלה לתוך 'הסירה' שלו וממלאים את המאגרים במים באמצעות פיפטה. ודא שהעלה או לפחות נייר הסינון נוגע במים כדי למנוע התייבשות של העלים במהלך הריצה (איור 1D).

4. ניהול ריצה

הערה: עבור ריצה אקספלורציה סטנדרטית, להתחיל עם 4 שעות של חושך (0 μmol פוטון ^{m-2 s-1}), ואחריו 7 שעות של אור כחול נמוך (2 μmol פוטון ^{m-2 s-1}), ואחריו 60 דקות כל אחד של 5, 10, 30, 40, 50, 60, 90, 100 μmol פוטון ^{m-2 s-1} של אור כחול. זה יגרום לעלים להפגין את השידור הכהה שלהם, לגרום לתנועת כלורופלסט לתוך הצטברות מקסימלית, ולהראות דרגות שונות של תגובת הימנעות.

1. הגדירו את האפליקציה LeafSensor ב-iPad באמצעות השלבים המתוארים להלן.
   1. הקלד EXPLORA1 בשדה בשם שם Expt.
   2. הקלד 10 בשדה בשם # עוצמות אור.
   3. הקלד 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950 לתוך השדה בשם עוצמות כחולות.
   4. הקלד 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60,60 לתחום בשם Blue Duration.
2. לחץ על התחל ניסוי. לאחר הדקה הראשונה, ערכי הפלט (בדרך כלל בין 990 ל- 820) יופיעו על המסך. אם הערכים רחוקים, בדוק אם העלים הונחו כראוי בתוך קליפי העלים.
3. לאחר סיום ההפעלה, ודא שההודעה 'ניסוי הסתיים' מופיעה בפינה הימנית התחתונה של המסך. הנתונים יישמרו באופן אוטומטי.
   1. שים את המסך במצב זקוף (לא אופקי). שתי אפשרויות חדשות יופיעו על המסך, כלומר שמירה ושירותים.
   2. לחץ על כלי שירות ורשימה של קבצים שמורים תופיע. בחר את קובץ העניין, במקרה זה, EXPLORA1.
   3. מתחת לרשימת הקבצים , חפשו את 'אקסל נבחר: EXPLORA1'. הקש דואר אלקטרוני, הזן כתובת דואר אלקטרוני וקובץ הנתונים יצורף באופן אוטומטי להודעה. לחץ על שלח.
      הערה: אם יש עיכוב ארוך עד להגעת הקבצים, הפעל מחדש את האפליקציה ושלח את הקובץ שוב.
4. אם הפעלה בוטלה, אך נתונים עד לנקודה זו מעניינים, הקש שמור לפני בחירת כלי שירות. לאחר מספר ריצות, נקה את שטח הזיכרון: הקש /י על ״כלי שירות״, בחר/י קובץ אחד בכל פעם, החלק/י שמאלה לצד הקובץ והקש/ י על ״מחק״ כדי להסיר קובץ.
5. לחץ על הקודם כדי להפעיל ניסוי נוסף או אם בוצע, לחץ על לחצן מסך הבית, החלק במהירות למסך הראשי, הקש על הגדרות, לחץ על תצוגה ובהירות, לחץ על נעילה אוטומטית והקש 2 דקות.

5. ניתוח נתונים

1. הורד את הקובץ EXPLORA1 מהדוא"ל, הוסף סיומת .csv לקובץ, לחץ פעמיים על הקובץ. הנתונים ימוינו לגיליון אלקטרוני עם הנתונים עבור שמונת החיישנים השונים הממוינים לעמודות נפרדות. העמודה האחרונה מציגה את השעה (בשניות) שבה נאספו הנתונים. מחק את השורה הראשונה מתחת לכותרות (Sensor1-8) אם היא מכילה נתונים שטותיים.
2. הגדר גליון נתונים ראשי שיכיל את התוצאות עבור כל חיישן בגיליון נפרד ואשר ימיר את ערכי הפלט לערכי שידור של % באמצעות המשוואות המתקבלות מהכיול של כל קליפ עלה וחיישן (ראה קובץ משלים).
   1. העתק כל ערכת נתונים לגליון נתונים נפרד (לדוגמה, עמודה A מכילה את השעה; עמודה C מכילה את הנתונים של Sensor1).
   2. הגדר עמודה B כך שתמיר את הזמן משניות לדקות. הגדר עמודה D כך שתכיל את הנוסחה להמרת מתח ל- % שידור באמצעות המשוואה מהכיול.
   3. הגדר גליון נתונים דומה עבור כל חיישן וזכור שהנוסחה המשמשת להמרת יציאת המתח לערכי שידור % עשויה להיות שונה עבור כל חיישן.
3. חלקה % שידור (T) נגד הזמן, דקה (איור 2).
4. שמור את גליון הנתונים תחת שם חדש כדי שניתן יהיה לעשות שימוש חוזר בגליון הנתונים הראשי.
5. כדי להמשיך לנתח נתונים (איור 2), לחשב הצטברות ΔT (למשל , שינוי של T בהצטברות מקסימלית בהשוואה ל- T בחושך), הימנעות ΔT (למשל , שינוי T בהימנעות מרבית בהשוואה ל- T בחושך), או dT/ dt (%/h) (למשל, שינוי ב- T במהלך החלק המהיר ביותר של תגובת ההצטברות או ההימנעות). לפרטים נוספים ראו ⁸.

תוצאות

החלקים השונים של התקן השידור מוצגים באיור 1. המיקרו-בקר הוא יחידת הבקרה של ההתקן ושולט בתנאי האור שהעלים, המאובטחים בקטעי עלים שחורים, חווים, ומאחסן את נתוני העברת האור שהוא מקבל (איור 1A,B). תקריב של יחידת הבקרה של המכשיר מציג את לחצן ההפעלה/כיבוי, את ?...

Discussion

המכשיר קל מאוד לשימוש, אך יש לו חשיבות מכרעת לכייל כל הגדרת קליפ עלה של התקן השידור באופן עצמאי מכיוון שמיצוב נורות ה-LED והפוטוטרנזיסטורים עשוי להשתנות מעט מסרטון עלה לקליפ עלה. ודא שנוריות ה-LED והפוטוטרנזיסטורים מוכנסים ביציבות ובדוק מחדש את הכיול אם הנתונים נראים כבויים. הימנע מהכנסת מים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water