Desarrollo de un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para medir la energía mitocondrial en el campo

Resumen

Diseñamos y construimos un laboratorio móvil para medir las tasas de respiración en mitocondrias aisladas de animales silvestres capturados en lugares de campo. Aquí, describimos el diseño y equipamiento de un laboratorio mitocondrial móvil y los protocolos de laboratorio asociados.

Resumen

La energética mitocondrial es un tema central en la bioquímica y fisiología animal, y los investigadores utilizan la respiración mitocondrial como métrica para investigar la capacidad metabólica. Para obtener las medidas de respiración mitocondrial, se deben utilizar muestras biológicas frescas y se debe completar todo el procedimiento de laboratorio en aproximadamente 2 h. Además, se requieren múltiples equipos especializados para realizar estos ensayos de laboratorio. Esto crea un desafío para medir la respiración mitocondrial en los tejidos de animales salvajes que viven lejos de los laboratorios de fisiología, ya que el tejido vivo no se puede conservar durante mucho tiempo después de la recolección en el campo. Además, el transporte de animales vivos a largas distancias induce estrés, lo que puede alterar la energía mitocondrial.

Este manuscrito presenta el MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU), un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial que se puede llevar al campo y utilizar in situ para medir el metabolismo mitocondrial en tejidos recolectados de animales salvajes. Se presentan las características básicas del laboratorio móvil y los métodos paso a paso para medir las tasas de respiración mitocondrial aisladas. Además, los datos presentados validan el éxito de equipar el laboratorio móvil de fisiología mitocondrial y realizar mediciones de la respiración mitocondrial. La novedad del laboratorio móvil radica en la capacidad de conducir hasta el campo y realizar mediciones mitocondriales en los tejidos de los animales capturados in situ.

Introducción

Hasta la fecha, los estudios diseñados para medir la energía mitocondrial se han limitado a animales de laboratorio o animales capturados cerca de laboratorios de fisiología establecidos, lo que impidió a los científicos realizar estudios bioenergéticos mitocondriales en tejidos recolectados de animales durante actividades tales como migración, buceo e hibernación 1,2,3,4,5,6 . Si bien muchos investigadores han medido con éxito las tasas metabólicas basales y máximas y los gastos energéticos diarios de los animales salvajes^7,8, la capacidad de los investigadores para medir el rendimiento de las mitocondrias ha seguido siendo limitada (pero ver 1,4,9). Esto se debe en parte a la necesidad de tejido fresco para aislar las mitocondrias y a una instalación de laboratorio para realizar los aislamientos dentro de aproximadamente 2 horas después de obtener el tejido fresco. Una vez que se han aislado las mitocondrias, las mediciones de la respiración mitocondrial también deben completarse dentro de ~ 1 h.

Las frecuencias respiratorias mitocondriales aisladas generalmente se realizan midiendo la concentración de oxígeno en un recipiente sellado conectado a un electrodo Clark. La teoría detrás de este método se basa en la observación básica de que el oxígeno es el último aceptor de electrones de la respiración mitocondrial durante la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, a medida que la concentración de oxígeno disminuye durante un experimento, se supone que se produce la producción de trifosfato de adenosina (ATP)¹⁰. El oxígeno consumido es un indicador del ATP producido. Los investigadores pueden crear condiciones experimentales específicas utilizando diferentes sustratos e iniciar la respiración estimulada por difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) mediante la adición de cantidades predeterminadas de ADP a la cámara. Después de la fosforilación del ADP exógeno a ATP, la tasa de consumo de oxígeno disminuye y se alcanza el estado 4 y se puede medir. Además, la adición de inhibidores específicos permite obtener información sobre la respiración por fuga y la respiración desacoplada¹⁰. La relación entre el estado 3 y el estado 4 determina la relación de control respiratorio (RCR), que es el indicador del acoplamiento mitocondrial global^10,11. Los valores más bajos de RCR indican una disfunción mitocondrial general, mientras que los valores más altos de RCR sugieren un mayor grado de acoplamiento mitocondrial¹⁰.

Como se indicó anteriormente, la recolección de material biológico, el aislamiento mitocondrial y la medición de las tasas respiratorias deben completarse dentro de las 2 h posteriores a la obtención del tejido. Para llevar a cabo esta tarea sin transportar animales a grandes distancias a laboratorios establecidos, se construyó un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para llevarlo a lugares de campo donde se pueden recopilar estos datos. Un vehículo recreativo Jayco Redhawk de 2018 se convirtió en un laboratorio móvil de fisiología molecular y se llamó MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU) (Figura 1A). Se seleccionó un vehículo recreativo debido al refrigerador, congelador, tanque de almacenamiento de agua y plomería incorporados, electricidad alimentada por baterías de 12 voltios, generador de gas, tanque de propano y sistema de autonivelación. Además, el vehículo recreativo ofrece la capacidad de permanecer en sitios remotos durante la noche para la recopilación de datos. La parte delantera del vehículo no fue alterada y proporciona los cuartos de conducción y dormitorio (Figura 1B). Se retiraron las amenidades del dormitorio previamente instaladas (cama, TV y gabinete) en la parte trasera del vehículo y la estufa.

Se instalaron estanterías de acero inoxidable hechas a medida y una encimera de cuarzo personalizada sostenida por un marco de aluminio 80/20 en lugar de las comodidades del dormitorio y la estufa (Figura 1C). Las mesas de laboratorio proporcionan un espacio adecuado para la recolección de datos (Figura 1D). Se tuvo en cuenta el consumo de energía de cada equipo (es decir, centrífuga refrigerada, cámaras de respiración mitocondrial, lectores de placas, computadoras, homogeneizadores, básculas, ultracongeladores portátiles y otros suministros generales de laboratorio). Para soportar las grandes demandas de voltaje y corriente de la centrífuga, el sistema eléctrico se actualizó al de un equipo de grado aeronáutico. Un compartimiento externo en la parte trasera del vehículo se convirtió en una bahía de almacenamiento de nitrógeno líquido, que cumple con las pautas del Departamento de Transporte de los Estados Unidos para el almacenamiento y transporte de nitrógeno líquido. Esta unidad de almacenamiento fue construida con acero inoxidable y tiene una ventilación adecuada para evitar que el gas nitrógeno en expansión se filtre en el compartimiento de pasajeros del vehículo.

Para confirmar que el laboratorio móvil se puede utilizar en estudios bioenergéticos mitocondriales, se aislaron mitocondrias y se midieron las tasas de respiración mitocondrial del músculo esquelético de las extremidades traseras de ratones domésticos silvestres (Mus musculus). Debido a que Mus musculus es un organismo modelo, las tasas de respiración mitocondrial de esta especie están bien establecidas^12,13,14. Aunque estudios previos han documentado el aislamiento mitocondrial a través de la centrifugación diferencial^15,16,17, a continuación se describe una breve descripción de los métodos utilizados en los métodos móviles de laboratorio de fisiología mitocondrial.

Protocolo

En las siguientes secciones se describen los métodos de laboratorio mitocondrial. Todos los procedimientos de manejo de animales y recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Auburn (#2019-3582).

1. Descripción de los buffers utilizados para la recogida de datos

NOTA: Estos tampones pueden prepararse en un laboratorio estacionario y trasladarse al laboratorio móvil antes de la excursión (a menos que se indique lo contrario a continuación).

1. Preparar el tampón de aislamiento mitocondrial del músculo esquelético con albúmina sérica bovina (BSA), como se observa en la Tabla 1.
   1. Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen) excepto el BSA libre de ácidos grasos. Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
   2. Ajuste la solución a un pH de 7,5 manteniendo la temperatura a 4 °C.
   3. Agregue el BSA sin ácidos grasos y suba el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
2. Prepare el tampón de aislamiento mitocondrial del músculo esquelético sin BSA como se ve en la Tabla 1.
   1. Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen). Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
   2. Ajuste la solución a un pH de 7,5 manteniendo la temperatura a 4 °C.
   3. Sube el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
3. Prepare el tampón de resuspensión del músculo esquelético como se ve en la Tabla 1.
   1. Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen). Coloque el tampón en el refrigerador hasta que la temperatura sea de 4 °C.
   2. Ajuste la solución a un pH de 7,4 manteniendo la temperatura a 4 °C.
   3. Sube el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
4. Prepare el tampón de respiración del músculo esquelético como se ve en la Tabla 2.
   1. Disuelva los productos químicos en agua desionizada (~ 90% de volumen) excepto el BSA libre de ácidos grasos. Calentar el tampón hasta que la temperatura sea de 37 °C.
   2. Ajuste la solución a un pH de 7,0 manteniendo la temperatura a 37 °C.
   3. Agregue el BSA sin ácidos grasos y suba el volumen al 100%. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL. Conservar esta solución a -20 °C hasta su uso.
5. Prepare los sustratos de respiración como se ve en la Tabla 2.
   1. Asegúrese de que estos sustratos se hagan frescos el día de la recolección de datos en 100 mM de Tris-HCl, pH 7.4. Almacene en hielo hasta su uso.
      NOTA: Los valores proporcionados son para hacer una solución suficientemente concentrada para que las mitocondrias absorban suficiente sustrato. Las concentraciones finales de los sustratos son 2 mM de piruvato, 2 mM de malato, 10 mM de glutamato y 5 mM de succinato.

2. Realización del aislamiento mitocondrial (Figura 2)

NOTA: Las mediciones de aislamiento mitocondrial y respiración mitocondrial se realizan en el área de la mesa de laboratorio del laboratorio móvil, y todas las soluciones deben mantenerse a 4 °C a menos que se indique lo contrario.

1. Estacione el laboratorio móvil en un terreno plano. Encienda el generador y nivele el vehículo. Extienda el tobogán y configure el equipo.
2. Descongele las cantidades deseadas de tampones.
   NOTA: Generalmente, se necesitan 30 ml de tampón de aislamiento del músculo esquelético y 10 ml de tampón de aislamiento del músculo esquelético sin BSA por músculo.
3. Configure y calibre las cámaras de respiración mitocondrial a la temperatura deseada de los experimentos y a la presión barométrica actual según las instrucciones del fabricante. Consulte la Tabla de materiales para conocer las cámaras específicas utilizadas en los experimentos.
4. Sacrificar al animal a través de la decapitación.
   NOTA: El presente estudio utilizó la decapitación para la eutanasia. Algunos gases, como el dióxido de carbono y el isoflurano, afectan la función mitocondrial^18,19,20; Estos efectos deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar el mejor método de eutanasia para cada estudio. El método que se debe realizar para cada estudio estará determinado por la pregunta científica que se haga.
5. Extirpar el músculo esquelético, recortar rápidamente la grasa y el tejido conectivo, pesar y colocar el músculo en un tampón de aislamiento del músculo esquelético con BSA (al menos 1/10 p/v) (p. ej., 1 g de músculo esquelético por 10 ml de tampón).
6. Pica el músculo esquelético con unas tijeras sobre hielo.
7. Transfiera el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 ml con una punta de pipeta cortada de 5 ml. Homogeneizar con una cuchilla (ver la Tabla de Materiales) al 50% de potencia durante 5 s. Añadir proteasa (5 mg/g de músculo húmedo) y digerir durante 7 min, mezclando la solución cada 30 s. Termine la reacción agregando un volumen igual de tampón de aislamiento con BSA.
8. Centrifugar el homogeneizado a 500 × g durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a través de una gasa de doble capa con una punta de pipeta cortada de 5 ml a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Centrifugar el sobrenadante a 3.500 × g durante 10 min para precipitar un gránulo mitocondrial marrón.
9. Vierte el sobrenadante restante. Agregue el mismo volumen de tampón de aislamiento con BSA al tubo de centrífuga. Vuelva a suspender el gránulo mitocondrial con un raspador flexible (policía) trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga. Centrifugar a 3.500 × g durante 10 min.
10. Vierte el sobrenadante restante. Agregue el mismo volumen de tampón de aislamiento sin BSA al tubo de centrífuga. Vuelva a suspender el gránulo mitocondrial trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga con un policía limpio. Centrifugar a 3.500 × g durante 10 min.
11. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el gránulo mitocondrial en un tampón de resuspensión trabajando suavemente el gránulo mitocondrial fuera de las paredes del tubo de centrífuga con un policía limpio.
    NOTA: El volumen del tampón de resuspensión dependerá del tamaño del gránulo de mitocondrias.
12. Transfiera las mitocondrias resuspendidas a un homogeneizador Dounce con una punta de pipeta cortada de 1 ml. Con el homogeneizador Dounce, homogeneice cuidadosamente la suspensión con 4-5 pasadas.
13. Coloque la suspensión mitocondrial en un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con otra punta de pipeta cortada de 1 ml.

3. Mediciones de la respiración mitocondrial (Figura 3)

1. Sustratos del Complejo I
   1. Añadir 945 μL de tampón respiratorio a la cámara. Asegúrese de que el agitador esté girando y de que la temperatura del tampón se mantenga a 37 °C. Inicie el registro de la recopilación de datos.
   2. Una vez que la concentración de oxígeno se haya estabilizado, agregue 20 μL de las mitocondrias y coloque la tapa en la cámara. En el software, denota que se agregaron mitocondrias a la cámara.
   3. Agregue 10 μL de glutamato 1 M, 10 μL de malato 200 mM y 10 μL de piruvato 200 mM a la cámara con jeringas individuales y espere hasta que la señal se estabilice. En el software, indique que se han agregado sustratos.
      NOTA: Estos sustratos se utilizan normalmente para medir la respiración impulsada por los carbohidratos. Para otras combinaciones de sustratos que se utilizarán para medir la respiración impulsada por la grasa, véase²¹.
   4. Añadir 5 μL de ADP con una jeringa separada y observar el rápido consumo de oxígeno (estado 3). En el software, indique que se agregó ADP.
      NOTA: Después de la fosforilación del ADP agregado, la tasa de consumo de oxígeno se estabilizará hasta el estado 4.
   5. Después de 4 minutos de la recopilación de datos del estado 4, finalice la grabación. Guarde el archivo de datos.
2. Sustratos del Complejo II
   1. Añadir 963 μL del tampón respiratorio a la cámara. Asegúrese de que el agitador esté girando y de que la temperatura del tampón se mantenga a 37 °C. Inicie el registro de la recopilación de datos.
   2. Una vez que la concentración de oxígeno se haya estabilizado, agregue 20 μL de mitocondrias y coloque la tapa en la cámara. En el software, denota que se agregaron mitocondrias a la solución.
   3. Agregue 2 μL de 4 μg/μL de rotenona seguido de 10 μL de succinato de 500 mM a la cámara usando jeringas separadas y espere hasta que la señal se estabilice. En el software, indique que se han agregado sustratos.
   4. Añadir 5 μL de ADP con una jeringa separada y observar el rápido consumo de oxígeno (estado 3). En el software, indique que se agregó ADP.
      NOTA: Después de la fosforilación del ADP agregado, la tasa de consumo de oxígeno se estabilizará hasta el estado 4.
   5. Después de 4 minutos de la recopilación de datos del estado 4, finalice la grabación. Guarde el archivo de datos.

Resultados

El presente manuscrito investigó la respiración mitocondrial de Mus musculus silvestre (n = 7, macho = 5, hembra = 2; edad = 1,30 ± 0,2 años) en un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial (Figura 1). Para medir la respiración mitocondrial del músculo esquelético, se utilizó toda la extremidad posterior, es decir, el músculo aeróbico y anaeróbico, para el aislamiento mitocondrial (Figura 2). En la Figura 3 ...

Discusión

El laboratorio móvil de fisiología mitocondrial permite a los investigadores aislar mitocondrias y medir las tasas de respiración mitocondrial dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de tejido en sitios de campo remotos. Los resultados presentados en este documento sugieren que las mediciones de la respiración mitocondrial realizadas en el MitoMobile de la UA son comparables a las mediciones realizadas en un laboratorio de investigación universitario. Específicamente, los valores para el estado 3, el es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	VWR	87003-294
2.0 mL centrifuge tubes	VWR	87003-298
50 mL centrifuge tubes	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
Clear 96 well plate	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounce homogenizer	VWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
Filter paper			Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
Glutamate	VWR	A12919
Hamilton Syringes	VWR	60373-985	Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph	Hansatech Instruments Ltd		No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4	VWR	97062-350
Malate	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
Membrane			Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
Potassium chloride (KCl)	VWR	97061-566
Protease	VWR	97062-366	Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid	VWR	97061-448
Sodium Dithionite	VWR	AA33381-22
Succinate	VWR	89230-086
Sucrose	VWR	BDH0308-500G
Tris-Base	VWR	97061-794
Tris-HCl	VWR	97061-258