Desarrollo de un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para medir la energía mitocondrial en el campo

Resumen

Diseñamos y construimos un laboratorio móvil para medir las tasas de respiración en mitocondrias aisladas de animales silvestres capturados en lugares de campo. Aquí, describimos el diseño y equipamiento de un laboratorio mitocondrial móvil y los protocolos de laboratorio asociados.

Resumen

La energética mitocondrial es un tema central en la bioquímica y fisiología animal, y los investigadores utilizan la respiración mitocondrial como métrica para investigar la capacidad metabólica. Para obtener las medidas de respiración mitocondrial, se deben utilizar muestras biológicas frescas y se debe completar todo el procedimiento de laboratorio en aproximadamente 2 h. Además, se requieren múltiples equipos especializados para realizar estos ensayos de laboratorio. Esto crea un desafío para medir la respiración mitocondrial en los tejidos de animales salvajes que viven lejos de los laboratorios de fisiología, ya que el tejido vivo no se puede conservar durante mucho tiempo después de la recolección en el campo. Además, el transporte de animales vivos a largas distancias induce estrés, lo que puede alterar la energía mitocondrial.

Este manuscrito presenta el MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU), un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial que se puede llevar al campo y utilizar in situ para medir el metabolismo mitocondrial en tejidos recolectados de animales salvajes. Se presentan las características básicas del laboratorio móvil y los métodos paso a paso para medir las tasas de respiración mitocondrial aisladas. Además, los datos presentados validan el éxito de equipar el laboratorio móvil de fisiología mitocondrial y realizar mediciones de la respiración mitocondrial. La novedad del laboratorio móvil radica en la capacidad de conducir hasta el campo y realizar mediciones mitocondriales en los tejidos de los animales capturados in situ.

Introducción

Hasta la fecha, los estudios diseñados para medir la energía mitocondrial se han limitado a animales de laboratorio o animales capturados cerca de laboratorios de fisiología establecidos, lo que impidió a los científicos realizar estudios bioenergéticos mitocondriales en tejidos recolectados de animales durante actividades tales como migración, buceo e hibernación 1,2,3,4,5,6 . Si bien muchos investigadores han medido con éxito las tasas metabólicas basales y máximas y los....

Protocolo

En las siguientes secciones se describen los métodos de laboratorio mitocondrial. Todos los procedimientos de manejo de animales y recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Auburn (#2019-3582).

1. Descripción de los buffers utilizados para la recogida de datos

NOTA: Estos tampones pueden prepararse en un laboratorio estacionario y trasladarse al laboratorio móvil antes de la excursión (a menos que se indique lo contrario a continuación).

1. Preparar el tampón de aislamiento mitocondrial del músculo esquelético con albúmina sérica b....

Resultados

El presente manuscrito investigó la respiración mitocondrial de Mus musculus silvestre (n = 7, macho = 5, hembra = 2; edad = 1,30 ± 0,2 años) en un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial (Figura 1). Para medir la respiración mitocondrial del músculo esquelético, se utilizó toda la extremidad posterior, es decir, el músculo aeróbico y anaeróbico, para el aislamiento mitocondrial (Figura 2). En la Figura 3 .......

Discusión

El laboratorio móvil de fisiología mitocondrial permite a los investigadores aislar mitocondrias y medir las tasas de respiración mitocondrial dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de tejido en sitios de campo remotos. Los resultados presentados en este documento sugieren que las mediciones de la respiración mitocondrial realizadas en el MitoMobile de la UA son comparables a las mediciones realizadas en un laboratorio de investigación universitario. Específicamente, los valores para el estado 3, el es.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	VWR	87003-294
2.0 mL centrifuge tubes	VWR	87003-298
50 mL centrifuge tubes	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
Clear 96 well plate	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounce homogenizer	VWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
Filter paper			Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
Glutamate	VWR	A12919
Hamilton Syringes	VWR	60373-985	Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph	Hansatech Instruments Ltd		No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4	VWR	97062-350
Malate	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
Membrane			Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
Potassium chloride (KCl)	VWR	97061-566
Protease	VWR	97062-366	Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid	VWR	97061-448
Sodium Dithionite	VWR	AA33381-22
Succinate	VWR	89230-086
Sucrose	VWR	BDH0308-500G
Tris-Base	VWR	97061-794
Tris-HCl	VWR	97061-258