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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo progettato e costruito un laboratorio mobile per misurare la frequenza respiratoria nei mitocondri isolati di animali selvatici catturati sul campo. Qui descriviamo la progettazione e l'allestimento di un laboratorio mitocondriale mobile e i protocolli di laboratorio associati.

Abstract

L'energetica mitocondriale è un tema centrale nella biochimica e nella fisiologia animale, con i ricercatori che utilizzano la respirazione mitocondriale come metrica per studiare la capacità metabolica. Per ottenere le misure della respirazione mitocondriale, è necessario utilizzare campioni biologici freschi e completare l'intera procedura di laboratorio entro circa 2 ore. Inoltre, per eseguire questi test di laboratorio sono necessarie più apparecchiature specializzate. Ciò crea una sfida per la misurazione della respirazione mitocondriale nei tessuti degli animali selvatici che vivono lontano dai laboratori di fisiologia, poiché i tessuti vivi non possono essere conservati per molto tempo dopo la raccolta sul campo. Inoltre, il trasporto di animali vivi su lunghe distanze induce stress, che può alterare l'energia mitocondriale.

Questo manoscritto presenta il MitoMobile dell'Università di Auburn (AU), un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale che può essere portato sul campo e utilizzato in loco per misurare il metabolismo mitocondriale nei tessuti raccolti da animali selvatici. Vengono presentate le caratteristiche di base del laboratorio mobile e i metodi passo-passo per misurare la frequenza respiratoria mitocondriale isolata. Inoltre, i dati presentati convalidano il successo dell'allestimento del laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale e dell'esecuzione di misurazioni della respirazione mitocondriale. La novità del laboratorio mobile sta nella possibilità di recarsi sul campo ed eseguire misurazioni mitocondriali sui tessuti degli animali catturati in loco.

Introduzione

Fino ad oggi, gli studi progettati per misurare l'energetica mitocondriale sono stati limitati ad animali da laboratorio o animali catturati vicino a laboratori di fisiologia stabiliti, il che ha precluso agli scienziati di eseguire studi bioenergetici mitocondriali in tessuti raccolti da animali durante attività come la migrazione, l'immersione e l'ibernazione 1,2,3,4,5,6 . Mentre molti ricercatori hanno misurato con successo i tassi metabolici basali e di picco e il dispendio energetico giornaliero degli animali selvatici7,8, la capacità dei ricercatori di misurare le prestazioni dei mitocondri è rimasta limitata (ma vedi 1,4,9). Ciò è in parte dovuto alla necessità di tessuto fresco per isolare i mitocondri e di una struttura di laboratorio per eseguire gli isolamenti entro circa 2 ore dall'ottenimento del tessuto fresco. Una volta che i mitocondri sono stati isolati, anche le misurazioni della respirazione mitocondriale devono essere completate entro ~1 ora.

Le frequenze di respirazione mitocondriale isolate vengono solitamente eseguite misurando la concentrazione di ossigeno in un contenitore sigillato collegato a un elettrodo di Clark. La teoria alla base di questo metodo si basa sull'osservazione di base che l'ossigeno è l'ultimo accettore di elettroni della respirazione mitocondriale durante la fosforilazione ossidativa. Pertanto, quando la concentrazione di ossigeno diminuisce durante un esperimento, si presume che si verifichi la produzione di adenosina trifosfato (ATP)10. L'ossigeno consumato è un indicatore dell'ATP prodotto. I ricercatori possono creare condizioni sperimentali specifiche utilizzando diversi substrati e avviare la respirazione stimolata dall'adenosina difosfato (ADP) (stato 3) aggiungendo quantità predeterminate di ADP alla camera. A seguito della fosforilazione dell'ADP esogeno in ATP, il tasso di consumo di ossigeno diminuisce e lo stato 4 viene raggiunto e può essere misurato. Inoltre, l'aggiunta di inibitori specifici consente di ottenere informazioni sulla respirazione a dispersione e sulla respirazione disaccoppiata10. Il rapporto tra lo stato 3 e lo stato 4 determina il rapporto di controllo respiratorio (RCR), che è l'indicatore dell'accoppiamento mitocondriale complessivo10,11. Valori più bassi di RCR indicano una disfunzione mitocondriale complessiva, mentre valori più alti di RCR suggeriscono una maggiore estensione dell'accoppiamento mitocondriale10.

Come affermato in precedenza, la raccolta del materiale biologico, l'isolamento mitocondriale e la misurazione della frequenza respiratoria devono essere completati entro 2 ore dal prelievo del tessuto. Per svolgere questo compito senza trasportare gli animali su grandi distanze verso laboratori consolidati, è stato costruito un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale da portare in luoghi sul campo dove questi dati possono essere raccolti. Un veicolo ricreativo Jayco Redhawk del 2018 è stato convertito in un laboratorio mobile di fisiologia molecolare e chiamato Auburn University (AU) MitoMobile (Figura 1A). Un veicolo ricreativo è stato selezionato per il frigorifero incorporato, il congelatore, il serbatoio di stoccaggio dell'acqua e l'impianto idraulico, l'elettricità alimentata da batterie da 12 volt, il generatore di gas, il serbatoio di propano e il sistema di autolivellamento. Inoltre, il veicolo ricreativo offre la possibilità di rimanere in siti remoti durante la notte per la raccolta dei dati. La parte anteriore del veicolo non è stata alterata e fornisce la zona guida e la zona notte (Figura 1B). I servizi della camera da letto precedentemente installati (letto, TV e armadio) nella parte posteriore del veicolo e nel piano cottura sono stati rimossi.

Al posto dei servizi della camera da letto e del piano cottura sono state installate scaffalature in acciaio inossidabile su misura e un piano di lavoro in quarzo personalizzato supportato da un'intelaiatura in alluminio 80/20 (Figura 1C). I banchi del laboratorio offrono uno spazio adeguato per la raccolta dei dati (Figura 1D). È stato preso in considerazione il consumo energetico di ogni apparecchiatura (ad esempio, centrifuga refrigerata, camere di respirazione mitocondriale, lettori di piastre, computer, omogeneizzatori, bilance, ultra-congelatore portatile e altre forniture di laboratorio generali). Per supportare le grandi richieste di tensione e corrente della centrifuga, il sistema elettrico è stato aggiornato a quello di apparecchiature di livello aeronautico. Un vano esterno nella parte posteriore del veicolo è stato convertito in una baia di stoccaggio dell'azoto liquido, che soddisfa le linee guida del Dipartimento dei trasporti degli Stati Uniti per lo stoccaggio e il trasporto di azoto liquido. Questa unità di stoccaggio è stata costruita in acciaio inossidabile e ha un'adeguata ventilazione per evitare che l'azoto gassoso in espansione fuoriesca nell'abitacolo del veicolo.

Per confermare che il laboratorio mobile può essere utilizzato negli studi bioenergetici mitocondriali, sono stati isolati i mitocondri e sono stati misurati i tassi di respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico degli arti posteriori di topi domestici di derivazione selvatica (Mus musculus). Poiché Mus musculus è un organismo modello, i tassi di respirazione mitocondriale di questa specie sono ben stabiliti12,13,14. Sebbene studi precedenti abbiano documentato l'isolamento mitocondriale tramite centrifugazione differenziale15,16,17, di seguito viene descritta una breve panoramica dei metodi utilizzati nei metodi di laboratorio di fisiologia mitocondriale mobile.

Protocollo

Le sezioni seguenti descrivono i metodi di laboratorio mitocondriale. Tutte le procedure di manipolazione degli animali e di raccolta dei tessuti sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Auburn (#2019-3582).

1. Descrizione dei buffer utilizzati per la raccolta dei dati

NOTA: Questi tamponi possono essere preparati in un laboratorio fisso e spostati nel laboratorio mobile prima della gita sul campo (se non diversamente specificato di seguito).

  1. Preparare il tampone di isolamento mitocondriale del muscolo scheletrico con albumina sierica bovina (BSA), come mostrato nella Tabella 1.
    1. Sciogliere le sostanze chimiche in acqua deionizzata (~ 90% in volume) ad eccezione della BSA priva di acidi grassi. Mettere il tampone in frigorifero fino a quando la temperatura non raggiunge i 4 °C.
    2. Regolare la soluzione a un pH di 7,5 mantenendo la temperatura a 4 °C.
    3. Aggiungere il BSA senza acidi grassi e portare il volume al 100%. Aliquotare la soluzione in provette coniche da 50 mL. Conservare questa soluzione a -20 °C fino al momento dell'uso.
  2. Preparare il tampone di isolamento mitocondriale del muscolo scheletrico senza BSA come mostrato nella Tabella 1.
    1. Sciogliere le sostanze chimiche in acqua deionizzata (~ 90% in volume). Mettere il tampone in frigorifero fino a quando la temperatura non raggiunge i 4 °C.
    2. Regolare la soluzione a un pH di 7,5 mantenendo la temperatura a 4 °C.
    3. Alza il volume al 100%. Aliquotare la soluzione in provette coniche da 50 mL. Conservare questa soluzione a -20 °C fino al momento dell'uso.
  3. Preparare il tampone di risospensione del muscolo scheletrico come mostrato nella Tabella 1.
    1. Sciogliere le sostanze chimiche in acqua deionizzata (~ 90% in volume). Mettere il tampone in frigorifero fino a quando la temperatura non raggiunge i 4 °C.
    2. Regolare la soluzione a un pH di 7,4 mantenendo la temperatura a 4 °C.
    3. Alza il volume al 100%. Aliquotare la soluzione in provette coniche da 50 mL. Conservare questa soluzione a -20 °C fino al momento dell'uso.
  4. Preparare il tampone per la respirazione del muscolo scheletrico come mostrato nella Tabella 2.
    1. Sciogliere le sostanze chimiche in acqua deionizzata (~ 90% in volume) ad eccezione della BSA priva di acidi grassi. Riscaldare il tampone fino a raggiungere la temperatura di 37 °C.
    2. Regolare la soluzione a un pH di 7,0 mantenendo la temperatura a 37 °C.
    3. Aggiungere il BSA senza acidi grassi e portare il volume al 100%. Aliquotare la soluzione in provette coniche da 50 mL. Conservare questa soluzione a -20 °C fino al momento dell'uso.
  5. Preparare i substrati di respirazione come mostrato nella Tabella 2.
    1. Assicurarsi che questi substrati siano freschi il giorno della raccolta dei dati in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Conservare su ghiaccio fino al momento dell'uso.
      NOTA: I valori forniti servono a creare una soluzione sufficientemente concentrata per consentire ai mitocondri di assorbire una quantità sufficiente di substrato. Le concentrazioni finali dei substrati sono 2 mM di piruvato, 2 mM di malato, 10 mM di glutammato e 5 mM di succinato.

2. Esecuzione dell'isolamento mitocondriale (Figura 2)

NOTA: Le misurazioni dell'isolamento mitocondriale e della respirazione mitocondriale vengono eseguite nell'area del banco del laboratorio mobile e tutte le soluzioni devono essere mantenute a 4 °C, salvo diversa indicazione.

  1. Parcheggiare il laboratorio mobile su un terreno pianeggiante. Accendere il generatore e livellare il veicolo. Estendere la slitta e installare l'attrezzatura.
  2. Scongelare le quantità desiderate di tamponi.
    NOTA: Generalmente, sono necessari 30 ml di tampone per l'isolamento del muscolo scheletrico e 10 mL di tampone per l'isolamento del muscolo scheletrico senza BSA per muscolo.
  3. Impostare e calibrare le camere di respirazione mitocondriale alla temperatura desiderata degli esperimenti e alla pressione barometrica corrente secondo le istruzioni del produttore. Vedere la tabella dei materiali per le camere specifiche utilizzate negli esperimenti.
  4. Sopprimere l'animale tramite decapitazione.
    NOTA: L'attuale studio ha utilizzato la decapitazione per l'eutanasia. Alcuni gas, come l'anidride carbonica e l'isoflurano, influenzano la funzione mitocondriale18,19,20; Questi effetti devono essere presi in considerazione quando si seleziona il miglior metodo di eutanasia per ogni studio. Il metodo da eseguire per ogni studio sarà determinato dalla domanda scientifica posta.
  5. Asportare il muscolo scheletrico, tagliare rapidamente il grasso e il tessuto connettivo, pesare e posizionare il muscolo in un tampone di isolamento del muscolo scheletrico con BSA (almeno 1/10 p/v) (ad esempio, 1 g di muscolo scheletrico in 10 mL di tampone).
  6. Tritare il muscolo scheletrico con le forbici sul ghiaccio.
  7. Trasferire il tessuto tritato in una provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando un puntale per pipetta da 5 mL tagliato. Omogeneizzare con una lama (vedi Tabella dei Materiali) al 50% della potenza per 5 s. Aggiungere la proteasi (5 mg/g di muscolo umido) e digerire per 7 minuti, mescolando la soluzione ogni 30 s. Terminare la reazione aggiungendo un volume uguale di tampone di isolamento con BSA.
  8. Centrifugare l'omogenato a 500 × g per 10 min. Trasferire il surnatante attraverso una garza a doppio strato utilizzando un puntale per pipetta da 5 mL tagliato in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL. Centrifugare il surnatante a 3.500 × g per 10 minuti per far precipitare un pellet mitocondriale marrone.
  9. Versare il surnatante rimanente. Aggiungere lo stesso volume di tampone di isolamento con BSA alla provetta da centrifuga. Risospendere il pellet mitocondriale con un raschietto flessibile (poliziotto) lavorando delicatamente il pellet mitocondriale dalle pareti della provetta da centrifuga. Centrifugare a 3.500 × g per 10 min.
  10. Versare il surnatante rimanente. Aggiungere lo stesso volume di tampone di isolamento senza BSA alla provetta da centrifuga. Risospendere il pellet mitocondriale lavorando delicatamente il pellet mitocondriale dalle pareti della provetta da centrifuga con un poliziotto pulito. Centrifugare a 3.500 × g per 10 min.
  11. Decantare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale nel tampone di risospensione lavorando delicatamente il pellet mitocondriale dalle pareti della provetta da centrifuga con un poliziotto pulito.
    NOTA: Il volume del tampone di risospensione dipenderà dalle dimensioni del pellet mitocondriale.
  12. Trasferire i mitocondri risospesi in un omogeneizzatore Dounce con un puntale per pipetta da 1 mL tagliato. Utilizzando l'omogeneizzatore Dounce, omogeneizzare accuratamente la sospensione con 4-5 passaggi.
  13. Posizionare la sospensione mitocondriale in una provetta per microcentrifuga da 2 mL etichettata utilizzando un altro puntale per pipetta da 1 mL tagliato.

3. Misurazioni della respirazione mitocondriale (Figura 3)

  1. Substrati complessi I
    1. Aggiungere 945 μL di tampone respiratorio alla camera. Assicurarsi che l'agitatore ruoti e che la temperatura del tampone sia mantenuta a 37 °C. Avviare la registrazione della raccolta dati.
    2. Dopo che la concentrazione di ossigeno si è stabilizzata, aggiungere 20 μL di mitocondri e posizionare il coperchio sulla camera. Nel software, indica che i mitocondri sono stati aggiunti alla camera.
    3. Aggiungere 10 μL di glutammato 1 M, 10 μL di malato 200 mM e 10 μL di piruvato 200 mM nella camera con siringhe individuali e attendere che il segnale si stabilizzi. Nel software, indicare che sono stati aggiunti substrati.
      NOTA: Questi substrati sono tipicamente utilizzati per misurare la respirazione guidata dai carboidrati. Per altre combinazioni di substrati da utilizzare per misurare la respirazione indotta dai grassi, vedere21.
    4. Aggiungere 5 μL di ADP con una siringa separata e osservare il rapido consumo di ossigeno (stato 3). Nel software, indicare che ADP è stato aggiunto.
      NOTA: A seguito della fosforilazione dell'ADP aggiunto, il tasso di consumo di ossigeno si stabilizzerà allo stato 4.
    5. Dopo 4 minuti di raccolta dei dati dello stato 4, terminare la registrazione. Salvare il file di dati.
  2. Substrati complessi II
    1. Aggiungere 963 μL di tampone respiratorio alla camera. Assicurarsi che l'agitatore ruoti e che la temperatura del tampone sia mantenuta a 37 °C. Avviare la registrazione della raccolta dati.
    2. Dopo che la concentrazione di ossigeno si è stabilizzata, aggiungere 20 μL di mitocondri e posizionare il coperchio sulla camera. Nel software, indica che i mitocondri sono stati aggiunti alla soluzione.
    3. Aggiungere 2 μL di rotenone 4 μg/μL seguiti da 10 μL di succinato da 500 mM nella camera utilizzando siringhe separate e attendere che il segnale si stabilizzi. Nel software, indicare che sono stati aggiunti substrati.
    4. Aggiungere 5 μL di ADP utilizzando una siringa separata e osservare il rapido consumo di ossigeno (stato 3). Nel software, indicare che ADP è stato aggiunto.
      NOTA: A seguito della fosforilazione dell'ADP aggiunto, il tasso di consumo di ossigeno si stabilizzerà allo stato 4.
    5. Dopo 4 minuti di raccolta dei dati dello stato 4, terminare la registrazione. Salvare il file di dati.

Risultati

L'attuale manoscritto ha studiato la respirazione mitocondriale di Mus musculus di derivazione selvatica (n = 7, maschio = 5, femmina = 2; età = 1,30 ± 0,2 anni) in un laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale (Figura 1). Per misurare la respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico, l'intero arto posteriore, quindi il muscolo aerobico e anaerobico, è stato utilizzato per l'isolamento mitocondriale (Figura 2). Esempi di dati grezzi sulla re...

Discussione

Il laboratorio mobile di fisiologia mitocondriale consente ai ricercatori di isolare i mitocondri e misurare i tassi di respirazione mitocondriale entro 2 ore dalla raccolta dei tessuti in siti remoti. I risultati qui presentati suggeriscono che le misurazioni della respirazione mitocondriale effettuate nell'AU MitoMobile sono paragonabili alle misurazioni effettuate in un laboratorio di ricerca universitario. In particolare, i valori per lo stato 3, lo stato 4 e l'RCR per Mus musculus di derivazione selvatica q...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Mark Nelms e John Tennant del dipartimento di ingegneria elettrica e informatica del Samuel Ginn College of Engineering dell'Università di Auburn per aver contribuito all'allestimento strutturale ed elettrico dell'AU MitoMobile. Inoltre, gli autori riconoscono il finanziamento per attrezzare l'AU MitoMobile e la ricerca da una sovvenzione dell'Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL centrifuge tubesVWR87003-294
2.0 mL centrifuge tubesVWR87003-298
50 mL centrifuge tubesVWR21009-681Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
Clear 96 well plateVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce homogenizerVWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
Filter paperIncluded with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSAVWR89423-672
GlucoseVWRBDH8005-500G
GlutamateVWRA12919
Hamilton SyringesVWR60373-985Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments LtdNo Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4VWR97062-350
MalateVWR97062-140
MannitolVWR97061-052
MembraneIncluded with Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicemanVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
Potassium chloride (KCl)VWR97061-566
ProteaseVWR97062-366Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acidVWR97061-448
Sodium DithioniteVWRAA33381-22
SuccinateVWR89230-086
SucroseVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258

Riferimenti

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