Entwicklung eines mobilen Labors für mitochondriale Physiologie zur Messung der mitochondrialen Energetik im Feld

Zusammenfassung

Wir haben ein mobiles Labor entworfen und gebaut, um die Atmungsraten in isolierten Mitochondrien von Wildtieren zu messen, die an Feldstandorten gefangen wurden. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Ausstattung eines mobilen mitochondrialen Labors und die dazugehörigen Laborprotokolle.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Energetik ist ein zentrales Thema in der Biochemie und Physiologie von Tieren, wobei Forscher die mitochondriale Atmung als Metrik verwenden, um die Stoffwechselfähigkeit zu untersuchen. Um die Messungen der mitochondrialen Atmung zu erhalten, müssen frische biologische Proben verwendet werden, und das gesamte Laborverfahren muss innerhalb von ca. 2 h abgeschlossen sein. Darüber hinaus sind mehrere Spezialgeräte erforderlich, um diese Labortests durchzuführen. Dies stellt eine Herausforderung für die Messung der mitochondrialen Atmung in den Geweben von Wildtieren dar, die weit entfernt von physiologischen Labors leben, da lebendes Gewebe nach der Entnahme im Feld nicht sehr lange konserviert werden kann. Darüber hinaus führt der Transport lebender Tiere über große Entfernungen zu Stress, der die Energetik der Mitochondrien verändern kann.

Dieses Manuskript stellt das MitoMobile der Auburn University (AU) vor, ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie, das vor Ort zur Messung des mitochondrialen Stoffwechsels in Geweben von Wildtieren eingesetzt werden kann. Die Grundzüge des mobilen Labors und die Schritt-für-Schritt-Methoden zur Messung isolierter mitochondrialer Atmungsraten werden vorgestellt. Darüber hinaus bestätigen die präsentierten Daten den Erfolg der Ausstattung des mobilen Labors für mitochondriale Physiologie und der Durchführung von Messungen der mitochondrialen Atmung. Die Neuheit des mobilen Labors liegt in der Möglichkeit, zum Feld zu fahren und mitochondriale Messungen an den Geweben von Tieren durchzuführen, die vor Ort gefangen wurden.

Einleitung

Bisher waren Studien zur Messung der mitochondrialen Energetik auf Labortiere oder Tiere beschränkt, die in der Nähe etablierter Physiologielabors gefangen wurden, was Wissenschaftler daran hinderte, mitochondriale bioenergetische Studien an Geweben durchzuführen, die von Tieren während Aktivitäten wie Migration, Tauchen und Winterschlaf gesammelt wurden 1,2,3,4,5,6 . Während viele Forscher erfolgreich die Grund- und Spitzenumsatzraten und den täglichen Energieverbrauch von Wildtieren gemessen haben^7,8, ist die Fähigkeit der Forscher, die Leistung der Mitochondrien zu messen, begrenzt geblieben (siehe^aber 1,4,9). Dies ist zum Teil auf den Bedarf an frischem Gewebe zur Isolierung von Mitochondrien und einer Laboreinrichtung zurückzuführen, um die Isolierungen innerhalb von etwa 2 Stunden nach der Gewinnung des frischen Gewebes durchzuführen. Sobald die Mitochondrien isoliert wurden, sollten auch die mitochondrialen Atmungsmessungen innerhalb von ~1 h abgeschlossen sein.

Isolierte mitochondriale Atmungsraten werden in der Regel durch Messung der Sauerstoffkonzentration in einem versiegelten Behälter durchgeführt, der mit einer Clark-Elektrode verbunden ist. Die Theorie hinter dieser Methode basiert auf der grundlegenden Beobachtung, dass Sauerstoff der letzte Elektronenakzeptor der mitochondrialen Atmung während der oxidativen Phosphorylierung ist. Wenn die Sauerstoffkonzentration während eines Experiments sinkt, wird daher angenommen, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) stattfindet¹⁰. Der verbrauchte Sauerstoff ist ein Proxy für das produzierte ATP. Die Forscher können mit verschiedenen Substraten spezifische Versuchsbedingungen schaffen und eine Adenosindiphosphat (ADP)-stimulierte Atmung (Zustand 3) einleiten, indem sie der Kammer vorgegebene Mengen an ADP hinzufügen. Nach der Phosphorylierung des exogenen ADP zu ATP sinkt die Sauerstoffverbrauchsrate und der Zustand 4 ist erreicht und kann gemessen werden. Darüber hinaus können durch die Zugabe spezifischer Inhibitoren Informationen über die Leckatmung und die entkoppelte Atmung gewonnen werden¹⁰. Das Verhältnis von Zustand 3 zu Zustand 4 bestimmt das Atmungskontrollverhältnis (RCR), das der Indikator für die gesamte mitochondriale Kopplung ist^10,11. Niedrigere RCR-Werte deuten auf eine allgemeine mitochondriale Dysfunktion hin, während höhere RCR-Werte auf ein größeres Ausmaß der mitochondrialen Kopplung hindeuten¹⁰.

Wie bereits erwähnt, müssen die Entnahme von biologischem Material, die mitochondriale Isolierung und die Messung der Atemfrequenz innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme abgeschlossen sein. Um diese Aufgabe zu erfüllen, ohne die Tiere über große Entfernungen in etablierte Labore zu transportieren, wurde ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie gebaut, das an Feldorte gebracht wird, an denen diese Daten gesammelt werden können. Ein Freizeitfahrzeug des Typs Jayco Redhawk aus dem Jahr 2018 wurde in ein mobiles Labor für molekulare Physiologie umgewandelt und auf den Namen MitoMobile der Auburn University (AU) getauft (Abbildung 1A). Ein Freizeitfahrzeug wurde aufgrund des eingebauten Kühlschranks, des Gefrierschranks, des Wasserspeichers und der Sanitäranlagen, des Stroms mit 12-Volt-Batterien, des Gasgenerators, des Propangastanks und des Selbstnivellierungssystems ausgewählt. Darüber hinaus bietet das Freizeitfahrzeug die Möglichkeit, über Nacht an abgelegenen Standorten zu bleiben, um Daten zu sammeln. Die Front des Fahrzeugs wurde nicht verändert und dient als Fahrer- und Schlafraum (Bild 1B). Zuvor installierte Schlafzimmerausstattungen (Bett, Fernseher und Schrank) im Heck des Fahrzeugs und auf dem Herd wurden entfernt.

Anstelle der Schlafzimmerausstattung und des Herds wurden maßgefertigte Edelstahlregale und eine maßgefertigte Quarz-Arbeitsplatte installiert, die von einem 80/20-Aluminiumrahmen getragen wird (Abbildung 1C). Die Labortische bieten ausreichend Platz für die Datenerfassung (Abbildung 1D). Der Stromverbrauch der einzelnen Geräte (d. h. gekühlte Zentrifugen, mitochondriale Atmungskammern, Plattenleser, Computer, Homogenisatoren, Waagen, tragbare Ultrafroster und andere allgemeine Labormaterialien) wurde berücksichtigt. Um den hohen Spannungs- und Stromanforderungen der Zentrifuge gerecht zu werden, wurde das elektrische System auf das von Flugzeuggeräten aufgerüstet. Ein externes Fach im Heck des Fahrzeugs wurde zu einer Lagerbucht für flüssigen Stickstoff umgebaut, die den Richtlinien des US-Verkehrsministeriums für die Lagerung und den Transport von flüssigem Stickstoff entspricht. Dieser Speicher wurde aus Edelstahl gefertigt und verfügt über eine entsprechende Entlüftung, um zu verhindern, dass sich ausdehnendes Stickstoffgas in den Fahrgastraum des Fahrzeugs gelangt.

Um zu bestätigen, dass das mobile Labor in mitochondrialen bioenergetischen Studien eingesetzt werden kann, wurden Mitochondrien isoliert und mitochondriale Atmungsraten von wild gewonnenen Hausmäusen (Mus musculus) des Skelettmuskels der hinteren Gliedmaßen gemessen. Da Mus musculus ein Modellorganismus ist, sind die mitochondrialen Atmungsraten dieser Spezies gut etabliert^12,13,14. Obwohl frühere Studien die mitochondriale Isolierung mittels Differentialzentrifugation dokumentiert haben^15,16,17, wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die Methoden der mobilen mitochondrialen Physiologie im Labor beschrieben.

Protokoll

In den folgenden Abschnitten werden die mitochondrialen Labormethoden beschrieben. Alle Verfahren zur Handhabung von Tieren und zur Gewebeentnahme wurden vom Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (#2019-3582).

1. Beschreibung der für die Datenerhebung verwendeten Puffer

HINWEIS: Diese Puffer können in einem stationären Labor hergestellt und vor der Exkursion in das mobile Labor gebracht werden (sofern unten nicht anders angegeben).

1. Bereiten Sie den mitochondrialen Isolationspuffer der Skelettmuskulatur mit Rinderserumalbumin (BSA) vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Lösen Sie Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf, mit Ausnahme der fettsäurefreien BSA. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
   2. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
   3. Fügen Sie das fettsäurefreie BSA hinzu und erhöhen Sie das Volumen auf 100%. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
2. Bereiten Sie den mitochondrialen Isolationspuffer der Skelettmuskulatur ohne BSA vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
   2. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,5 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
   3. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 %. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
3. Bereiten Sie den Puffer für die Resuspension der Skelettmuskulatur vor, wie in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf. Stellen Sie den Puffer in den Kühlschrank, bis die Temperatur 4 °C beträgt.
   2. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,4 ein, während Sie die Temperatur bei 4 °C halten.
   3. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 100 %. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
4. Bereiten Sie den Puffer für die Skelettmuskelatmung vor, wie in Tabelle 2 dargestellt.
   1. Lösen Sie die Chemikalien in deionisiertem Wasser (~ 90 Vol.-%) auf, mit Ausnahme des fettsäurefreien BSA. Erhitzen Sie den Puffer, bis die Temperatur 37 °C beträgt.
   2. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 ein, während Sie die Temperatur bei 37 °C halten.
   3. Fügen Sie das fettsäurefreie BSA hinzu und erhöhen Sie das Volumen auf 100%. Aliquotieren Sie die Lösung in konische 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung bei -20 °C.
5. Bereiten Sie die Atmungssubstrate wie in Tabelle 2 dargestellt vor.
   1. Stellen Sie sicher, dass diese Substrate am Tag der Datenerfassung in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, frisch hergestellt werden. Bis zur Verwendung auf Eis lagern.
      ANMERKUNG: Die angegebenen Werte sollen eine ausreichend konzentrierte Lösung ergeben, damit genügend Substrat von den Mitochondrien aufgenommen werden kann. Die Endkonzentrationen der Substrate sind 2 mM Pyruvat, 2 mM Malat, 10 mM Glutamat und 5 mM Succinat.

2. Durchführung der mitochondrialen Isolierung (Abbildung 2)

HINWEIS: Messungen der mitochondrialen Isolierung und der mitochondrialen Atmung werden im Laborbereich des mobilen Labors durchgeführt, und alle Lösungen sollten bei 4 °C aufbewahrt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Parken Sie das mobile Labor auf ebenem Gelände. Schalten Sie den Generator ein und nivellieren Sie das Fahrzeug. Fahren Sie die Rutsche aus und richten Sie das Gerät ein.
2. Tauen Sie die gewünschten Mengen an Puffern auf.
   HINWEIS: Im Allgemeinen werden pro Muskel 30 ml Skelettmuskelisolationspuffer und 10 ml Skelettmuskelisolationspuffer ohne BSA benötigt.
3. Richten Sie die mitochondrialen Atemkammern ein und kalibrieren Sie sie auf die gewünschte Temperatur der Experimente und den aktuellen Luftdruck gemäß den Anweisungen des Herstellers. In der Materialtabelle finden Sie spezifische Kammern, die in Experimenten verwendet werden.
4. Euthanasieren Sie das Tier durch Enthauptung.
   ANMERKUNG: In der aktuellen Studie wurde die Enthauptung zur Euthanasie verwendet. Einige Gase, wie Kohlendioxid und Isofluran, beeinflussen die mitochondriale Funktion^18,19,20; Diese Effekte sollten bei der Auswahl der besten Euthanasiemethode für jede Studie berücksichtigt werden. Welche Methode für jede Studie durchgeführt werden soll, hängt von der gestellten wissenschaftlichen Fragestellung ab.
5. Entfernen Sie die Skelettmuskulatur, schneiden Sie Fett und Bindegewebe schnell ab, wiegen Sie sie und legen Sie den Muskel in einen Skelettmuskelisolationspuffer mit BSA (mindestens 1/10 w/v) (z. B. 1 g Skelettmuskel auf 10 ml Puffer).
6. Hacken Sie den Skelettmuskel mit einer Schere auf Eis.
7. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe mit einer abgeschnittenen 5-ml-Pipettenspitze in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Homogenisieren Sie es mit einer Klinge (siehe Materialtabelle) bei 50 % Leistung für 5 Sekunden. Fügen Sie Protease (5 mg/g feuchter Muskel) hinzu und verdauen Sie sie 7 Minuten lang, wobei die Lösung alle 30 Sekunden gemischt wird. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie ein gleiches Volumen des Isolationspuffers mit BSA hinzufügen.
8. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 500 × g für 10 min. Übertragen Sie den Überstand durch ein doppellagiges Mulltuch mit einer abgeschnittenen 5-ml-Pipettenspitze in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.500 × g für 10 Minuten, um ein braunes mitochondriales Pellet auszufällen.
9. Gießen Sie den restlichen Überstand aus. Geben Sie das gleiche Volumen des Isolationspuffers mit BSA in das Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet mit einem flexiblen Schaber (Polizist), indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten. Bei 3.500 × g 10 min zentrifugieren.
10. Gießen Sie den restlichen Überstand aus. Geben Sie das gleiche Volumen des Isolationspuffers ohne BSA in das Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet, indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig mit einem sauberen Polizisten von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten. Bei 3.500 × g 10 min zentrifugieren.
11. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet im Resuspensionspuffer, indem Sie das mitochondriale Pellet vorsichtig mit einem sauberen Polizisten von den Wänden des Zentrifugenröhrchens abarbeiten.
    HINWEIS: Das Volumen des Resuspensionspuffers hängt von der Größe des Mitochondrienpellets ab.
12. Übertragen Sie die resuspendierten Mitochondrien in einen Dounce-Homogenisator mit einer abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze. Mit dem Dounce-Homogenisator die Suspension mit 4-5 Durchgängen vorsichtig homogenisieren.
13. Geben Sie die mitochondriale Suspension in ein beschriftetes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer weiteren abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze.

3. Messungen der mitochondrialen Atmung (Abbildung 3)

1. Komplexe I-Substrate
   1. 945 μl Atmungspuffer in die Kammer geben. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührer dreht und die Puffertemperatur bei 37 °C gehalten wird. Starten Sie die Aufzeichnung der Datenerfassung.
   2. Nachdem sich die Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, fügen Sie 20 μl der Mitochondrien hinzu und legen Sie den Deckel auf die Kammer. Geben Sie in der Software an, dass der Kammer Mitochondrien hinzugefügt wurden.
   3. Geben Sie 10 μl 1 M Glutamat, 10 μl 200 mM Malat und 10 μl 200 mM Pyruvat in die Kammer mit den einzelnen Spritzen und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat. Geben Sie in der Software an, dass Substrate hinzugefügt wurden.
      HINWEIS: Diese Substrate werden in der Regel verwendet, um die kohlenhydratgesteuerte Atmung zu messen. Für andere Kombinationen von Substraten, die zur Messung der fettgetriebenen Atmung verwendet werden sollen, siehe²¹.
   4. Geben Sie 5 μl ADP mit einer separaten Spritze hinzu und beobachten Sie den schnellen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3). Geben Sie in der Software an, dass ADP hinzugefügt wurde.
      HINWEIS: Nach der Phosphorylierung des zugesetzten ADP wird sich die Sauerstoffverbrauchsrate auf Zustand 4 einpendeln.
   5. Beenden Sie die Aufzeichnung nach 4 Minuten der Datenerfassung im Zustand 4. Speichern Sie die Datendatei.
2. Komplexe II-Substrate
   1. Geben Sie 963 μl des Atempuffers in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührer dreht und die Puffertemperatur bei 37 °C gehalten wird. Starten Sie die Aufzeichnung der Datenerfassung.
   2. Nachdem sich die Sauerstoffkonzentration stabilisiert hat, fügen Sie 20 μl Mitochondrien hinzu und legen Sie den Deckel auf die Kammer. Geben Sie in der Software an, dass der Lösung Mitochondrien hinzugefügt wurden.
   3. Geben Sie 2 μl 4 μg/μl Rotenon gefolgt von 10 μl 500 mM Succinat mit separaten Spritzen in die Kammer und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat. Geben Sie in der Software an, dass Substrate hinzugefügt wurden.
   4. Geben Sie 5 μl ADP mit einer separaten Spritze hinzu und beobachten Sie den schnellen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3). Geben Sie in der Software an, dass ADP hinzugefügt wurde.
      HINWEIS: Nach der Phosphorylierung des zugesetzten ADP wird sich die Sauerstoffverbrauchsrate auf Zustand 4 einpendeln.
   5. Beenden Sie die Aufzeichnung nach 4 Minuten der Datenerfassung im Zustand 4. Speichern Sie die Datendatei.

Ergebnisse

Das vorliegende Manuskript untersuchte die mitochondriale Atmung von wild gewonnenem Mus musculus (n = 7, männlich = 5, weiblich = 2; Alter = 1,30 ± 0,2 Jahre) in einem mobilen Labor für mitochondriale Physiologie (Abbildung 1). Um die mitochondriale Atmung der Skelettmuskulatur zu messen, wurde die gesamte Hintergliedmaße, also der aerobe und anaerobe Muskel, zur mitochondrialen Isolierung verwendet (Abbildung 2). Beispiele für rohe Daten zur mito...

Diskussion

Das mobile Labor für mitochondriale Physiologie ermöglicht es Forschern, Mitochondrien zu isolieren und die mitochondriale Atmungsrate innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme an entfernten Feldstandorten zu messen. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Messungen der mitochondrialen Atmung, die im AU MitoMobile durchgeführt wurden, mit Messungen in einem universitären Forschungslabor vergleichbar sind. Insbesondere sind die hier vorgestellten Werte für Zustand 3, Zustand 4 und RCR für wil...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	VWR	87003-294
2.0 mL centrifuge tubes	VWR	87003-298
50 mL centrifuge tubes	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
Clear 96 well plate	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounce homogenizer	VWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
Filter paper			Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
Glutamate	VWR	A12919
Hamilton Syringes	VWR	60373-985	Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph	Hansatech Instruments Ltd		No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4	VWR	97062-350
Malate	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
Membrane			Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
Potassium chloride (KCl)	VWR	97061-566
Protease	VWR	97062-366	Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid	VWR	97061-448
Sodium Dithionite	VWR	AA33381-22
Succinate	VWR	89230-086
Sucrose	VWR	BDH0308-500G
Tris-Base	VWR	97061-794
Tris-HCl	VWR	97061-258