Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain

Résumé

Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.

Résumé

L’énergétique mitochondriale est un thème central de la biochimie et de la physiologie animales, les chercheurs utilisant la respiration mitochondriale comme mesure pour étudier la capacité métabolique. Pour obtenir les mesures de la respiration mitochondriale, des échantillons biologiques frais doivent être utilisés et l’ensemble de la procédure de laboratoire doit être terminée dans un délai d’environ 2 heures. De plus, plusieurs pièces d’équipement spécialisé sont nécessaires pour effectuer ces tests de laboratoire. Cela crée un défi pour la mesure de la respiration mitochondriale dans les tissus d’animaux sauvages vivant loin des laboratoires de physiologie, car les tissus vivants ne peuvent pas être conservés très longtemps après le prélèvement sur le terrain. De plus, le transport d’animaux vivants sur de longues distances induit un stress, qui peut altérer l’énergétique mitochondriale.

Ce manuscrit présente le MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU), un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale qui peut être emmené sur le terrain et utilisé sur place pour mesurer le métabolisme mitochondrial dans des tissus prélevés sur des animaux sauvages. Les caractéristiques de base du laboratoire mobile et les méthodes étape par étape pour mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont présentées. De plus, les données présentées valident le succès de l’équipement du laboratoire mobile de physiologie mitochondriale et de la réalisation de mesures de la respiration mitochondriale. La nouveauté du laboratoire mobile réside dans la possibilité de se rendre sur le terrain et d’effectuer des mesures mitochondriales sur les tissus d’animaux capturés sur place.

Introduction

À ce jour, les études conçues pour mesurer l’énergie mitochondriale ont été limitées aux animaux de laboratoire ou aux animaux capturés à proximité de laboratoires de physiologie établis, ce qui a empêché les scientifiques d’effectuer des études bioénergétiques mitochondriales dans des tissus prélevés sur des animaux au cours d’activités telles que la migration, la plongée et l’hibernation 1,2,3,4,5,6 . Bien que de nombreux chercheurs aient réussi à mesurer les taux métaboliques de base et de pointe et les dépenses énergétiques quotidiennes des animaux sauvages^7,8, la capacité des chercheurs à mesurer la performance des mitochondries est restée limitée (mais voir 1,4,9). Cela est dû en partie au besoin de tissus frais pour isoler les mitochondries et d’une installation de laboratoire pour effectuer les isolements dans les 2 heures environ suivant l’obtention du tissu frais. Une fois les mitochondries isolées, les mesures de la respiration mitochondriale doivent également être effectuées dans un délai de ~1 h.

Les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont généralement effectuées en mesurant la concentration d’oxygène dans un récipient scellé connecté à une électrode Clark. La théorie qui sous-tend cette méthode est fondée sur l’observation fondamentale que l’oxygène est le dernier accepteur d’électrons de la respiration mitochondriale pendant la phosphorylation oxydative. Par conséquent, lorsque la concentration d’oxygène diminue au cours d’une expérience, on suppose que la production d’adénosine triphosphate (ATP) se produit¹⁰. L’oxygène consommé est un indicateur de l’ATP produit. Les chercheurs peuvent créer des conditions expérimentales spécifiques en utilisant différents substrats et initier une respiration stimulée par l’adénosine diphosphate (ADP) (état 3) en ajoutant des quantités prédéterminées d’ADP dans la chambre. Suite à la phosphorylation de l’ADP exogène en ATP, le taux de consommation d’oxygène diminue, et l’état 4 est atteint et peut être mesuré. De plus, l’ajout d’inhibiteurs spécifiques permet d’obtenir des informations sur la respiration par fuite et la respiration non couplée¹⁰. Le rapport entre l’état 3 et l’état 4 détermine le rapport de contrôle respiratoire (RCR), qui est l’indicateur du couplage mitochondrial global^10,11. Des valeurs plus faibles de RCR indiquent un dysfonctionnement mitochondrial global, tandis que des valeurs de RCR plus élevées suggèrent une plus grande étendue de couplage mitochondrial¹⁰.

Comme indiqué précédemment, le prélèvement de matériel biologique, l’isolement mitochondrial et la mesure de la fréquence respiratoire doivent être effectués dans les 2 heures suivant l’obtention du tissu. Pour accomplir cette tâche sans transporter les animaux sur de grandes distances vers des laboratoires établis, un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale a été construit pour être transporté sur le terrain où ces données peuvent être recueillies. Un véhicule récréatif Jayco Redhawk 2018 a été converti en laboratoire mobile de physiologie moléculaire et nommé MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU) (figure 1A). Un véhicule récréatif a été choisi en raison du réfrigérateur, du congélateur, du réservoir de stockage d’eau et de la plomberie intégrés, de l’électricité alimentée par des batteries de 12 volts, de la génératrice de gaz, du réservoir de propane et du système d’autonivellement. De plus, le véhicule récréatif permet de passer la nuit sur des sites éloignés pour recueillir des données. L’avant du véhicule n’a pas été modifié et sert de poste de conduite et de couchage (figure 1B). Les commodités de la chambre à coucher (lit, téléviseur et armoire) précédemment installées à l’arrière du véhicule et sur la cuisinière ont été retirées.

Des étagères en acier inoxydable sur mesure et un comptoir en quartz sur mesure soutenu par un cadre en aluminium 80/20 ont été installés à la place des commodités de la chambre et de la cuisinière (figure 1C). Les paillasses de laboratoire offrent un espace suffisant pour la collecte de données (figure 1D). La consommation d’énergie de chaque pièce d’équipement (c’est-à-dire la centrifugeuse réfrigérée, les chambres de respiration mitochondriale, les lecteurs de plaques, les ordinateurs, les homogénéisateurs, les balances, l’ultra-congélateur portatif et d’autres fournitures de laboratoire générales) a été prise en considération. Pour répondre aux exigences élevées de tension et de courant de la centrifugeuse, le système électrique a été mis à niveau pour devenir un équipement de qualité aéronautique. Un compartiment externe à l’arrière du véhicule a été converti en baie de stockage d’azote liquide, ce qui répond aux directives du ministère des Transports des États-Unis pour le stockage et le transport de l’azote liquide. Cette unité de stockage a été construite en acier inoxydable et dispose d’une ventilation appropriée pour empêcher toute fuite d’azote gazeux en expansion dans l’habitacle du véhicule.

Pour confirmer que le laboratoire mobile peut être utilisé dans des études bioénergétiques mitochondriales, les mitochondries ont été isolées et les taux de respiration mitochondriale des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris domestiques sauvages (Mus musculus) ont été mesurés. Parce que Mus musculus est un organisme modèle, les taux de respiration mitochondriale de cette espèce sont bien établis^12,13,14. Bien que des études antérieures aient documenté l’isolement mitochondrial par centrifugation différentielle^15,16,17, un bref aperçu des méthodes utilisées dans les méthodes mobiles de laboratoire de physiologie mitochondriale est décrit ci-dessous.

Protocole

Les sections suivantes décrivent les méthodes de laboratoire mitochondriales. Toutes les procédures de manipulation des animaux et de prélèvement de tissus ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université d’Auburn (#2019-3582).

1. Description des tampons utilisés pour la collecte des données

REMARQUE : Ces tampons peuvent être préparés dans un laboratoire fixe et déplacés vers le laboratoire mobile avant l’excursion sur le terrain (sauf indication contraire ci-dessous).

1. Préparer le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique avec de l’albumine sérique bovine (BSA), comme indiqué dans le tableau 1.
   1. Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90 % en volume), à l’exception du BSA sans acides gras. Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
   2. Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.
   3. Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparez le tampon d’isolement mitochondrial du muscle squelettique sans BSA, comme indiqué dans le tableau 1.
   1. Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
   2. Ajustez la solution à un pH de 7,5 tout en maintenant la température à 4 °C.
   3. Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
3. Préparez le tampon de remise en suspension des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 1.
   1. Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% du volume). Placez le tampon au réfrigérateur jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C.
   2. Ajustez la solution à un pH de 7,4 tout en maintenant la température à 4 °C.
   3. Augmentez le volume à 100 %. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
4. Préparez le tampon de respiration des muscles squelettiques comme indiqué dans le tableau 2.
   1. Dissoudre les produits chimiques dans de l’eau déminéralisée (~ 90% en volume) à l’exception du BSA sans acides gras. Chauffez le tampon jusqu’à ce que la température atteigne 37 °C.
   2. Ajustez la solution à un pH de 7,0 tout en maintenant la température à 37 °C.
   3. Ajoutez le BSA sans acides gras et augmentez le volume à 100%. Aliquote la solution dans des tubes coniques de 50 mL. Conservez cette solution à -20 °C jusqu’à utilisation.
5. Préparez les substrats respiratoires comme indiqué dans le tableau 2.
   1. S’assurer que ces substrats sont frais le jour de la collecte des données dans 100 mM de Tris-HCl, pH 7,4. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Les valeurs fournies sont pour obtenir une solution suffisamment concentrée pour qu’un substrat suffisant soit absorbé par les mitochondries. Les concentrations finales des substrats sont de 2 mM de pyruvate, 2 mM de malate, 10 mM de glutamate et 5 mM de succinate.

2. Réalisation de l’isolement mitochondrial (Figure 2)

REMARQUE : L’isolement mitochondrial et les mesures de la respiration mitochondriale sont effectués dans la zone de la paillasse du laboratoire mobile, et toutes les solutions doivent être conservées à 4 °C, sauf indication contraire.

1. Garez le laboratoire mobile sur un terrain plat. Allumez le générateur et mettez le véhicule à niveau. Déployez la glissière et installez l’équipement.
2. Décongeler les quantités désirées de tampons.
   REMARQUE : En règle générale, 30 mL de tampon d’isolement des muscles squelettiques et 10 mL de tampon d’isolation des muscles squelettiques sans BSA sont nécessaires par muscle.
3. Installez et calibrez les chambres de respiration mitochondriale à la température souhaitée des expériences et à la pression barométrique actuelle selon les instructions du fabricant. Voir le tableau des matériaux pour les chambres spécifiques utilisées dans les expériences.
4. Euthanasier l’animal par décapitation.
   REMARQUE : La présente étude a utilisé la décapitation pour l’euthanasie. Certains gaz, tels que le dioxyde de carbone et l’isoflurane, affectent la fonction mitochondriale^18,19,20 ; Ces effets doivent être pris en compte lors du choix de la meilleure méthode d’euthanasie pour chaque étude. La méthode à appliquer pour chaque étude sera déterminée par la question scientifique posée.
5. Exciser le muscle squelettique, couper rapidement la graisse et le tissu conjonctif, peser et placer le muscle dans un tampon d’isolement du muscle squelettique avec du BSA (au moins 1/10 p/v) (par exemple, 1 g de muscle squelettique pour 10 mL de tampon).
6. Hachez le muscle squelettique avec des ciseaux sur de la glace.
7. Transférer le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml. Homogénéisez-le à l’aide d’une lame (voir le tableau des matériaux) à 50% de puissance pendant 5 s. Ajouter la protéase (5 mg/g de muscle humide) et digérer pendant 7 min, en mélangeant la solution toutes les 30 s. Terminez la réaction en ajoutant un volume égal de tampon d’isolement avec BSA.
8. Centrifuger l’homogénat à 500 × g pendant 10 min. Transvaser le surnageant à travers une étamine à double couche à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 5 ml dans un tube à centrifuger propre de 50 ml. Centrifuger le surnageant à 3 500 × g pendant 10 min pour précipiter une pastille mitochondriale brune.
9. Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement avec BSA dans le tube de centrifugation. Remettez en suspension la pastille mitochondriale à l’aide d’un grattoir flexible (policier) en faisant glisser doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.
10. Versez le surnageant restant. Ajoutez le même volume de tampon d’isolement sans BSA dans le tube de centrifugation. Remettez la pastille mitochondriale en suspension en la faisant sortir doucement des parois du tube de centrifugation avec un policier propre. Centrifuger à 3 500 × g pendant 10 min.
11. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille mitochondriale dans un tampon de remise en suspension en travaillant doucement la pastille mitochondriale sur les parois du tube à centrifuger avec un policier propre.
    REMARQUE : Le volume du tampon de remise en suspension dépendra de la taille de la pastille de mitochondries.
12. Transférez les mitochondries remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce à l’aide d’un embout de pipette coupé de 1 mL. À l’aide de l’homogénéisateur Dounce, homogénéisez soigneusement la suspension en 4 à 5 passages.
13. Placer la suspension mitochondriale dans un tube de microcentrifugation étiqueté de 2 mL à l’aide d’un autre embout de pipette coupé de 1 mL.

3. Mesures de la respiration mitochondriale (Figure 3)

1. Substrats complexes I
   1. Ajouter 945 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.
   2. Une fois que la concentration d’oxygène s’est stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la chambre.
   3. Ajouter 10 μL de glutamate 1 M, 10 μL de malate 200 mM et 10 μL de pyruvate 200 mM dans la chambre avec des seringues individuelles et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés.
      REMARQUE : Ces substrats sont généralement utilisés pour mesurer la respiration induite par les glucides. Pour d’autres combinaisons de substrats à utiliser pour mesurer la respiration induite par les graisses, voir²¹.
   4. Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté.
      REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4.
   5. Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.
2. Substrats complexes II
   1. Ajouter 963 μL de tampon respiratoire dans la chambre. Assurez-vous que l’agitateur tourne et que la température tampon est maintenue à 37 °C. Lancez l’enregistrement de la collecte de données.
   2. Une fois la concentration d’oxygène stabilisée, ajoutez 20 μL de mitochondries et placez le couvercle sur la chambre. Dans le logiciel, indiquez que des mitochondries ont été ajoutées à la solution.
   3. Ajouter 2 μL de roténone à 4 μg/μL puis 10 μL de succinate à 500 mM dans la chambre à l’aide de seringues séparées et attendre que le signal se stabilise. Dans le logiciel, indiquez que des substrats ont été ajoutés.
   4. Ajouter 5 μL d’ADP à l’aide d’une seringue séparée et observer la consommation rapide d’oxygène (état 3). Dans le logiciel, indiquez qu’ADP a été ajouté.
      REMARQUE : Après la phosphorylation de l’ADP ajouté, le taux de consommation d’oxygène plafonnera à l’état 4.
   5. Après 4 min de collecte des données de l’état 4, terminez l’enregistrement. Enregistrez le fichier de données.

Résultats

Le présent manuscrit a étudié la respiration mitochondriale de Mus musculus d’origine sauvage (n = 7, mâle = 5, femelle = 2 ; âge = 1,30 ± 0,2 ans) dans un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale (Figure 1). Pour mesurer la respiration mitochondriale des muscles squelettiques, l’ensemble du membre postérieur, donc les muscles aérobies et anaérobies, a été utilisé pour l’isolement mitochondrial (Figure 2). Des exemples de donn?...

Discussion

Le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale permet aux chercheurs d’isoler les mitochondries et de mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales dans les 2 heures suivant le prélèvement de tissus sur des sites de terrain éloignés. Les résultats présentés ici suggèrent que les mesures de la respiration mitochondriale effectuées dans l’UA MitoMobile sont comparables aux mesures effectuées dans un laboratoire de recherche universitaire. Plus précisément, les valeurs pour l’état 3, l’éta...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	VWR	87003-294
2.0 mL centrifuge tubes	VWR	87003-298
50 mL centrifuge tubes	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
Clear 96 well plate	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounce homogenizer	VWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
Filter paper			Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
Glutamate	VWR	A12919
Hamilton Syringes	VWR	60373-985	Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph	Hansatech Instruments Ltd		No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4	VWR	97062-350
Malate	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
Membrane			Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
Potassium chloride (KCl)	VWR	97061-566
Protease	VWR	97062-366	Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid	VWR	97061-448
Sodium Dithionite	VWR	AA33381-22
Succinate	VWR	89230-086
Sucrose	VWR	BDH0308-500G
Tris-Base	VWR	97061-794
Tris-HCl	VWR	97061-258