JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.

Özet

Mitokondriyal enerji, hayvan biyokimyası ve fizyolojisinde merkezi bir temadır ve araştırmacılar metabolik kapasiteyi araştırmak için mitokondriyal solunumu bir metrik olarak kullanırlar. Mitokondriyal solunum önlemlerini elde etmek için taze biyolojik numuneler kullanılmalı ve tüm laboratuvar prosedürü yaklaşık 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Ayrıca, bu laboratuvar tahlillerini gerçekleştirmek için çok sayıda özel ekipman gereklidir. Bu, fizyoloji laboratuvarlarından uzakta yaşayan vahşi hayvanların dokularında mitokondriyal solunumun ölçülmesi için bir zorluk yaratır, çünkü canlı doku sahada toplandıktan sonra çok uzun süre korunamaz. Ayrıca, canlı hayvanların uzun mesafelerde taşınması, mitokondriyal enerjileri değiştirebilen strese neden olur.

Bu el yazması, sahaya götürülebilen ve vahşi hayvanlardan toplanan dokulardaki mitokondriyal metabolizmayı ölçmek için yerinde kullanılabilen mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı olan Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile'ı tanıtmaktadır. Mobil laboratuvarın temel özellikleri ve izole mitokondriyal solunum hızlarını ölçmek için adım adım yöntemler sunulmaktadır. Ek olarak, sunulan veriler, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarının donatılmasının ve mitokondriyal solunum ölçümlerinin yapılmasının başarısını doğrulamaktadır. Mobil laboratuvarın yeniliği, sahaya gitme ve sahada yakalanan hayvanların dokuları üzerinde mitokondriyal ölçümler yapma yeteneğinde yatmaktadır.

Giriş

Bugüne kadar, mitokondriyal enerjileri ölçmek için tasarlanan çalışmalar, bilim adamlarının göç, dalış ve kış uykusu gibi faaliyetler sırasında hayvanlardan toplanan dokularda mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalar yapmasını engelleyen laboratuvar hayvanları veya yerleşik fizyoloji laboratuvarlarının yakınında yakalanan hayvanlarla sınırlıydı 1,2,3,4,5,6 . Birçok araştırmacı yabani hayvanların bazal ve pik metabolizma hızlarını ve günlük enerji harcamalarını başarılı bir şekilde ölçmüşolsa da 7,8, araştırmacıların mitokondri performansını ölçme kapasitesi sınırlı kalmıştır (ancak bkz. 1,4,9). Bu kısmen, mitokondriyi izole etmek için taze dokuya ve taze dokuyu elde ettikten yaklaşık 2 saat sonra izolasyonları gerçekleştirmek için bir laboratuvar tesisine ihtiyaç duyulmasından kaynaklanmaktadır. Mitokondri izole edildikten sonra, mitokondriyal solunum ölçümleri de ~ 1 saat içinde tamamlanmalıdır.

İzole mitokondriyal solunum hızları genellikle bir Clark elektroduna bağlı kapalı bir kapta oksijen konsantrasyonunun ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Bu yöntemin arkasındaki teori, oksidatif fosforilasyon sırasında oksijenin mitokondriyal solunumun son elektron alıcısı olduğu temel gözlemine dayanmaktadır. Bu nedenle, bir deney sırasında oksijen konsantrasyonu düştüğünde, adenozin trifosfat (ATP) üretiminin gerçekleştiği varsayılmaktadır10. Tüketilen oksijen, üretilen ATP için bir vekildir. Araştırmacılar, farklı substratlar kullanarak spesifik deneysel koşullar oluşturabilir ve odaya önceden belirlenmiş miktarlarda ADP ekleyerek adenozin difosfat (ADP) ile uyarılan solunumu (durum 3) başlatabilir. Eksojen ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı azalır ve durum 4'e ulaşılır ve ölçülebilir. Ayrıca, spesifik inhibitörlerin eklenmesi, kaçak solunum ve bağlanmamış solunum ile ilgili bilgilerin elde edilmesini sağlar10. Durum 3'ün durum 4'e oranı, genel mitokondriyal eşleşmenin göstergesi olan solunum kontrol oranını (RCR)belirler 10,11. Daha düşük RCR değerleri genel mitokondriyal disfonksiyonu gösterirken, daha yüksek RCR değerleri daha büyük ölçüde mitokondriyal eşleşme10 olduğunu göstermektedir.

Daha önce belirtildiği gibi, biyolojik materyalin toplanması, mitokondriyal izolasyon ve solunum hızlarının ölçümü, doku elde edildikten sonraki 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Hayvanları uzun mesafelerde kurulu laboratuvarlara taşımadan bu görevi yerine getirmek için, bu verilerin toplanabileceği saha konumlarına götürülmek üzere mobil bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı inşa edildi. 2018 Jayco Redhawk eğlence aracı, mobil bir moleküler fizyoloji laboratuvarına dönüştürüldü ve Auburn Üniversitesi (AU) MitoMobile olarak adlandırıldı (Şekil 1A). Ankastre buzdolabı, derin dondurucu, su depolama tankı ve sıhhi tesisat, 12 voltluk pillerle çalışan elektrik, gaz jeneratörü, propan tankı ve otomatik tesviye sistemi nedeniyle bir eğlence aracı seçildi. Ayrıca, eğlence aracı, veri toplama için gece boyunca uzak sitelerde kalma yeteneği sağlar. Aracın ön kısmı değiştirilmemiştir ve sürüş ve uyku alanlarını sağlar (Şekil 1B). Aracın arkasına ve set üstü ocakta daha önce kurulmuş yatak odası olanakları (yatak, TV ve dolap) kaldırıldı.

Yatak odası malzemeleri ve set üstü ocak yerine özel yapım paslanmaz çelik raflar ve 80/20 alüminyum çerçeve ile desteklenen özel bir kuvars tezgah yerleştirildi (Şekil 1C). Laboratuvar tezgahları veri toplama için yeterli alan sağlar (Şekil 1D). Her bir ekipmanın (yani soğutmalı santrifüj, mitokondriyal solunum odaları, plaka okuyucular, bilgisayarlar, homojenizatörler, teraziler, taşınabilir ultra dondurucu ve diğer genel laboratuvar malzemeleri) güç tüketimi dikkate alınmıştır. Santrifüjün büyük voltaj ve akım taleplerini desteklemek için, elektrik sistemi uçak sınıfı ekipmanınkine yükseltildi. Aracın arkasındaki harici bir bölme, Amerika Birleşik Devletleri Ulaştırma Bakanlığı'nın sıvı nitrojen depolama ve taşıma yönergelerini karşılayan bir sıvı nitrojen depolama bölmesine dönüştürüldü. Bu depolama ünitesi paslanmaz çelikten yapılmıştır ve genişleyen nitrojen gazının aracın yolcu bölmesine sızmasını önlemek için uygun havalandırmaya sahiptir.

Mobil laboratuvarın mitokondriyal biyoenerjetik çalışmalarda kullanılabileceğini doğrulamak için mitokondri izole edildi ve yabani kaynaklı ev farelerinden (Mus musculus) arka bacak iskelet kasından mitokondriyal solunum hızları ölçüldü. Mus musculus model bir organizma olduğu için bu türün mitokondriyal solunum hızları iyi bilinmektedir12,13,14. Önceki çalışmalarda diferansiyel santrifüjleme yoluyla mitokondriyal izolasyonbelgelenmiş olsa da 15,16,17, mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvar yöntemlerinde kullanılan yöntemlere kısa bir genel bakış aşağıda açıklanmıştır.

Protokol

Aşağıdaki bölümlerde mitokondriyal laboratuvar yöntemleri açıklanmaktadır. Tüm hayvan taşıma ve doku toplama prosedürleri Auburn Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#2019-3582) tarafından onaylanmıştır.

1. Veri toplama için kullanılan tamponların açıklaması

NOT: Bu tamponlar sabit bir laboratuvarda hazırlanabilir ve saha gezisinden önce mobil laboratuvara taşınabilir (aşağıda aksi belirtilmedikçe).

  1. İskelet kası mitokondriyal izolasyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi sığır serum albümini (BSA) ile hazırlayın.
    1. Yağ asidi içermeyen BSA hariç kimyasalları deiyonize suda (~% 90 hacim) çözün. Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
    2. Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,5 pH'a ayarlayın.
    3. Yağ asidi içermeyen BSA'yı ekleyin ve hacmi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  2. İskelet kası mitokondriyal izolasyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi BSA olmadan hazırlayın.
    1. Kimyasalları deiyonize suda çözün (~% 90 hacim). Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
    2. Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,5 pH'a ayarlayın.
    3. Sesi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  3. İskelet kası resüspansiyon tamponunu Tablo 1'de görüldüğü gibi hazırlayın.
    1. Kimyasalları deiyonize suda çözün (~% 90 hacim). Tamponu sıcaklık 4 °C olana kadar buzdolabına koyun.
    2. Sıcaklığı 4 °C'de tutarken çözeltiyi 7,4 pH'a ayarlayın.
    3. Sesi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  4. İskelet kası solunum tamponunu Tablo 2'de görüldüğü gibi hazırlayın.
    1. Yağ asidi içermeyen BSA hariç kimyasalları deiyonize suda (~% 90 hacim) çözün. Tamponu sıcaklık 37 °C olana kadar ısıtın.
    2. Sıcaklığı 37 °C'de tutarken çözeltiyi 7.0 pH'a ayarlayın.
    3. Yağ asidi içermeyen BSA'yı ekleyin ve hacmi %100'e getirin. Çözeltiyi 50 mL'lik konik tüplere ayırın. Bu çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  5. Solunum substratlarını Tablo 2'de görüldüğü gibi hazırlayın.
    1. Bu substratların veri toplama gününde 100 mM Tris-HCl, pH 7.4'te taze yapıldığından emin olun. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
      NOT: Sağlanan değerler, mitokondri tarafından alınacak yeterli substrat için yeterince konsantre bir çözelti yapmak içindir. Substratların nihai konsantrasyonları 2 mM piruvat, 2 mM malat, 10 mM glutamat ve 5 mM süksinattır.

2. Mitokondriyal izolasyonun gerçekleştirilmesi (Şekil 2)

NOT: Mitokondriyal izolasyon ve mitokondriyal solunum ölçümleri mobil laboratuvarın laboratuvar tezgah alanında yapılmakta olup, aksi belirtilmedikçe tüm solüsyonlar 4 °C'de tutulmalıdır.

  1. Mobil laboratuvarı düz bir zemine park edin. Jeneratörü çalıştırın ve aracı düzleştirin. Slaydı uzatın ve ekipmanı kurun.
  2. İstenilen miktarda tamponu çözün.
    NOT: Genel olarak, kas başına 30 mL iskelet kası izolasyon tamponu ve BSA'sız 10 mL iskelet kası izolasyon tamponu gereklidir.
  3. Mitokondriyal solunum odalarını, üreticinin talimatlarına göre istenen deney sıcaklığına ve mevcut barometrik basınca ayarlayın ve kalibre edin. Deneylerde kullanılan belirli odalar için Malzeme Tablosuna bakın.
  4. Hayvanı dekapitasyon yoluyla ötenazi yapın.
    NOT: Bu çalışmada ötenazi için dekapitasyon kullanılmıştır. Karbondioksit ve izofluran gibi bazı gazlar mitokondriyal fonksiyonuetkiler 18,19,20; Her çalışma için en iyi ötenazi yöntemini seçerken bu etkiler göz önünde bulundurulmalıdır. Her çalışma için hangi yöntemin uygulanması gerektiği, sorulan bilimsel soruya göre belirlenecektir.
  5. İskelet kasını çıkarın, yağ ve bağ dokusunu hızla kesin, tartın ve kası BSA ile iskelet kası izolasyon tamponuna yerleştirin (en az 1/10 w / v) (örneğin, 1 g iskelet kası ila 10 mL tampon).
  6. İskelet kasını buz üzerinde makasla kıyın.
  7. Kıyılmış dokuyu 5 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 saniye boyunca %50 güçte bir bıçakla ( Malzeme Tablosuna bakın) homojenize edin. Proteaz (5 mg/g ıslak kas) ekleyin ve çözeltiyi her 30 saniyede bir karıştırarak 7 dakika sindirin. BSA ile eşit hacimde izolasyon tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
  8. Homojenatı 500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, kesilmiş 5 mL'lik bir pipet ucu kullanarak çift katmanlı tülbentten temiz bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın. Kahverengi bir mitokondriyal peleti çökeltmek için süpernatanı 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  9. Kalan süpernatanı dökün. Santrifüj tüpüne BSA ile aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin. Mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti esnek bir kazıyıcı (polis) ile yeniden süspanse edin. 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  10. Kalan süpernatanı dökün. Santrifüj tüpüne BSA'sız aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin. Mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından temiz bir polisle nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti yeniden süspanse edin. 3.500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı boşaltın ve mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından temiz bir polisle nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
    NOT: Yeniden süspansiyon tamponunun hacmi, mitokondri peletinin boyutuna bağlı olacaktır.
  12. Yeniden süspanse edilmiş mitokondriyi, 1 mL'lik kesilmiş pipet ucuyla bir Dounce homojenizatöre aktarın. Dounce homojenizatörü kullanarak süspansiyonu 4-5 geçişle dikkatlice homojenize edin.
  13. Mitokondriyal süspansiyonu, başka bir kesilmiş 2 mL pipet ucu kullanarak etiketli 1 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

3. Mitokondriyal solunum ölçümleri (Şekil 3)

  1. Kompleks I substratları
    1. Hazneye 945 μL solunum tamponu ekleyin. Karıştırıcının döndüğünden ve tampon sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olun. Veri toplama kaydını başlatın.
    2. Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, 20 μL mitokondri ekleyin ve kapağı hazneye yerleştirin. Yazılımda, odaya mitokondri eklendiğini belirtin.
    3. Ayrı şırıngalarla hazneye 10 μL 1 M glutamat, 10 μL 200 mM malat ve 10 μL 200 mM piruvat ekleyin ve sinyal stabilize olana kadar bekleyin. Yazılımda, alt tabakaların eklendiğini belirtin.
      NOT: Bu substratlar tipik olarak karbonhidrat kaynaklı solunumu ölçmek için kullanılır. Yağ kaynaklı solunumu ölçmek için kullanılacak diğer substrat kombinasyonları için bkz.21.
    4. Ayrı bir şırınga ile 5 μL ADP ekleyin ve hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin (durum 3). Yazılımda, ADP'nin eklendiğini belirtin.
      NOT: Eklenen ADP'nin fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı 4 durumuna sabit kalacaktır.
    5. 4 dakikalık durum 4 veri toplama işleminden sonra kaydı sonlandırın. Veri dosyasını kaydedin.
  2. Kompleks II yüzeyler
    1. Odaya 963 μL solunum tamponu ekleyin. Karıştırıcının döndüğünden ve tampon sıcaklığının 37 °C'de tutulduğundan emin olun. Veri toplama kaydını başlatın.
    2. Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, 20 μL mitokondri ekleyin ve kapağı hazneye yerleştirin. Yazılımda, çözeltiye mitokondri eklendiğini belirtin.
    3. Ayrı şırıngalar kullanarak hazneye 2 μL 4 μg/μL rotenon ve ardından 10 μL 500 mM süksinat ekleyin ve sinyal stabilize olana kadar bekleyin. Yazılımda, alt tabakaların eklendiğini belirtin.
    4. Ayrı bir şırınga kullanarak 5 μL ADP ekleyin ve hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin (durum 3). Yazılımda, ADP'nin eklendiğini belirtin.
      NOT: Eklenen ADP'nin fosforilasyonunu takiben, oksijen tüketim oranı 4 durumuna sabit kalacaktır.
    5. 4 dakikalık durum 4 veri toplama işleminden sonra kaydı sonlandırın. Veri dosyasını kaydedin.

Sonuçlar

Bu makale, gezici bir mitokondriyal fizyoloji laboratuvarında yabani kaynaklı Mus musculus'un (n = 7, erkek = 5, kadın = 2; yaş = 1.30 ± 0.2 yıl) mitokondriyal solunumunu araştırdı (Şekil 1). İskelet kası mitokondriyal solunumunu ölçmek için mitokondriyal izolasyon için tüm arka bacak, dolayısıyla aerobik ve anaerobik kas kullanıldı (Şekil 2). Ham mitokondriyal solunum verilerinin örnekleri Şekil 3'te

Tartışmalar

Mobil mitokondriyal fizyoloji laboratuvarı, araştırmacıların mitokondriyi izole etmelerini ve uzak saha sahalarında doku toplandıktan sonraki 2 saat içinde mitokondriyal solunum hızlarını ölçmelerini sağlar. Burada sunulan sonuçlar, AU MitoMobile'da yapılan mitokondriyal solunum ölçümlerinin bir üniversite araştırma laboratuvarında yapılan ölçümlerle karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Spesifik olarak, burada sunulan yabani kaynaklı Mus musculus için durum 3, durum 4 ...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Auburn Üniversitesi Samuel Ginn Mühendislik Fakültesi Elektrik ve Bilgisayar Mühendisliği bölümünden Mark Nelms ve John Tennant'a AU MitoMobile'ın yapısal ve elektrik donanımına yardımcı oldukları için teşekkür ediyor. Ek olarak, yazarlar AU MitoMobile'ı donatmak için fon sağladığını ve Auburn Üniversitesi Başkanlık Disiplinlerarası Araştırma Ödülleri (PAIR) hibesinden araştırma yaptığını kabul ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL centrifuge tubesVWR87003-294
2.0 mL centrifuge tubesVWR87003-298
50 mL centrifuge tubesVWR21009-681Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
Clear 96 well plateVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce homogenizerVWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
Filter paperIncluded with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSAVWR89423-672
GlucoseVWRBDH8005-500G
GlutamateVWRA12919
Hamilton SyringesVWR60373-985Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments LtdNo Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4VWR97062-350
MalateVWR97062-140
MannitolVWR97061-052
MembraneIncluded with Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicemanVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
Potassium chloride (KCl)VWR97061-566
ProteaseVWR97062-366Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acidVWR97061-448
Sodium DithioniteVWRAA33381-22
SuccinateVWR89230-086
SucroseVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258

Referanslar

  1. Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
  2. Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
  3. Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
  4. Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
  5. Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
  6. Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
  7. Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
  8. Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
  9. Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
  10. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  12. Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
  13. Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
  14. Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
  16. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
  17. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
  18. Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
  19. Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
  20. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
  21. Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
  24. Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  26. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
  27. Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
  28. Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
  29. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  30. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
  31. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
  32. Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
  33. Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
  34. Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Mobil Mitokondriyal Fizyoloji LaboratuvarMitokondriyal Enerjinin l lmesiMitokondriyal SolunumMetabolik YetenekBiyolojik rneklerLaboratuvar Prosed rzel EkipmanYabani HayvanlarCanl Doku KorumaStres Kaynakl De i iklikAuburn niversitesi MitoMobileMobil Mitokondriyal Fizyoloji LaboratuvarYerinde l mzole Mitokondriyal Solunum H zlarVeri Do rulamaMobil Laboratuvar Yenili iSaha Ara t rmas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır