פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום

Summary

תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.

Abstract

אנרגיה מיטוכונדריאלית היא נושא מרכזי בביוכימיה ובפיזיולוגיה של בעלי חיים, כאשר חוקרים משתמשים בנשימה מיטוכונדריאלית כמדד לחקר היכולת המטבולית. כדי להשיג את המדדים של נשימה מיטוכונדריאלית, יש להשתמש בדגימות ביולוגיות טריות, ויש להשלים את כל הליך המעבדה תוך כשעתיים. יתר על כן, חלקים מרובים של ציוד מיוחד נדרשים לבצע בדיקות מעבדה אלה. הדבר יוצר אתגר למדידת נשימה מיטוכונדריאלית ברקמות של חיות בר החיות הרחק ממעבדות פיזיולוגיות, שכן רקמות חיות אינן יכולות להישמר זמן רב לאחר האיסוף בשטח. יתר על כן, הובלת בעלי חיים למרחקים ארוכים גורמת ללחץ, אשר יכול לשנות את האנרגיה המיטוכונדריאלית.

כתב יד זה מציג את MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU), מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שניתן לקחת לשטח ולהשתמש בה באתר כדי למדוד את חילוף החומרים במיטוכונדריה ברקמות שנאספו מחיות בר. התכונות הבסיסיות של המעבדה הניידת והשיטות שלב אחר שלב למדידת שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מבודדים מוצגים. בנוסף, הנתונים שהוצגו מאמתים את ההצלחה של התאמת המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביצוע מדידות נשימה מיטוכונדריאלית. החידוש של המעבדה הניידת טמון ביכולת לנסוע לשדה ולבצע מדידות מיטוכונדריאליות על רקמות של בעלי חיים שנלכדו באתר.

Introduction

עד כה, מחקרים שנועדו למדוד אנרגיה מיטוכונדריאלית הוגבלו לחיות מעבדה או לבעלי חיים שנלכדו ליד מעבדות פיזיולוגיות מבוססות, מה שמנע ממדענים לבצע מחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים ברקמות שנאספו מבעלי חיים במהלך פעילויות כגון נדידה, צלילה ותרדמת חורף 1,2,3,4,5,6 . בעוד שחוקרים רבים מדדו בהצלחה את קצב חילוף החומרים הבסיסי והשיא ואת הוצאות האנרגיה היומיות של חיות בר^7,8, יכולתם של החוקרים למדוד את ביצועי המיטוכונדריה נותרה מוגבלת (אך ראו 1,4,9). זאת, בין היתר, בשל הצורך ברקמה טרייה לבידוד מיטוכונדריה ובמתקן מעבדה לביצוע הבידודים בתוך כשעתיים מקבלת הרקמה הטרייה. לאחר בידוד המיטוכונדריה, יש להשלים גם את מדידות הנשימה המיטוכונדריאלית תוך ~1 שעות.

קצבי נשימה מיטוכונדריאליים מבודדים מבוצעים בדרך כלל על ידי מדידת ריכוז החמצן במיכל אטום המחובר לאלקטרודת קלארק. התיאוריה מאחורי שיטה זו מבוססת על התצפית הבסיסית כי חמצן הוא מקבל האלקטרונים האחרון של נשימה מיטוכונדריאלית במהלך זרחן חמצוני. לכן, כאשר ריכוז החמצן יורד במהלך ניסוי, ההנחה היא כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) מתרחש¹⁰. חמצן נצרך הוא פרוקסי עבור ATP המיוצר. חוקרים יכולים ליצור תנאי ניסוי ספציפיים באמצעות מצעים שונים וליזום נשימה מגורה אדנוזין דיפוספט (ADP) (מצב 3) על ידי הוספת כמויות קבועות מראש של ADP לחדר. בעקבות הזרחן של ADP אקסוגני ל-ATP, קצב צריכת החמצן יורד, ומגיעים למצב 4 וניתן למדוד אותו. יתר על כן, הוספת מעכבים ספציפיים מאפשרת לקבל מידע לגבי נשימה דולפת ונשימה לא מצומדת¹⁰. היחס בין מצב 3 למצב 4 קובע את יחס בקרת הנשימה (RCR), שהוא האינדיקטור לצימוד מיטוכונדריאלי כולל^10,11. ערכים נמוכים יותר של RCR מצביעים על תפקוד לקוי כללי של המיטוכונדריה, בעוד שערכי RCR גבוהים יותר מצביעים על מידה רבה יותר של צימוד מיטוכונדריאלי¹⁰.

כאמור, איסוף החומר הביולוגי, בידוד המיטוכונדריה ומדידת קצב הנשימה חייבים להסתיים תוך שעתיים מקבלת הרקמה. כדי לבצע משימה זו מבלי להעביר בעלי חיים למרחקים גדולים למעבדות מבוססות, נבנתה מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שתילקח לאתרי שדה שבהם ניתן לאסוף נתונים אלה. רכב פנאי של ג'ייקו רדהוק משנת 2018 הוסב למעבדה ניידת לפיזיולוגיה מולקולרית ונקרא MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU) (איור 1A). רכב פנאי נבחר בגלל המקרר המובנה, המקפיא, מיכל אגירת המים והצנרת, חשמל המופעל על ידי סוללות 12 וולט, גנרטור גז, מיכל פרופאן ומערכת פילוס עצמי. יתר על כן, רכב הפנאי מספק את היכולת לשהות באתרים מרוחקים למשך הלילה לצורך איסוף נתונים. חזית הרכב לא שונתה והיא מספקת את מגורי הנסיעה והשינה (איור 1B). אביזרי חדר השינה שהותקנו בעבר (מיטה, טלוויזיה וארון) בחלק האחורי של הרכב והכיריים הוסרו.

מדפי נירוסטה בהתאמה אישית ומשטח קוורץ בהתאמה אישית הנתמך על ידי מסגרת אלומיניום 80/20 הותקנו במקום אביזרי השינה והכיריים (איור 1C). ספסלי המעבדה מספקים מספיק מקום לאיסוף נתונים (איור 1D). צריכת החשמל של כל פריט ציוד (כלומר, צנטריפוגות קירור, תאי נשימה מיטוכונדריאליים, קוראי צלחות, מחשבים, הומוגנייזרים, מאזניים, אולטרה-מקפיא נייד וציוד מעבדה כללי אחר) נלקחה בחשבון. כדי לתמוך בדרישות המתח והזרם הגדולות של הצנטריפוגה, שודרגה מערכת החשמל לזו של ציוד ברמת מטוסים. תא חיצוני בחלקו האחורי של הרכב הוסב למפרץ אחסון חנקן נוזלי, העומד בהנחיות משרד התחבורה האמריקאי לאחסון ושינוע חנקן נוזלי. יחידת אחסון זו נבנתה מפלדת אל-חלד ויש לה אוורור מתאים כדי למנוע דליפת גז חנקן מתפשט לתא הנוסעים ברכב.

כדי לאשר שהמעבדה הניידת יכולה לשמש במחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים, בודדו מיטוכונדריה, ונמדדו שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מעכברי בית פראיים (Mus musculus) שרירי השלד האחוריים. מכיוון ששריר Mus הוא אורגניזם מודל, שיעורי הנשימה המיטוכונדריאלית של מין זה מבוססים היטב^12,13,14. למרות שמחקרים קודמים תיעדו בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית^15,16,17, סקירה קצרה של השיטות המשמשות בשיטות המעבדה הניידות לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית מתוארת להלן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הסעיפים הבאים מתארים את שיטות המעבדה במיטוכונדריה. כל נהלי הטיפול בבעלי חיים ואיסוף רקמות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אובורן (#2019-3582).

1. תיאור המאגרים המשמשים לאיסוף נתונים

הערה: ניתן להכין מאגרים אלה במעבדה נייחת ולהעבירם למעבדה הניידת לפני הנסיעה בשטח (אלא אם צוין אחרת להלן).

1. הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד עם אלבומין בסרום בקר (BSA), כפי שניתן לראות בטבלה 1.
   1. ממיסים כימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
   2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
   3. הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
2. הכינו את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי של שרירי השלד ללא BSA כפי שניתן לראות בטבלה 1.
   1. להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
   2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.5 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
   3. העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
3. הכינו את חיץ מתלה שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 1.
   1. להמיס את הכימיקלים במים נטולי יונים, (~ 90% נפח). הכניסו את החיץ למקרר עד שהטמפרטורה היא 4°C.
   2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.4 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 4 ° C.
   3. העלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
4. הכינו את חיץ הנשימה של שרירי השלד כפי שניתן לראות בטבלה 2.
   1. ממיסים את הכימיקלים במים שעברו דה-יוניזציה (~ 90% נפח) למעט BSA נטול חומצות שומן. מחממים את החיץ עד לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   2. התאם את התמיסה ל- pH של 7.0 תוך שמירה על הטמפרטורה ב- 37 ° C.
   3. הוסיפו את ה-BSA נטול חומצות השומן והעלו את עוצמת הקול ל-100%. Aliquot את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטיים. אחסנו תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
5. הכינו את מצעי הנשימה כפי שניתן לראות בטבלה 2.
   1. ודא כי מצעים אלה נעשים טריים ביום איסוף הנתונים ב 100 mM Tris-HCl, pH 7.4. יש לאחסן על קרח עד לשימוש.
      הערה: הערכים שסופקו הם ליצור תמיסה מרוכזת מספיק כדי שהמצע ייקלט מספיק על ידי המיטוכונדריה. הריכוזים הסופיים של המצע הם 2 מ"מ פירובט, 2 מ"מ מלאט, 10 מ"מ גלוטמט ו-5 מ"מ סוקצינאט.

2. ביצוע בידוד מיטוכונדריאלי (איור 2)

הערה: בידוד מיטוכונדריאלי ומדידות נשימה מיטוכונדריאלית מבוצעים באזור ספסל המעבדה של המעבדה הניידת, וכל התמיסות צריכות להישמר בטמפרטורה של 4°C אלא אם כן צוין אחרת.

1. להחנות את המעבדה הניידת על קרקע שטוחה. הפעל את הגנרטור ויישר את הרכב. הרחב את השקופית והגדר את הציוד.
2. הפשירו את כמויות המאגרים הרצויות.
   הערה: באופן כללי, 30 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ו -10 מ"ל של חיץ בידוד שרירי השלד ללא BSA נדרשים לכל שריר.
3. הגדר וכייל את תאי הנשימה המיטוכונדריאליים לטמפרטורה הרצויה של הניסויים וללחץ הברומטרי הנוכחי בהתאם להוראות היצרן. ראה טבלת החומרים עבור תאים ספציפיים המשמשים בניסויים.
4. הרדימו את בעל החיים באמצעות עריפת ראש.
   הערה: המחקר הנוכחי השתמש בעריפת ראש לצורך המתת חסד. גזים מסוימים, כגון פחמן דו חמצני ואיזופלורן, משפיעים על תפקוד המיטוכונדריה^18,19,20; השפעות אלה יש לשקול בעת בחירת השיטה הטובה ביותר של המתת חסד עבור כל מחקר. השיטה שיש לבצע עבור כל מחקר תיקבע על פי השאלה המדעית שתישאל.
5. הבלו על שרירי השלד, חותכים במהירות שומן ורקמת חיבור, שוקלים ומניחים את השריר במאגר בידוד שרירי השלד עם BSA (לפחות 1/10 w/v) (למשל, 1 גרם שריר השלד עד 10 מ"ל חיץ).
6. טוחנים את שריר השלד עם מספריים על קרח.
7. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות קצה צינור חתוך של 5 מ"ל. הומוגניזציה עם להב (ראה טבלת החומרים) בהספק של 50% למשך 5 שניות. מוסיפים פרוטאז (5 מ"ג/גרם שריר רטוב) ומעכלים במשך 7 דקות, מערבבים את התמיסה כל 30 שניות. סיים את התגובה על-ידי הוספת נפח שווה של מאגר בידוד עם BSA.
8. צנטריפוגה הומוגנט ב 500 × גרם במשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט דרך בד גבינה דו-שכבתי באמצעות קצה פיפט חתוך של 5 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 3,500 × גרם במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה מיטוכונדריאלית חומה.
9. יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד עם BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית עם מגרד גמיש (שוטר) על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
10. יוצקים החוצה את שארית הסופרנאטנט. הוסף את אותו נפח של חיץ בידוד ללא BSA לצינור הצנטריפוגה. השהה מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית על ידי עבודה עדינה של גלולת המיטוכונדריה מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 דקות.
11. דקרו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית בחיץ מתלה על ידי עבודה עדינה של הגלולה המיטוכונדריאלית מדפנות צינור הצנטריפוגה עם שוטר נקי.
    הערה: נפח חיץ המתלים יהיה תלוי בגודל כדורית המיטוכונדריה.
12. מעבירים את המיטוכונדריה המרחפים להומוגנייזר Dounce עם קצה פיפט חתוך של 1 מ"ל. באמצעות הומוגנייזר Dounce, בזהירות הומוגניזציה של המתלים עם 4-5 מעברים.
13. הניחו את המתלה המיטוכונדריאלי בצינור מיקרוצנטריפוגה מסומן בנפח 2 מ"ל באמצעות קצה צינור 1 מ"ל חתוך נוסף.

3. מדידות נשימה מיטוכונדריאלית (איור 3)

1. קומפלקס I מצעים
   1. הוסף 945 μL של חיץ נשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
   2. לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר של המיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לחדר.
   3. הוסף 10 μL של 1 M גלוטמט, 10 μL של 200 mM malate, ו 10 μL של 200 mM pyruvate לתא עם מזרקים בודדים ולחכות עד האות מתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
      הערה: מצעים אלה משמשים בדרך כלל למדידת נשימה מונעת פחמימות. לשילובים אחרים של מצעים שישמשו למדידת נשימה מונעת שומן, ראו²¹.
   4. הוסף 5 μL של ADP עם מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
      הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4.
   5. לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.
2. מצעים מורכבים II
   1. הוסף 963 μL של חיץ הנשימה לחדר. ודא שהמערבל מסתובב, ושטמפרטורת החיץ נשמרת על 37°C. התחל את ההקלטה של איסוף הנתונים.
   2. לאחר שריכוז החמצן התייצב, הוסיפו 20 מיקרוליטר מיטוכונדריה והניחו את המכסה על החדר. בתוכנה, לציין כי מיטוכונדריה נוספו לתמיסה.
   3. הוסף 2 μL של 4 מיקרוגרם / μL רוטנון ואחריו 10 μL של 500 mM succinate לתא באמצעות מזרקים נפרדים והמתן עד שהאות יתייצב. בתוכנה, ציין כי נוספו מצעים.
   4. הוסף 5 μL של ADP באמצעות מזרק נפרד ולבחון את צריכת החמצן המהירה (מצב 3). בתוכנה, ציין כי ADP נוסף.
      הערה: בעקבות הזרחן של ADP נוסף, קצב צריכת החמצן יהיה מישורי למצב 4.
   5. לאחר 4 דקות של איסוף נתונים במצב 4, סיים את ההקלטה. שמור את קובץ הנתונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כתב היד הנוכחי חקר את הנשימה המיטוכונדריאלית של Mus musculus שמקורו בטבע (n = 7, זכר = 5, נקבה = 2; גיל = 1.30 ± 0.2 שנים) במעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית (איור 1). כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית של שרירי השלד, כל הגפה האחורית, כלומר שריר אירובי ואנאירובי, שימשה לבידוד מיטוכונדר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המעבדה הניידת לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מאפשרת לחוקרים לבודד מיטוכונדריה ולמדוד את קצב הנשימה המיטוכונדריאלית תוך שעתיים מאיסוף הרקמה באתרי שדה מרוחקים. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שמדידות של נשימה מיטוכונדריאלית שנעשו ב- AU MitoMobile דומות למדידות שנעשו במעבדת מחקר באוניברסיטה. בא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL centrifuge tubes	VWR	87003-294
2.0 mL centrifuge tubes	VWR	87003-298
50 mL centrifuge tubes	VWR	21009-681	Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP	VWR	97061-104
ATP	VWR	700009-070
Bradford	VWR	7065-020
Clear 96 well plate	VWR	82050-760	Greiner Bio-One
Dounce homogenizer	VWR	22877-284	Corning
EGTA	VWR	EM-4100
Filter paper			Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA	VWR	89423-672
Glucose	VWR	BDH8005-500G
Glutamate	VWR	A12919
Hamilton Syringes	VWR	60373-985	Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph	Hansatech Instruments Ltd		No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4	VWR	97062-350
Malate	VWR	97062-140
Mannitol	VWR	97061-052
Membrane			Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2	VWR	97063-152
MOPS	VWR	80503-004
Policeman	VWR	470104-462
Polytron	Thomas Scientific	11090044
Potassium chloride (KCl)	VWR	97061-566
Protease	VWR	97062-366	Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid	VWR	97061-448
Sodium Dithionite	VWR	AA33381-22
Succinate	VWR	89230-086
Sucrose	VWR	BDH0308-500G
Tris-Base	VWR	97061-794
Tris-HCl	VWR	97061-258