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요약

우리는 현장에서 포획한 야생 동물의 고립된 미토콘드리아에서 호흡수를 측정하기 위해 이동식 실험실을 설계하고 건설했습니다. 여기에서는 이동식 미토콘드리아 실험실의 설계 및 의장과 관련 실험실 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

미토콘드리아 에너지학은 동물 생화학 및 생리학의 중심 주제이며, 연구자들은 미토콘드리아 호흡을 대사 능력을 조사하기 위한 지표로 사용합니다. 미토콘드리아 호흡 측정값을 얻으려면 신선한 생물학적 샘플을 사용해야 하며 전체 실험실 절차는 약 2시간 이내에 완료되어야 합니다. 또한 이러한 실험실 분석을 수행하려면 여러 특수 장비가 필요합니다. 이로 인해 생리학 실험실에서 멀리 떨어진 야생 동물의 조직에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 어려움이 있는데, 이는 살아있는 조직이 현장에서 수집된 후 오랫동안 보존될 수 없기 때문입니다. 또한 살아있는 동물을 장거리로 운송하는 것은 스트레스를 유발하여 미토콘드리아 에너지를 변화시킬 수 있습니다.

이 원고는 야생 동물에서 채취한 조직의 미토콘드리아 대사를 측정하기 위해 현장에서 사용할 수 있는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실인 Auburn University(AU)의 MitoMobile을 소개합니다. 이동식 실험실의 기본 기능과 격리된 미토콘드리아 호흡수를 측정하기 위한 단계별 방법이 제시됩니다. 또한 제시된 데이터는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 갖추고 미토콘드리아 호흡 측정을 수행하는 것이 성공적이었음을 입증합니다. 이동식 실험실의 참신함은 현장으로 운전하여 현장에서 포획한 동물의 조직에 대한 미토콘드리아 측정을 수행할 수 있는 능력에 있습니다.

서문

현재까지 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위해 고안된 연구는 실험실 동물 또는 기존 생리학 실험실 근처에서 포획한 동물로 제한되어 과학자들이 이동, 잠수 및 동면과 같은 활동 중에 동물로부터 수집한 조직에서 미토콘드리아 생체 에너지 연구를 수행하는 것을 배제했습니다 1,2,3,4,5,6 . 많은 연구자들이 야생동물의 기초 및 최대 대사율과 일일 에너지 소비량을 성공적으로 측정했지만(7,8), 미토콘드리아의 성능을 측정하는 연구자들의 능력은 여전히 제한되어 있다(1,4,9 참조). 이는 부분적으로 미토콘드리아를 분리하기 위한 신선한 조직과 신선한 조직을 얻은 후 약 2시간 이내에 분리를 수행하기 위한 실험실 시설이 필요하기 때문입니다. 미토콘드리아가 분리되면 미토콘드리아 호흡 측정도 ~1시간 이내에 완료되어야 합니다.

분리된 미토콘드리아 호흡수는 일반적으로 Clark 전극에 연결된 밀폐된 용기에서 산소 농도를 측정하여 수행됩니다. 이 방법의 이면에 있는 이론은 산소가 산화적 인산화 동안 미토콘드리아 호흡의 마지막 전자 수용체라는 기본 관찰에 기반을 두고 있습니다. 따라서, 실험 중에 산소 농도가 떨어지면, 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 생성이 발생한다고 가정한다10. 소비된 산소는 생성된 ATP의 대용물입니다. 연구원들은 다양한 기질을 사용하여 특정 실험 조건을 만들고 챔버에 미리 결정된 양의 ADP를 추가하여 아데노신 이인산(ADP) 자극 호흡(상태 3)을 시작할 수 있습니다. 외인성 ADP를 ATP로 인산화한 후, 산소 소비율은 감소하고, 상태 4에 도달하여 측정할 수 있다. 또한, 특이적 억제제의 첨가는 누출 호흡 및 비결합 호흡에 관한 정보를 얻을 수 있게 한다10. 상태 3과 상태 4의 비율은 전체 미토콘드리아 커플링10,11의 지표인 호흡 조절 비율(RCR)을 결정합니다. RCR 값이 낮을수록 전반적인 미토콘드리아 기능 장애를 나타내고, RCR 값이 높을수록 미토콘드리아 결합의 범위가 더 넓다는 것을 나타낸다10.

앞서 언급했듯이 생물학적 물질 수집, 미토콘드리아 분리 및 호흡수 측정은 조직 획득 후 2시간 이내에 완료되어야 합니다. 동물을 기존 실험실로 먼 거리로 운송하지 않고 이 작업을 수행하기 위해 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 건설하여 이러한 데이터를 수집할 수 있는 현장 위치로 가져갔습니다. 2018년형 Jayco Redhawk 레저용 차량은 이동식 분자 생리학 실험실로 개조되어 Auburn University(AU) MitoMobile로 명명되었습니다 (그림 1A). 빌트인 냉장고, 냉동고, 물 저장 탱크 및 배관, 12볼트 배터리로 구동되는 전기, 가스 발생기, 프로판 탱크 및 셀프 레벨링 시스템 때문에 레저용 차량이 선택되었습니다. 또한 레저용 차량은 데이터 수집을 위해 원격 사이트에 밤새 머무를 수 있는 기능을 제공합니다. 차량의 전면은 변경되지 않았으며 운전 및 수면 공간을 제공합니다 (그림 1B). 기존에 차량 후면에 설치된 침실 어메니티(침대, TV, 수납장)와 쿡탑은 제거되었습니다.

맞춤형 스테인리스 스틸 선반과 80/20 알루미늄 프레임으로 지지되는 맞춤형 석영 조리대가 침실 편의 시설과 쿡탑 대신 설치되었습니다 (그림 1C). 실험실 벤치는 데이터 수집을 위한 적절한 공간을 제공합니다 (그림 1D). 각 장비(예: 냉장 원심분리기, 미토콘드리아 호흡 챔버, 플레이트 판독기, 컴퓨터, 균질기, 저울, 휴대용 초냉동고 및 기타 일반 실험실 용품)의 전력 소비가 고려되었습니다. 원심분리기의 큰 전압 및 전류 수요를 지원하기 위해 전기 시스템을 항공기 등급 장비로 업그레이드했습니다. 차량 후면의 외부 구획은 액체 질소 저장 및 운송에 대한 미국 교통부의 지침을 충족하는 액체 질소 저장 베이로 변환되었습니다. 이 저장 장치는 스테인리스 스틸로 제작되었으며 팽창하는 질소 가스가 차량의 승객실로 누출되는 것을 방지하기 위해 적절한 환기 장치가 있습니다.

모바일 실험실이 미토콘드리아 생체 에너지 연구에 사용될 수 있는지 확인하기 위해 미토콘드리아를 분리하고 야생 유래 집쥐(Mus musculus) 뒷다리 골격근의 미토콘드리아 호흡수를 측정했습니다. Mus musculus는 모델 유기체이기 때문에 이 종의 미토콘드리아 호흡수는12,13,14로 잘 확립되어 있습니다. 이전 연구들이 차등 원심분리를 통한 미토콘드리아 분리를 문서화했지만(15,16,17), 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 방법에서 사용되는 방법에 대한 간략한 개요가 아래에 설명되어 있습니다.

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프로토콜

다음 섹션에서는 미토콘드리아 실험실 방법에 대해 설명합니다. 모든 동물 취급 및 조직 수집 절차는 Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee(#2019-3582)의 승인을 받았습니다.

1. 데이터 수집에 사용되는 버퍼에 대한 설명

참고: 이 완충액은 고정식 실험실에서 준비하고 현장 학습 전에 이동식 실험실로 이동할 수 있습니다(아래에 달리 명시되지 않는 한).

  1. 표 1에서 볼 수 있듯이 소 혈청 알부민(BSA)으로 골격근 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다.
    1. 지방산이 없는 BSA를 제외한 탈이온수(~ 90% 부피)에 화학 물질을 녹입니다. 온도가 4 °C가 될 때까지 버퍼를 냉장고에 넣으십시오.
    2. 온도를 7.5°C로 유지하면서 용액을 pH 4로 조정합니다.
    3. 무지방산 BSA를 첨가하고 부피를 100%로 올립니다. 용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 이 용액을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  2. 표 1에서 볼 수 있듯이 BSA가 없는 골격근 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다.
    1. 화학 물질을 탈 이온수 (~ 90 % 부피)에 녹입니다. 온도가 4 °C가 될 때까지 버퍼를 냉장고에 넣으십시오.
    2. 온도를 7.5°C로 유지하면서 용액을 pH 4로 조정합니다.
    3. 볼륨을 100%로 올립니다. 용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 이 용액을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  3. 표 1에 나타낸 바와 같이 골격근 재현탁 완충액을 준비한다.
    1. 화학 물질을 탈 이온수 (~ 90 % 부피)에 녹입니다. 온도가 4 °C가 될 때까지 버퍼를 냉장고에 넣으십시오.
    2. 온도를 7.4°C로 유지하면서 용액을 pH4로 조정합니다.
    3. 볼륨을 100%로 올립니다. 용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 이 용액을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  4. 표 2에 나타낸 바와 같이 골격근 호흡 완충액을 준비한다.
    1. 지방산이 없는 BSA를 제외한 화학 물질을 탈이온수(~ 90% 부피)에 녹입니다. 온도가 37°C가 될 때까지 버퍼를 가열합니다.
    2. 온도를 7.0°C로 유지하면서 용액을 pH 37로 조정합니다.
    3. 무지방산 BSA를 첨가하고 부피를 100%로 올립니다. 용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 이 용액을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
  5. 표 2와 같이 호흡 기질을 준비합니다.
    1. 이러한 기질이 100mM Tris-HCl, pH 7.4에서 데이터 수집 당일에 신선하게 만들어져 있는지 확인하십시오. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 제공된 값은 미토콘드리아가 흡수하기에 충분한 기질에 대해 충분히 농축된 용액을 만들기 위한 것입니다. 기질의 최종 농도는 2mM 피루브산, 2mM 말레이트, 10mM 글루타메이트 및 5mM 숙시네이트입니다.

2. 미토콘드리아 분리 수행(그림 2)

알림: 미토콘드리아 분리 및 미토콘드리아 호흡 측정은 이동식 실험실의 실험실 벤치 영역에서 수행되며 달리 명시되지 않는 한 모든 용액은 4°C에서 유지해야 합니다.

  1. 이동식 실험실을 평지에 주차합니다. 발전기를 켜고 차량의 수평을 맞춥니다. 슬라이드를 확장하고 장비를 설정합니다.
  2. 원하는 양의 버퍼를 동결합니다.
    참고: 일반적으로 근육당 30mL의 골격근 분리 완충액과 BSA가 없는 골격근 분리 완충액 10mL가 필요합니다.
  3. 미토콘드리아 호흡 챔버를 원하는 실험 온도와 제조업체의 지침에 따라 현재 기압으로 설정하고 보정합니다. 실험에 사용되는 특정 챔버에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  4. 참수를 통해 동물을 안락사시킵니다.
    참고: 현재 연구는 안락사를 위해 참수를 사용했다. 이산화탄소 및 이소플루란과 같은 일부 가스는 미토콘드리아 기능에 영향을 미칩니다18,19,20; 이러한 효과는 각 연구에 가장 적합한 안락사 방법을 선택할 때 고려되어야 합니다. 각 연구에 대해 어떤 방법을 수행해야 하는지는 질문되는 과학적 질문에 따라 결정됩니다.
  5. 골격근을 절제하고, 지방과 결합 조직을 빠르게 제거하고, 체중을 측정하고, BSA(최소 1/10 w/v)가 있는 골격근 분리 완충액에 근육을 넣습니다(예: 골격근 1g에서 완충액 10mL).
  6. 얼음 위에서 가위로 골격근을 다집니다.
  7. 절단된 5mL 피펫 팁을 사용하여 다진 조직을 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 칼날( 재료 표 참조)로 5초 동안 50% 전력으로 균질화합니다. 프로테아제(습윤 근육 5mg/g)를 넣고 30초마다 용액을 섞으면서 7분 동안 소화합니다. BSA와 동일한 부피의 분리 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다.
  8. 균질액을 500× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 절단된 5mL 피펫 팁을 사용하여 이중층 무명천을 통해 상층액을 깨끗한 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다. 상층액을 3,500× g 에서 10분 동안 원심분리하여 갈색 미토콘드리아 펠릿을 침전시킵니다.
  9. 남은 상층액을 붓습니다. BSA가 있는 동일한 부피의 분리 버퍼를 원심분리기 튜브에 추가합니다. 유연한 스크레이퍼(경찰관)로 미토콘드리아 펠릿을 원심분리기 튜브의 벽에서 부드럽게 분리하여 미토콘드리아 펠릿을 재현탁합니다. 3,500 × g 에서 10분 동안 원심분리
  10. 남은 상층액을 붓습니다. BSA가 없는 동일한 부피의 분리 완충액을 원심분리기 튜브에 추가합니다. 깨끗한 경찰관과 함께 미토콘드리아 펠릿을 원심분리기 튜브의 벽에서 부드럽게 분리하여 미토콘드리아 펠릿을 다시 부유시킵니다. 3,500 × g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
  11. 상층액을 디캔팅하고 깨끗한 경찰관과 함께 미토콘드리아 펠릿을 원심분리기 튜브의 벽에서 부드럽게 작동시켜 미토콘드리아 펠릿을 재현탁 완충액에 다시 현탁시킵니다.
    참고: 재현탁액의 부피는 미토콘드리아 펠릿의 크기에 따라 달라집니다.
  12. 재현탁된 미토콘드리아를 절단된 1mL 피펫 팁이 있는 Dounce 균질화기로 옮깁니다. Dounce 균질화기를 사용하여 4-5번의 패스로 서스펜션을 조심스럽게 균질화합니다.
  13. 다른 절단된 1mL 피펫 팁을 사용하여 라벨이 부착된 2mL 미세 원심분리 튜브에 미토콘드리아 현탁액을 넣습니다.

3. 미토콘드리아 호흡 측정(그림 3)

  1. 복합 I 기판
    1. 챔버에 945μL의 호흡 완충액을 추가합니다. 교반기가 회전하고 버퍼 온도가 37°C로 유지되는지 확인합니다. 데이터 수집 기록을 시작합니다.
    2. 산소 농도가 안정화되면 미토콘드리아 20μL를 추가하고 챔버에 뚜껑을 놓습니다. 소프트웨어에서 미토콘드리아가 챔버에 추가되었음을 나타냅니다.
    3. 개별 주사기를 사용하여 10μL의 1M 글루타메이트, 10μL의 200mM 말레이트, 10μL의 200mM 피루브산을 챔버에 추가하고 신호가 안정화될 때까지 기다립니다. 소프트웨어에서 기판이 추가되었음을 나타냅니다.
      참고: 이 기질은 일반적으로 탄수화물 유도 호흡을 측정하는 데 사용됩니다. 지방 유도 호흡을 측정하기 위해 사용되는 기질의 다른 조합에 대해서는21을 참조하십시오.
    4. 별도의 주사기로 5μL의 ADP를 추가하고 빠른 산소 소비량을 관찰합니다(상태 3). 소프트웨어에서 ADP가 추가되었음을 나타냅니다.
      알림: 추가된 ADP의 인산화 후 산소 소비율은 상태 4로 정체됩니다.
    5. 상태 4 데이터 수집 4분 후 기록을 종료합니다. 데이터 파일을 저장합니다.
  2. 복합 II 기판
    1. 963μL의 호흡 완충액을 챔버에 추가합니다. 교반기가 회전하고 버퍼 온도가 37°C로 유지되는지 확인합니다. 데이터 수집 기록을 시작합니다.
    2. 산소 농도가 안정화되면 미토콘드리아 20μL를 추가하고 챔버에 뚜껑을 놓습니다. 소프트웨어에서 미토콘드리아가 용액에 추가되었음을 나타냅니다.
    3. 별도의 주사기를 사용하여 2μL의 4μg/μL 로테논과 10μL의 500mM 숙시네이트를 챔버에 추가하고 신호가 안정화될 때까지 기다립니다. 소프트웨어에서 기판이 추가되었음을 나타냅니다.
    4. 별도의 주사기를 사용하여 5μL의 ADP를 추가하고 빠른 산소 소비량을 관찰합니다(상태 3). 소프트웨어에서 ADP가 추가되었음을 나타냅니다.
      알림: 추가된 ADP의 인산화 후 산소 소비율은 상태 4로 정체됩니다.
    5. 상태 4 데이터 수집 4분 후 기록을 종료합니다. 데이터 파일을 저장합니다.

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결과

본 논문은 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실에서 야생 유래 Mus musculus(n=7, 수컷=5, 암컷=2, 나이=1.30± 0.2세)의 미토콘드리아 호흡을 조사했습니다(그림 1). 골격근 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위해 뒷다리 전체, 즉 유산소 및 혐기성 근육을 미토콘드리아 분리에 사용했습니다(그림 2). 원시 미토콘드리아 호흡 데이터의 예는 그?...

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토론

이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 통해 연구원들은 미토콘드리아를 분리하고 원격 현장 현장에서 조직 채취 후 2시간 이내에 미토콘드리아 호흡수를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 AU MitoMobile에서 수행된 미토콘드리아 호흡의 측정이 대학 연구 실험실에서 수행된 측정과 유사하다는 것을 시사합니다. 구체적으로, 여기에 제시된 야생 유래 Mus musculus에 대한 상태 3, 상태 4 ?...

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공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 AU MitoMobile의 구조 및 전기 의장을 지원한 Auburn University의 Samuel Ginn College of Engineering의 전기 및 컴퓨터 공학과의 Mark Nelms와 John Tennant에게 감사를 표합니다. 또한 저자는 AU MitoMobile을 꾸미기 위한 자금과 Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research(PAIR) 보조금의 연구를 인정합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL centrifuge tubesVWR87003-294
2.0 mL centrifuge tubesVWR87003-298
50 mL centrifuge tubesVWR21009-681Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
Clear 96 well plateVWR82050-760Greiner Bio-One
Dounce homogenizerVWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
Filter paperIncluded with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSAVWR89423-672
GlucoseVWRBDH8005-500G
GlutamateVWRA12919
Hamilton SyringesVWR60373-985Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments LtdNo Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4VWR97062-350
MalateVWR97062-140
MannitolVWR97061-052
MembraneIncluded with Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicemanVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
Potassium chloride (KCl)VWR97061-566
ProteaseVWR97062-366Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acidVWR97061-448
Sodium DithioniteVWRAA33381-22
SuccinateVWR89230-086
SucroseVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258

참고문헌

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