Versatilidad de los protocolos para el entrenamiento y evaluación de resistencia utilizando escaleras estáticas y dinámicas en modelos animales

Resumen

El presente protocolo describe el entrenamiento y las pruebas de resistencia utilizando escaleras estáticas y dinámicas en modelos animales.

Resumen

El entrenamiento de resistencia es un modelo de ejercicio físico con profundos beneficios para la salud a lo largo de la vida. El uso de modelos animales de ejercicio de resistencia es una forma de obtener información sobre los mecanismos moleculares subyacentes que orquestan estas adaptaciones. El objetivo de este artículo es describir modelos de ejercicios y protocolos de entrenamiento diseñados para el entrenamiento de fuerza y la evaluación de la resistencia en modelos animales y proporcionar ejemplos. En este artículo, el entrenamiento de fuerza y la evaluación de la resistencia se basan en la actividad de subir escaleras, utilizando escaleras estáticas y dinámicas. Estos dispositivos permiten una variedad de modelos de entrenamiento, así como proporcionar un control preciso de las principales variables que determinan el ejercicio de resistencia: volumen, carga, velocidad y frecuencia. Además, a diferencia del ejercicio de resistencia en humanos, este es un ejercicio forzado. Por lo tanto, se deben evitar estímulos aversivos en esta intervención para preservar el bienestar animal. Antes de la implementación, es necesario un diseño detallado, junto con un período de aclimatación y aprendizaje. La aclimatación a los dispositivos de entrenamiento, como escaleras, pesas y cinta clínica, así como a las manipulaciones requeridas, es necesaria para evitar el rechazo del ejercicio y minimizar el estrés. Al mismo tiempo, a los animales se les enseña a subir la escalera, no hacia abajo, hasta el área de descanso en la parte superior de la escalera. La evaluación de la resistencia puede caracterizar la fuerza física y permitir ajustar y cuantificar la carga de entrenamiento y la respuesta al entrenamiento. Además, se pueden evaluar diferentes tipos de fuerza. En cuanto a los programas de entrenamiento, con un diseño y uso adecuado del dispositivo, pueden ser lo suficientemente versátiles como para modular diferentes tipos de fuerza. Además, deben ser lo suficientemente flexibles como para ser modificados dependiendo de la respuesta adaptativa y conductual de los animales o la presencia de lesiones. En conclusión, el entrenamiento de resistencia y la evaluación con escaleras y pesas son métodos versátiles en la investigación con animales.

Introducción

El ejercicio físico es un factor determinante del estilo de vida para promover la salud y disminuir la incidencia de las enfermedades crónicas más prevalentes, así como algunos tipos de cáncer en humanos¹.

El ejercicio de resistencia ha despertado interés por su abrumadora relevancia para la salud^a lo largo de la vida 2, especialmente por sus beneficios para contrarrestar las enfermedades relacionadas con la edad que afectan al aparato locomotor, como la sarcopenia, la osteoporosis, etc³. Además, el ejercicio de resistencia también afecta a tejidos y órganos que no están directamente involucrados en la ejecución del movimiento, como el cerebro⁴. Esta relevancia en los últimos años ha fomentado el desarrollo de modelos de ejercicios de resistencia en animales para estudiar los mecanismos tisulares y moleculares subyacentes, cuando no es posible en humanos o cuando los animales proporcionan una mejor visión y son un modelo más controlado.

A diferencia del ejercicio de resistencia en humanos, para los modelos animales los investigadores generalmente confían en procedimientos forzados. Sin embargo, los estímulos aversivos deben evitarse en este contexto, principalmente para preservar el bienestar animal, reducir el estrés y disminuir la gravedad de los procedimientos experimentales⁵. Cabe señalar que los animales disfrutan del ejercicio incluso en la naturaleza⁶. Por estas razones, es necesario mejorar la adaptación al experimento a través de una aclimatación prolongada y gradual.

Los dispositivos, materiales y protocolos utilizados para el entrenamiento y evaluación de resistencia en animales de experimentación deben permitir el control y la modulación precisos de numerosas variables: carga, volumen, velocidad y frecuencia⁷. También deben permitir que se realicen diferentes tipos de contracciones musculares: concéntricas, excéntricas o isométricas. Teniendo en cuenta lo anterior, los protocolos utilizados deben ser capaces de evaluar o entrenar específicamente para diferentes aplicaciones de fuerza: fuerza máxima, hipertrofia, velocidad y resistencia.

Existen varios métodos de entrenamiento de fuerza, como saltar en el agua^8,9, nadar con pesas en el agua 10 o electroestimulación muscular¹¹. Sin embargo, las escaleras estáticas y dinámicas son dispositivos versátiles que son ampliamente utilizados^12,13,14.

La evaluación de la resistencia en modelos animales experimentales proporciona información valiosa para muchos entornos de investigación, como la descripción de las características fenotípicas de los animales modificados genéticamente, la evaluación del efecto de diferentes protocolos de intervención (suplementos de componentes dietéticos, tratamientos farmacológicos, trasplante de microbiota, etc.) o la evaluación del efecto de los protocolos de entrenamiento. Los modelos de entrenamiento proporcionan información sobre la fisiología de la adaptación al ejercicio de fuerza, lo que ayuda a comprender mejor el efecto del ejercicio en el estado de salud y la fisiopatología.

En consecuencia, no existe un protocolo universal para el entrenamiento de resistencia o la evaluación funcional de la fuerza en modelos animales, por lo que se necesitan protocolos versátiles.

El objetivo de este estudio es identificar los factores más relevantes a tener en cuenta a la hora de diseñar y aplicar un protocolo de entrenamiento y evaluación de resistencia utilizando escaleras estáticas y dinámicas en modelos animales, así como proporcionar ejemplos específicos.

Protocolo

Los métodos presentados en este protocolo han sido evaluados y aprobados por el comité técnico de investigación animal (referencia PROAE 04/2018, Principado de Asturias, España).

1. Planificación

1. Seleccionar cuidadosamente los animales para el estudio en función de las características de interés (modificados genéticamente, modelos de patología, edad, etc.) y aplicar adaptaciones específicas al protocolo (escalada sin pesos, reducción del número de peldaños a escalar, e inclinación).
2. Identificar la modalidad de fuerza a valorar o entrenar: fuerza máxima, resistencia-resistencia, velocidad, etc. en función de los objetivos del estudio.
3. Ajustar los parámetros cuidadosamente cuando se enmarca la evaluación funcional o el entrenamiento, considerando si se centra en los resultados de estas pruebas o si son complementarios a otros tipos de determinaciones clínicas, funcionales, histológicas o moleculares.
4. Planifique todas las cuestiones relacionadas con la capacitación, en particular el horario, la duración del período de capacitación y la frecuencia de las sesiones, y elabore una mesa de capacitación.
   1. Especifica los pasos de calentamiento y la inclinación de la escalera, que serán los mismos durante todo el entrenamiento. Especifique series, repeticiones, carga (según los resultados de las pruebas de resistencia realizadas antes del período de entrenamiento) y descanse en el medio, prestando atención a los aumentos de carga basados en la sesión anterior.
   2. Modificar el plan, como ocurre con el adiestramiento humano, en función del bienestar del animal. Las modificaciones incluyen disminuir las repeticiones, aumentar el tiempo de descanso entre series o repeticiones, y disminuir la carga para evitar el sobreentrenamiento y las lesiones.
5. Al finalizar, presentar el diseño para su evaluación y aprobación por el comité de investigación de ética animal.

2. Dispositivos y materiales para el ejercicio de resistencia

1. Dispositivos: Escaleras estáticas y dinámicas
   NOTA: Se pueden utilizar dos tipos de escaleras, las llamadas escaleras estáticas y dinámicas (ver Figura 1), para el entrenamiento y evaluación de resistencia (ver Tabla de materiales).
   1. Utilice una escalera vertical con al menos 30 escalones de alambre de acero de 1,5 mm de diámetro, separados por 15 mm, y un área de descanso de al menos 20 x 20 cm en la parte superior de la escalera. La pendiente de la escalera debe ser ajustable de 80° a 110° con el plano horizontal (Figura 1C). Delimite dos carriles para evitar la escalada no lineal.
   2. Use una escalera dinámica similar a la escalera estática, con una barrera de filamento de plástico en la parte superior, que se puede abrir para controlar el acceso al área de descanso, y una barrera de filamento de plástico en la parte inferior, para evitar que los animales bajen. El ángulo de inclinación de la escalera debe ser ajustable entre 80° y 100°, siendo el más común 85°.
      NOTA: La escalera puede circular por medio de un eje superior y otro inferior con un diámetro de 8 cm. El eje inferior es impulsado por un motor eléctrico que hace que los escalones desciendan por la parte delantera y asciendan por la parte trasera, creando una escalera sin fin. Está equipado con un engranaje reductor y un regulador de velocidad para bajar la velocidad de 11,6 cm / s a 3,3 cm / s, y la velocidad más común es de 5,6 cm / s.

Figura 1: Dispositivos de entrenamiento de resistencia: escaleras estáticas y dinámicas. (A) Entrenamiento del ratón con peso externo en una escalera estática. (B) Dos ratones entrenando con peso en una escalera dinámica. (C) Representación esquemática de los ángulos de escalera para capacitación y evaluación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Materiales
   1. Prepare los siguientes materiales: pesas, alambre para sostener pesas, clip de cocodrilo de acero y cinta adhesiva clínica.
      NOTA: Los pesos son cilindros de acero de diferente masa (5, 10, 15, 20, 25 y 50 g), con un orificio de 5 mm de diámetro en el centro para encadenarlos en un alambre (Tabla de materiales). El alambre para sostener los pesos está hecho de acero con un diámetro de 1-1.5 mm y una longitud de 5-10 cm, dependiendo del número de pesos a cargar.
   2. Corte un trozo de vendaje adhesivo elástico (Tabla de materiales) de aproximadamente 3.0-3.5 cm x 1.0-1.5 cm de tamaño y fíjelo alrededor de la cola del animal para sostener los pesos. Asegúrese de no apretar demasiado, ya que puede conducir a la restricción del flujo sanguíneo.
      NOTA: Al principio, el comportamiento de los animales será luchar contra la cinta y morderla, pero después de un par de días, lo tolerarán, acicalándose como de costumbre y sin mostrar signos de estrés.
   3. Inserte los pesos deseados en el alambre y enganche el clip de cocodrilo (Tabla de materiales: clip de cocodrilo de acero y alambre para sostener pesos).
   4. Sujete el cocodrilo a la cinta clínica unida a la cola del animal.
   5. Inmediatamente después de subir los peldaños requeridos, retire la pinza y deje que el animal descanse con la cinta clínica en la cola, pero sin el peso (Figura 1).

3. Aclimatación

NOTA: La aclimatación adecuada es esencial para evitar el rechazo del ejercicio y minimizar el estrés. La aclimatación es una etapa crucial antes de realizar pruebas de evaluación de resistencia o protocolos de entrenamiento. Se debe dedicar el tiempo adecuado para lograr signos de comportamiento de comodidad en los animales. Los detalles de la aclimatación diaria con las escaleras estáticas y dinámicas se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente.

1. Acostumbre a los animales a permanecer en el área de descanso en la parte superior de la escalera (estática o dinámica). Deje a los animales en este lugar en grupos de cuatro, con ropa de cama de su jaula, durante 15 minutos todos los días. Por lo general, después de 3-5 días, los animales no mostrarán signos de estrés.
2. Enseñe a los animales a subir, no a bajar, la escalera. Usando la escalera estática, coloque a los ratones en un peldaño cerca de la parte superior, desde donde puedan ver el área de descanso. Instintivamente irán a ella. Luego, enséñeles a subir progresivamente de cinco peldaños (3x) el primer día, a 10 peldaños (3x) al día siguiente, hasta 15 peldaños (3x) (Tabla 1).
   Utilice el mismo procedimiento con la escalera dinámica, primero sin movimiento, y luego con la escalera moviéndose a 5,4 cm/s y 6,6 cm/s y los animales subiendo durante 2 min, completando cinco series (Tabla 2).
3. Adaptar los animales para llevar pesos, a partir del tercer día de aclimatación. Pegue un trozo de cinta clínica en la base de la cola que se utilizará para sostener pesas.
4. A partir del séptimo día de aclimatación, coloque pesos pequeños (5-10 g) en la cinta clínica con un clip de cocodrilo. Evita realizar demasiadas series, así la adaptación no se transforma en entrenamiento.
   NOTA: La aclimatación del grupo control es obligatoria en caso de que este grupo realice la prueba de resistencia. Después de este período, realice un recordatorio de subir escaleras una vez a la semana, con cinta adhesiva pero sin pesas.

4. Evaluación de la resistencia

1. Pruebas incrementales para evaluar la fuerza máxima
   NOTA: Esta prueba pretende determinar la resistencia máxima medida como el peso máximo al que los animales pueden subir 10 peldaños en la escalera estática, que define el máximo de 10 repeticiones (10 RM)⁴. Este protocolo fue adaptado de estudios previos (revisados en Kregel et ^al.15).
   1. Para el calentamiento realice tres series de 10 repeticiones, 10 pasos/repetición, sin carga externa. Para la primera serie, establezca la pendiente en 90 ° y, posteriormente, en 85 °. Dejar un período de descanso de 60 s entre series.
   2. Ajuste la pendiente a 85° (para evitar que los pesos rozen o se enganchen en los peldaños de la escalera).
   3. Coloque la cinta alrededor de la cola del animal para sostener los pesos y preparar los pesos como se explicó anteriormente.
   4. Comience la prueba con una carga externa de 10 g y realice una serie de 10 pasos.
   5. Retire el peso y permita un período de descanso de 120 s en el área de descanso.
   6. Realizar series sucesivas de 10 pasos aumentando la carga externa en 5 g hasta el agotamiento. Permita el período de descanso (120 s) entre series.
   7. Si un animal no sube 10 escalones con una carga de peso particular, permita otro intento con la misma carga después de 120 s de descanso. Si logra subir con la carga, continúa la prueba con la siguiente carga. Si vuelve a fallar, registre la carga de peso de la última serie completada como su carga de peso máxima.
   8. El resultado de la prueba puede expresarse como peso externo absoluto (g), como carga máxima en relación con el peso corporal (%), o como la masa levantada por gramo de peso corporal, según la discreción del investigador.
      NOTA: El protocolo anterior representa un modelo en el que son posibles numerosas modificaciones, por ejemplo, para evaluar la resistencia máxima de ratones modificados genéticamente con discapacidades neuromusculares. Estos animales no son capaces de escalar con cargas externas y tienen dificultades para subir 10 peldaños con la escalera puesta a 90° de pendiente (datos no publicados). El protocolo consistió en subir cinco escalones sin carga externa, comenzando con una pendiente de 110°. La pendiente disminuyó 5° en cada serie hasta 85° con 120 s de descanso después de cada serie. En este caso, la resistencia máxima se expresó como el número acumulado de escalones subidos (sin considerar las repeticiones después de las fallas). El grupo de control de tipo salvaje, después de alcanzar la pendiente de 85°, continuará con la prueba agregando peso externo a la cola, siguiendo el protocolo previo, hasta el agotamiento.
2. Prueba de resistencia-resistencia máxima con la escalera estática
   1. Para el calentamiento realice tres series de 10 repeticiones, 10 pasos/repetición, sin carga externa. Para la primera serie, ajuste la pendiente a 90° y, posteriormente, a 85°. Dejar un período de descanso de 60 s entre series.
   2. Ajuste la pendiente a 85°.
   3. Recorte el peso en la cinta clínica colocada alrededor de la cola del ratón.
      NOTA: Dependiendo de la edad y las características de los animales, la carga externa puede ser el peso máximo obtenido en una prueba incremental previa, un porcentaje de la misma (por ejemplo, 50%), o un porcentaje de peso corporal (por ejemplo, 100%-200%). Si esta prueba se realiza después de un período de entrenamiento, se recomienda utilizar la misma carga que en la prueba inicial para evaluar los cambios.
   4. Realizar series consecutivas de 10 pasos hasta el agotamiento. No se permite tiempo de descanso después de cada serie.
   5. El resultado de la prueba es el número de peldaños subidos.
3. Prueba de resistencia-resistencia máxima con la escalera dinámica
   NOTA: El uso de la escalera dinámica permite al investigador controlar la velocidad de ascenso.
   1. Ajuste la pendiente a 85°.
   2. Ajuste la velocidad a 4,2 cm/s.
   3. Para el calentamiento realice tres series de 100 pasos, sin carga externa. Dejar un período de descanso de 60 s entre series.
   4. Sujete el peso en la cinta clínica colocada alrededor de la cola del ratón.
      NOTA: Dependiendo de la edad y las características de los animales, la carga externa puede ser el peso máximo obtenido en una prueba incremental previa, un porcentaje de la misma (por ejemplo, 50%), o un porcentaje de peso corporal (por ejemplo, 100%-200%). Si esta prueba se realiza después de un período de entrenamiento, se recomienda utilizar la misma carga que en la prueba inicial para evaluar los cambios.
   5. Comience a 4,2 cm/s y aumente la velocidad en 1,2 cm/s cada 60 s hasta el agotamiento.
      NOTA: El resultado de la prueba es el tiempo de ejercicio, el número de peldaños subidos o la velocidad máxima.

5. Entrenamiento de resistencia con escalera estática

NOTA: Antes de comenzar el período de entrenamiento, es necesaria la aclimatación (Tabla 1) y la planificación del entrenamiento. Para reducir la ansiedad, adapte y entrene a los ratones en grupos de cuatro animales que comparten la misma jaula.

1. Para el calentamiento diario realice tres series de 10 repeticiones, 10 pasos / repetición, sin carga externa. Para la primera serie, establezca la pendiente en 90 ° y, posteriormente, en 85 °. Dejar un período de descanso de 60 s entre series.
2. La sesión de entrenamiento comienza en el área de descanso. Sujete el cocodrilo con el peso en la cinta clínica.
3. Coloque suavemente el ratón 10-20 peldaños por debajo del lugar de descanso. Permita que el ratón agarre el peldaño y suba al área de descanso.
   Repita este proceso hasta que se complete el número de peldaños de esta serie (por ejemplo, 10 peldaños x 10 series).
4. Retire el peso de la cola del ratón y espere 120 s hasta la siguiente serie.
5. Aumentar el número de pasos y las cargas de peso máximo de la serie durante todo el período de entrenamiento, manteniendo el horario semanal.
   NOTA: Un ejemplo de la variación de las cargas durante una semana de planificación se muestra en la Tabla 3. En breve, martes y viernes con alta carga de peso (40-50 g) y un bajo número de pasos (500-400); lunes y jueves con carga de peso intermedia (25-35 g) y un número intermedio de pasos (800-600); y miércoles sin carga de peso pero un alto número de pasos (2.000). Este diseño facilita la recuperación de sesiones de entrenamiento anteriores y evita lesiones y sobreentrenamiento. Ejemplos de 3 semanas de entrenamiento con múltiples diseños utilizando la escalera estática se muestran en la Tabla 4 (al principio, en el medio y al final del período de entrenamiento, respectivamente)⁴.

6. Entrenamiento de resistencia con escalera dinámica

NOTA: Después de la aclimatación, el entrenamiento en la escalera dinámica es bastante similar al estático (Tabla 2). El entrenamiento se realiza en 2-4 ratones a la vez.

1. Ajuste la pendiente a 85°, cierre la puerta del área de descanso y comience la escalera a la velocidad deseada (por ejemplo, 5,4 cm/s).
2. Para el calentamiento realice tres series de 100 pasos, sin carga externa. Dejar un período de descanso de 60 s entre series.
3. Antes de que comiencen las sesiones de entrenamiento, cuando el ratón esté en el área de descanso, sujete el cocodrilo con el peso en la cinta clínica. Alternativamente, el peso se puede colocar cuando el mouse ya está en la escalera.
4. Coloque suavemente el mouse en la parte superior de la escalera móvil con el peso en la cola. Permita que los ratones agarren el peldaño y trepen.
5. Cuando se alcance el número de peldaños de esta serie (por ejemplo, 100), retire los pesos. Luego se abre la puerta para que el animal pueda ir al área de descanso. El tiempo de descanso es de 120 s antes de la siguiente serie.
   NOTA: El número de escalones subidos se cuenta en función del tiempo de ascenso a la velocidad establecida.
6. Repita este procedimiento hasta que se complete la sesión de entrenamiento. El programa de entrenamiento diario detallado se muestra en la Tabla 5.

7. Evaluación del efecto cruzado del entrenamiento de resistencia en el rendimiento de resistencia

NOTA: Para ello, se realiza una prueba incremental en cinta rodante⁴, después de 24 h de descanso.

1. Después de un calentamiento de 3 min a 10 cm/s, comience la prueba incremental a 10 cm/s y un ángulo de inclinación de 10°.
2. Aumentar la velocidad en 3,33 cm/s cada 3 min hasta el agotamiento.
   NOTA: No se utilizan descargas eléctricas, por lo que se coloca un pincel de pintor en la parte posterior de la cinta de correr para evitar que los ratones se escapen de ella.

8. Comportamiento animal durante los procedimientos

NOTA: Se debe realizar un monitoreo continuo de la adaptación de los ratones al entrenamiento para detectar fatiga extrema, sobreentrenamiento o lesiones.

1. Observar signos de bienestar animal, en particular aseo y negativa al entrenamiento. El comportamiento normal del ratón, después de una serie de entrenamientos intensos, es permanecer inactivo durante aproximadamente un minuto debido a la fatiga. Después de eso, comienzan a acicalarse, explorar o tratar de quitar la cinta en la cola.
2. En el caso de un ratón que se niega a entrenar una serie, intente dar descansos más largos o incluso no realizar esa serie para evitar la inhibición.
3. Ocasionalmente, al realizar ejercicios ligeros, empuje suavemente la cola del animal, para alentarlo a terminar la serie. Los animales dejan de trepar porque no es una tarea exigente. Por el contrario, cuando los animales llevan una carga pesada, cambie suavemente el peso del animal para aliviar la carga y alentarlo a terminar la serie, y luego permita que el animal descanse hasta la próxima sesión de entrenamiento. Los animales pueden detenerse o incluso intentar descender debido a la pesada carga.

9. Procedimientos de seguridad

1. Procedimientos de seguridad para investigadores: Realizar investigaciones en el laboratorio de la instalación de animales y usar cubiertas de zapatos, overoles, guantes, gorros y máscaras. No hay requisitos adicionales aparte de los específicos de la investigación con animales.
2. Seguridad para los animales: Durante las sesiones de ejercicio se debe prestar atención continua a los animales, debido a los riesgos potenciales, como caídas o saltos. Coloque una mano debajo de los pesos para atrapar y sujetar a los ratones en caso de caída debido al agotamiento, ya que su capacidad para sujetarse a los peldaños correctamente será limitada.

Resultados

Resultados con escalera estática
El protocolo de entrenamiento de resistencia progresiva utilizado y descrito por Codina-Martínez et al.4 (Tabla 4) se probó en un estudio preliminar que consistió en 7 semanas de entrenamiento en una escalera estática con ratones C57BL6J de tipo salvaje de 6 meses de edad (n = ⁴). En este estudio preliminar, se realizaron pruebas incrementales para evaluar la fuerza máxima antes y después del período de entrenamiento. Ob...

Discusión

El entrenamiento es una intervención con múltiples aplicaciones en la investigación, aparte del estudio del ejercicio en sí. Así, el análisis de su efecto sobre el envejecimiento²⁰ o ciertas condiciones patológicas y la fisioterapia²¹ ha recibido mucha atención en los últimos años. Además, numerosos autores han analizado el efecto de las intervenciones farmacológicas²² o dietéticas²¹ sobre la aptitud física. En e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic ladder	in-house production
Elastic adhesive bandage 6 cm x 2.5 m	BSN medical	4005556
Gator Clip Steel NON-INSUL 10A	Digikey electronics	BC60ANP
Static ladder	in-house production
Weights	in-house production
Wire for holding weigths	in-house production