Versatilidade de Protocolos de Treinamento e Avaliação Resistida utilizando Escadas Estáticas e Dinâmicas em Modelos Animais

Resumo

O presente protocolo descreve o treinamento e o teste resistido usando escadas estáticas e dinâmicas em modelos animais.

Resumo

O treinamento de resistência é um modelo de exercício físico com profundos benefícios para a saúde ao longo da vida. O uso de modelos animais de exercícios de resistência é uma maneira de obter informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes que orquestram essas adaptações. O objetivo deste artigo é descrever modelos de exercícios e protocolos de treinamento projetados para treinamento de força e avaliação da resistência em modelos animais e fornecer exemplos. Neste artigo, o treinamento de força e a avaliação da resistência são baseados na atividade de escalada de escadas, usando escadas estáticas e dinâmicas. Esses dispositivos permitem uma variedade de modelos de treinamento, além de fornecer controle preciso das principais variáveis que determinam o exercício resistido: volume, carga, velocidade e frequência. Além disso, ao contrário do exercício de resistência em humanos, este é um exercício forçado. Assim, estímulos aversivos devem ser evitados nessa intervenção para preservar o bem-estar animal. Antes da implementação, é necessário um projeto detalhado, juntamente com um período de aclimatação e aprendizado. A aclimatação aos dispositivos de treinamento, como escadas, pesos e fita adesiva, bem como às manipulações necessárias, é necessária para evitar a rejeição do exercício e minimizar o estresse. Ao mesmo tempo, os animais são ensinados a subir a escada, não descer, para a área de descanso no topo da escada. A avaliação da resistência pode caracterizar a força física e permitir ajustar e quantificar a carga de treinamento e a resposta ao treinamento. Além disso, diferentes tipos de força podem ser avaliados. Em relação aos programas de treinamento, com design e uso adequados do dispositivo, eles podem ser suficientemente versáteis para modular diferentes tipos de resistência. Além disso, eles devem ser flexíveis o suficiente para serem modificados dependendo da resposta adaptativa e comportamental dos animais ou da presença de lesões. Em conclusão, o treinamento de resistência e a avaliação usando escadas e pesos são métodos versáteis em pesquisas com animais.

Introdução

O exercício físico é um fator determinante no estilo de vida para promover a saúde e diminuir a incidência das doenças crônicas mais prevalentes, bem como alguns tipos de câncer em humanos¹.

O exercício resistido tem despertado interesse devido à sua relevância avassaladora para a saúde ao longo da vida², especialmente devido aos seus benefícios no combate a doenças relacionadas à idade que afetam o aparelho locomotor, como sarcopenia, osteoporose, etc³. Além disso, o exercício resistido também afeta tecidos e órgãos não diretamente envolvidos na execução do movimento, como o cérebro⁴. Essa relevância nos últimos anos tem incentivado o desenvolvimento de modelos de exercícios resistidos em animais para estudar os mecanismos tissulares e moleculares subjacentes, quando não é possível em humanos ou quando os animais fornecem uma melhor visão e são um modelo mais controlado.

Ao contrário do exercício de resistência em humanos, para modelos animais os pesquisadores geralmente dependem de procedimentos forçados. No entanto, estímulos aversivos devem ser evitados nesse contexto, principalmente para preservar o bem-estar animal, reduzir o estresse e diminuir a gravidade dos procedimentos experimentais⁵. Deve-se notar que os animais gostam de se exercitar mesmo na natureza⁶. Por estas razões, é necessário melhorar a adaptação ao experimento através da aclimatação gradual prolongada.

Os dispositivos, materiais e protocolos utilizados para treinamento e avaliação resistida em animais experimentais devem permitir o controle e modulação precisos de inúmeras variáveis: carga, volume, velocidade e frequência⁷. Eles também devem permitir que diferentes tipos de contrações musculares sejam realizadas: concêntricas, excêntricas ou isométricas. Considerando o exposto, os protocolos utilizados devem ser capazes de avaliar ou treinar especificamente para diferentes aplicações de força: força máxima, hipertrofia, velocidade e resistência.

Existem vários métodos de treinamento de força, como saltar na água^8,9, nadar ponderado na água 10 ou eletroestimulação muscular¹¹. No entanto, as escadas estáticas e dinâmicas são dispositivos versáteis e amplamente utilizados^12,13,14.

A avaliação da resistência em modelos animais experimentais fornece informações valiosas para muitos ambientes de pesquisa, como descrever as características fenotípicas de animais geneticamente modificados, avaliar o efeito de diferentes protocolos de intervenção (suplementação de componentes dietéticos, tratamentos medicamentosos, transplante de microbiota, etc.) ou avaliar o efeito de protocolos de treinamento. Os modelos de treinamento fornecem informações sobre a fisiologia da adaptação ao exercício de força, o que ajuda a entender melhor o efeito do exercício no estado de saúde e na fisiopatologia.

Consequentemente, não existe um protocolo universal para o treinamento resistido ou a avaliação funcional da força em modelos animais, portanto, protocolos versáteis são necessários.

O objetivo deste estudo é identificar os fatores mais relevantes a serem considerados ao projetar e aplicar um protocolo de treinamento e avaliação resistida utilizando escadas estáticas e dinâmicas em modelos animais, bem como fornecer exemplos específicos.

Protocolo

Os métodos apresentados neste protocolo foram avaliados e aprovados pelo comité técnico de investigação em animais (referência PROAE 04/2018, Principado de Asturias, Espanha).

1. Planejamento

1. Selecionar cuidadosamente os animais para o estudo com base nas características de interesse (geneticamente modificados, modelos patológicos, idade, etc.) e aplicar adaptações específicas ao protocolo (escalada sem pesos, redução do número de degraus a subir e inclinação).
2. Identificar a modalidade de força a ser avaliada ou treinada: força máxima, resistência-resistência, velocidade, etc., dependendo dos objetivos do estudo.
3. Ajuste os parâmetros cuidadosamente quando a avaliação funcional ou o treinamento for estruturado, considerando se ele se concentra nos resultados desses testes ou se eles são complementares a outros tipos de determinações clínicas, funcionais, histológicas ou moleculares.
4. Planeje todas as questões relacionadas ao treinamento, particularmente o cronograma, a duração do período de treinamento e a frequência das sessões, e desenhe uma tabela de treinamento.
   1. Especifique os degraus de aquecimento e a inclinação da escada, que será a mesma durante todo o treinamento. Especifique conjuntos, repetições, carga (com base nos resultados dos testes de resistência feitos antes do período de treinamento) e descanse no meio, prestando atenção aos aumentos de carga com base na sessão anterior.
   2. Modifique o plano, como acontece com o treinamento humano, dependendo do bem-estar do animal. As modificações incluem a diminuição das repetições, o aumento do tempo de descanso entre séries ou repetições e a diminuição da carga para evitar o excesso de treinamento e lesões.
5. Após a conclusão, submeter o projeto para avaliação e aprovação pelo comitê de ética em pesquisa com animais.

2. Dispositivos e materiais para exercícios resistidos

1. Dispositivos: Escadas estáticas e dinâmicas
   NOTA: Dois tipos de escadas, as chamadas escadas estáticas e dinâmicas (ver Figura 1), podem ser utilizadas para treino e avaliação de resistência (ver Tabela de Materiais).
   1. Use uma escada vertical com pelo menos 30 degraus de fio de aço de 1,5 mm de diâmetro, separados por 15 mm, e uma área de descanso de pelo menos 20 x 20 cm no topo da escada. A inclinação da escada deve ser ajustável de 80° a 110° com o plano horizontal (Figura 1C). Delimite duas faixas para evitar escaladas não lineares.
   2. Use uma escada dinâmica semelhante à escada estática, com uma barreira de filamento de plástico na parte superior, que pode ser aberta para controlar o acesso à área de descanso, e uma barreira de filamento de plástico na parte inferior, para evitar que os animais desçam. O ângulo de inclinação da escada deve ser ajustável entre 80° e 100°, sendo o mais comum 85°.
      NOTA: A escada pode circular por meio de um eixo superior e um eixo inferior com um diâmetro de 8 cm. O eixo inferior é acionado por um motor elétrico que faz com que os degraus desçam na frente e subam na traseira, criando uma escada sem fim. É equipado com uma engrenagem de redução e um regulador de velocidade para baixar a velocidade de 11,6 cm / s para 3,3 cm / s, e a velocidade mais comum é de 5,6 cm / s.

Figura 1: Dispositivos de treinamento de resistência: escadas estáticas e dinâmicas. (A) Treinamento de mouse com peso externo em uma escada estática. (B) Dois ratos treinando com peso em uma escada dinâmica. (C) Representação esquemática de ângulos de escada para treinamento e avaliação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Materiais
   1. Prepare os seguintes materiais: pesos, fio para segurar pesos, clipe de jacaré de aço e fita adesiva clínica.
      NOTA: Os pesos são cilindros de aço de massa diferente (5, 10, 15, 20, 25 e 50 g), com um orifício de 5 mm de diâmetro no centro para amarrá-los em um fio (Tabela de Materiais). O fio para suportar os pesos é feito de aço com um diâmetro de 1-1,5 mm e um comprimento de 5-10 cm, dependendo do número de pesos a serem carregados.
   2. Corte um pedaço de bandagem adesiva elástica (Tabela de Materiais) de aproximadamente 3,0-3,5 cm x 1,0-1,5 cm de tamanho e prenda-o ao redor da cauda do animal para segurar os pesos. Certifique-se de não apertar demais, pois isso pode levar à restrição do fluxo sanguíneo.
      NOTA: No início, o comportamento dos animais será lutar contra a fita e mordê-la, mas depois de alguns dias, eles a tolerarão, preparando-se como de costume e não mostrando sinais de estresse.
   3. Insira os pesos desejados no fio e prenda o clipe do jacaré (Tabela de Materiais: Clipe de jacaré de aço e fio para segurar pesos).
   4. Prenda o jacaré à fita clínica presa à cauda do animal.
   5. Imediatamente após subir os degraus necessários, retire o grampo e deixe o animal descansar com a fita clínica na cauda, mas sem o peso (Figura 1).

3. Aclimatação

NOTA: A aclimatação adequada é essencial para evitar a rejeição do exercício e minimizar o estresse. A aclimatação é uma etapa crucial antes da realização de testes de avaliação de resistência ou protocolos de treinamento. Tempo adequado deve ser gasto para alcançar sinais comportamentais de conforto nos animais. Os detalhes da aclimatação diária com as escadas estática e dinâmica são apresentados na Tabela 1 e na Tabela 2, respectivamente.

1. Acostume os animais a permanecerem na área de descanso no topo da escada (estática ou dinâmica). Deixe os animais neste local em grupos de quatro, com cama de sua gaiola, por 15 minutos todos os dias. Normalmente, após 3-5 dias, os animais não mostrarão sinais de estresse.
2. Ensine os animais a subir, não descer, a escada. Usando a escada estática, coloque os ratos em um degrau perto do topo, de onde eles podem ver a área de descanso. Eles instintivamente irão a ele. Em seguida, ensine-os progressivamente a subir de cinco degraus (3x) no primeiro dia, para 10 degraus (3x) no dia seguinte, até 15 degraus (3x) (Tabela 1).
   Utilize o mesmo procedimento com a escada dinâmica, primeiro sem movimento, e depois com a escada se movendo a 5,4 cm/s e 6,6 cm/s e os animais subindo por 2 min, completando cinco séries (Tabela 2).
3. Adapte os animais para carregar pesos, a partir do terceiro dia de aclimatação. Cole um pedaço de fita adesiva clínica na base da cauda que será usada para segurar pesos.
4. A partir do sétimo dia de aclimatação, prenda pequenos pesos (5-10 g) à fita clínica com um clipe de jacaré. Evite realizar muitas séries, para que a adaptação não seja transformada em treinamento.
   NOTA: A aclimatação do grupo controle é obrigatória caso este grupo realize o teste de resistência. Após esse período, realize um lembrete de escalada de escada uma vez por semana, com fita adesiva, mas sem pesos.

4. Avaliação da resistência

1. Testes incrementais para avaliar a força máxima
   NOTA: Este ensaio pretende determinar a resistência máxima medida como o peso máximo a que os animais podem subir 10 degraus na escada estática, o que define o máximo de 10 repetições (10 RM)⁴. Esse protocolo foi adaptado de estudos anteriores (revisados em Kregel et ^al.15).
   1. Para o aquecimento realize três séries de 10 repetições, 10 passos/repetição, sem carga externa. Para a primeira série, defina a inclinação em 90° e, posteriormente, em 85°. Permita um período de descanso de 60 s entre as séries.
   2. Defina a inclinação em 85° (para evitar que os pesos pastem ou ganchom nos degraus da escada).
   3. Prenda a fita ao redor da cauda do animal para segurar os pesos e prepare os pesos conforme explicado anteriormente.
   4. Inicie o teste com uma carga externa de 10 g e execute uma série de 10 etapas.
   5. Remova o peso e permita um período de descanso de 120 s na área de descanso.
   6. Realizar séries sucessivas de 10 passos aumentando a carga externa em 5 g até a exaustão. Permitir o período de repouso (120 s) entre as séries.
   7. Se um animal não conseguir subir 10 degraus com uma carga de peso específica, permita outra tentativa com a mesma carga após 120 s de descanso. Se ele conseguir subir com a carga, ele continua o teste com a próxima carga. Se falhar novamente, registre a carga de peso da última série concluída como sua carga de peso máximo.
   8. O resultado do teste pode ser expresso como peso externo absoluto (g), como carga máxima em relação ao peso corporal (%), ou como massa levantada por grama de peso corporal, a critério do pesquisador.
      NOTA: O protocolo anterior representa um modelo no qual inúmeras modificações são possíveis, por exemplo, para avaliar a resistência máxima de camundongos geneticamente modificados com deficiências neuromusculares. Esses animais não são capazes de subir com cargas externas e têm dificuldades para subir 10 degraus com a escada fixada a 90° de inclinação (dados não publicados). O protocolo consistiu em subir cinco degraus sem carga externa, iniciando-se com uma inclinação de 110°. A inclinação diminuiu 5° em cada série até 85° com 120 s de descanso após cada série. Neste caso, a resistência máxima foi expressa como o número acumulado de degraus subidos (sem considerar repetições após falhas). O grupo de controle do tipo selvagem, após atingir a inclinação de 85°, continuará com o teste adicionando peso externo à cauda, seguindo o protocolo anterior, até a exaustão.
2. Teste de resistência-resistência máxima com a escada estática
   1. Para o aquecimento realize três séries de 10 repetições, 10 passos/repetição, sem carga externa. Para a primeira série, defina a inclinação em 90° e, posteriormente, em 85°. Permita um período de descanso de 60 s entre as séries.
   2. Defina a inclinação em 85°.
   3. Corte o peso na fita clínica colocada ao redor da cauda do mouse.
      NOTA: Dependendo da idade e das características dos animais, a carga externa pode ser o peso máximo obtido em um teste incremental anterior, uma porcentagem dele (por exemplo, 50%) ou uma porcentagem do peso corporal (por exemplo, 100%-200%). Se este teste for realizado após um período de treinamento, recomenda-se usar a mesma carga que no teste inicial para avaliar as mudanças.
   4. Execute séries consecutivas de 10 passos até a exaustão. Nenhum tempo de descanso é permitido após cada série.
   5. O resultado do teste é o número de degraus subidos.
3. Teste de resistência-resistência máxima com a escada dinâmica
   NOTA: O uso da escada dinâmica permite que o pesquisador controle a velocidade de subida.
   1. Defina a inclinação em 85°.
   2. Defina a velocidade em 4,2 cm/s.
   3. Para aquecimento, execute três séries de 100 etapas, sem carga externa. Permita um período de descanso de 60 s entre as séries.
   4. Corte o peso na fita clínica colocada ao redor da cauda do rato.
      NOTA: Dependendo da idade e das características dos animais, a carga externa pode ser o peso máximo obtido em um teste incremental anterior, uma porcentagem dele (por exemplo, 50%) ou uma porcentagem do peso corporal (por exemplo, 100%-200%). Se este teste for realizado após um período de treinamento, recomenda-se usar a mesma carga que no teste inicial para avaliar as mudanças.
   5. Comece em 4,2 cm/s e aumente a velocidade em 1,2 cm/s a cada 60 s até a exaustão.
      NOTA: O resultado do teste é o tempo de exercício, o número de degraus subidos ou a velocidade máxima.

5. Treinamento de resistência com escada estática

NOTA: Antes de iniciar o período de treinamento, a aclimatação (Tabela 1) e o planejamento do treinamento são necessários. Para reduzir a ansiedade, adapte e treine os ratos em grupos de quatro animais que compartilham a mesma gaiola.

1. Para o aquecimento diário realize três séries de 10 repetições, 10 passos/repetição, sem carga externa. Para a primeira série, defina a inclinação em 90° e, posteriormente, em 85°. Permita um período de descanso de 60 s entre as séries.
2. A sessão de treinamento começa na área de descanso. Corte o jacaré com o peso na fita clínica.
3. Coloque suavemente o mouse 10-20 degraus abaixo do local de descanso. Permita que o mouse segure o degrau e suba até a área de descanso.
   Repita este processo até que o número de degraus nesta série (por exemplo, 10 degraus x 10 séries) seja concluído.
4. Remova o peso da cauda do mouse e aguarde 120 s até a próxima série.
5. Aumente o número de passos e as cargas máximas de peso da série durante todo o período de treinamento, mantendo o cronograma semanal.
   NOTA: Um exemplo da variação de cargas durante um planejamento semanal é mostrado na Tabela 3. Em breve, terça e sexta-feira com carga de alto peso (40-50 g) e um baixo número de passos (500-400); Segunda e quinta-feira com carga de peso intermediário (25-35 g) e número intermediário de degraus (800-600); e quarta-feira sem carga de peso, mas com um elevado número de passos (2.000). Este design facilita a recuperação de sessões de treinamento anteriores e evita lesões e excesso de treinamento. Exemplos de 3 semanas de treinamento com múltiplos desenhos utilizando a escada estática são mostrados na Tabela 4 (no início, no meio e no final do período de treinamento, respectivamente)⁴.

6. Treinamento de resistência com escada dinâmica

NOTA: Após a aclimatação, o treinamento na escada dinâmica é bastante parecido com o estático (Tabela 2). O treinamento é realizado em 2-4 ratos de cada vez.

1. Defina a inclinação para 85°, feche a porta para a área de descanso e inicie a escada na velocidade desejada (por exemplo, 5,4 cm/s).
2. Para aquecimento, execute três séries de 100 etapas, sem carga externa. Permita um período de descanso de 60 s entre as séries.
3. Antes do início das sessões de treinamento, quando o rato estiver na área de repouso, prenda o jacaré com o peso na fita clínica. Alternativamente, o peso pode ser anexado quando o mouse já está na escada.
4. Coloque suavemente o mouse no topo da escada em movimento com o peso na cauda. Permita que os ratos segurem o degrau e subam.
5. Quando o número de degraus nesta série for atingido (por exemplo, 100), remova os pesos. Em seguida, a porta é aberta para que o animal possa ir para a área de descanso. O tempo de descanso é de 120 s antes da próxima série.
   NOTA: O número de degraus subidos é contado em função do tempo de escalada na velocidade definida.
6. Repita este procedimento até que a sessão de treinamento seja concluída. O programa de treinamento diário detalhado é mostrado na Tabela 5.

7. Avaliação do efeito cruzado do treinamento resistido no desempenho de resistência

NOTA: Para isso, é realizado um teste incremental em esteira⁴, após 24 h de repouso.

1. Após um aquecimento de 3 min a 10 cm/s, iniciar o ensaio incremental a 10 cm/s e ângulo de inclinação de 10°.
2. Aumente a velocidade em 3,33 cm/s a cada 3 min até a exaustão.
   NOTA: Nenhum choque elétrico é usado, então o pincel de um pintor é colocado na parte de trás da esteira para evitar que os ratos corram dela.

8. Comportamento animal durante os procedimentos

NOTA: O monitoramento contínuo da adaptação de camundongos ao treinamento deve ser realizado para detectar fadiga extrema, overtraining ou lesão.

1. Observar os sinais de bem-estar dos animais, em especial o aliciamento e a recusa à formação. O comportamento normal do rato, após uma série de treinos intensos, é permanecer inativo durante cerca de um minuto devido à fadiga. Depois disso, eles começam a se arrumar, explorar ou tentar remover a fita na cauda.
2. No caso de um rato se recusar a treinar uma série, tente dar descansos mais longos ou mesmo não realizar essa série para evitar a inibição.
3. Ocasionalmente, ao realizar exercícios leves, empurre suavemente a cauda do animal, para incentivá-lo a terminar a série. Os animais param de escalar porque não é uma tarefa exigente. Por outro lado, quando os animais estão carregando uma carga pesada, mude suavemente o peso do animal para aliviar a carga e incentivá-lo a terminar a série e, em seguida, permita que o animal descanse até a próxima sessão de treinamento. Os animais podem parar ou até mesmo tentar descer por causa da carga pesada.

9. Procedimentos de segurança

1. Procedimentos de segurança para pesquisadores: Realizar pesquisas no laboratório de instalações de animais e usar capas de sapatos, macacões, luvas, bonés e máscaras. Não existem requisitos adicionais para além dos específicos da investigação com animais.
2. Segurança para os animais: Durante as sessões de exercício deve ser dada atenção contínua aos animais, devido a riscos potenciais, como quedas ou saltos. Coloque uma mão sob os pesos para pegar e segurar os ratos em caso de queda devido à exaustão, uma vez que sua capacidade de segurar os degraus adequadamente será limitada.

Resultados

Resultados com escada estática
O protocolo de treinamento resistido progressivo utilizado e descrito por Codina-Martinez et al.4 (Tabela 4) foi testado em um estudo preliminar que consistiu em 7 semanas de treinamento em escada estática com camundongos C57BL6J do tipo selvagem de 6 meses de idade (n = ⁴). Neste estudo preliminar, testes incrementais para avaliar a força máxima foram realizados antes e após o período de treinamento. Observou-se um aumento ...

Discussão

O treinamento é uma intervenção com múltiplas aplicações na pesquisa, além do estudo do exercício em si. Assim, a análise de seu efeito sobre o envelhecimento²⁰ ou certas condições patológicas e fisioterapêuticas²¹ tem recebido muita atenção nos últimos anos. Além disso, numerosos autores analisaram o efeito das intervenções farmacológicas²² ou dietéticas²¹ sobre a aptidão física. Nesse contexto, surgiu ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic ladder	in-house production
Elastic adhesive bandage 6 cm x 2.5 m	BSN medical	4005556
Gator Clip Steel NON-INSUL 10A	Digikey electronics	BC60ANP
Static ladder	in-house production
Weights	in-house production
Wire for holding weigths	in-house production