Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores

Resumen

El presente protocolo describe un sistema de "movimiento pasivo de la cabeza" diseñado a medida, que reproduce aceleraciones mecánicas en las cabezas de los roedores generadas durante su carrera en cinta a velocidades moderadas. Permite diseccionar factores/elementos mecánicos de los efectos beneficiosos del ejercicio físico.

Resumen

El ejercicio es ampliamente reconocido como eficaz para diversas enfermedades y trastornos físicos, incluidos los relacionados con la disfunción cerebral. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de los efectos beneficiosos del ejercicio son poco conocidos. Muchos entrenamientos físicos, particularmente aquellos clasificados como ejercicios aeróbicos como trotar y caminar, producen fuerzas impulsivas en el momento del contacto del pie con el suelo. Por lo tanto, se especuló que el impacto mecánico podría estar implicado en cómo el ejercicio contribuye a la homeostasis del organismo. Para probar esta hipótesis en el cerebro, se desarrolló un sistema de "movimiento pasivo de la cabeza" diseñado a medida (en adelante, PHM) que puede generar aceleraciones verticales con magnitudes y modos controlados y definidos y reproducir la estimulación mecánica que podría aplicarse a las cabezas de los roedores durante la carrera en cinta a velocidades moderadas, una intervención típica para probar los efectos del ejercicio en animales. Mediante el uso de este sistema, se demostró que PHM recapitula la serotonina (5-hidroxitriptamina, en lo sucesivo denominada 5-HT) receptor subtipo 2A (5-HT_2A) señalización en las neuronas de la corteza prefrontal (PFC) de ratones. Este trabajo proporciona protocolos detallados para aplicar PHM y medir sus aceleraciones mecánicas resultantes en las cabezas de los roedores.

Introducción

El ejercicio es beneficioso para tratar o prevenir varios trastornos físicos, incluyendo enfermedades del estilo de vida como la diabetes mellitus y la hipertensión esencial¹. En relación con esto, también se han acumulado evidencias sobre los efectos positivos del ejercicio sobre las funciones cerebrales². Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a los beneficios del ejercicio para el cerebro siguen siendo principalmente no dilucidados. La mayoría de las actividades físicas y entrenamientos generan aceleraciones mecánicas en la cabeza, al menos hasta cierto punto. Mientras que diversos fenómenos fisiológicos están regulados mecánicamente, la importancia de la carga mecánica ha sido, en la mayoría de los casos, documentada en el sistema musculoesquelético ^3,4,5. Aunque el cerebro también está sujeto a fuerzas mecánicas durante las actividades físicas, particularmente los llamados ejercicios de impacto, la regulación mecánica de la función cerebral fisiológica rara vez se ha estudiado. Debido a que la generación de aceleraciones mecánicas en la cabeza es relativamente común en los entrenamientos físicos, se ha especulado que la regulación mecánica podría estar implicada en los beneficios del ejercicio para las funciones cerebrales.

La señalización del receptor 5-HT_2A es esencial para regular las emociones y los comportamientos entre varias señales bioquímicas que funcionan en el sistema nervioso. Está implicada en múltiples enfermedades psiquiátricas ^6,7,8, en las cuales el ejercicio ha demostrado ser terapéuticamente eficaz. El receptor 5-HT_2A es un subtipo del receptor 5-HT₂ que pertenece a la familia de la serotonina y también es miembro de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), cuya señalización está modulada por su internalización, ya sea dependiente del ligando o independiente⁹. Las contracciones de la cabeza son un comportamiento característico de los roedores, cuya cantidad (frecuencia) representa explícitamente la intensidad de la señalización del receptor 5-HT_2A en sus neuronas de la corteza prefrontal (PFC)^10,11. Aprovechando la estricta especificidad de esta respuesta alucinógena a la 5-HT administrada (respuesta de contracción de la cabeza, en adelante HTR; ver Película Suplementaria 1), se probó la hipótesis mencionada anteriormente sobre las implicaciones mecánicas en los efectos del ejercicio sobre las funciones cerebrales. Por lo tanto, analizamos y comparamos el HTR de ratones sometidos a ejercicio forzado (carrera en cinta rodante) o intervención mecánica que imita el ejercicio (PHM).

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Rehabilitación para Personas con Discapacidades. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho de 8-9 semanas de edad para medir las aceleraciones en la cabeza durante la carrera en cinta rodante y PHM. Se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 9-10 semanas de edad para pruebas de comportamiento y análisis histológicos del PFC. Los animales se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).

1. Medición de magnitudes de aceleraciones a lo largo de los ejes x, y y z durante el funcionamiento en cinta rodante

1. Anestesiar a la rata con inhalación de isoflurano al 1,5%.
   NOTA: Las ratas se utilizaron después de al menos 1 semana de aclimatación al ambiente de laboratorio. Asegúrese de que la rata no responda a un pellizco en el dedo del pie de la extremidad posterior.
2. Fije el acelerómetro (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior de la cabeza de la rata con cinta quirúrgica.
3. Después de la recuperación completa de la anestesia, coloque la rata en la máquina de correr (consulte la Tabla de materiales) y ajuste la cinta de correr a una velocidad moderada (20 m/min)¹² (Figura 1A).
   NOTA: Tomó al menos 20 minutos confirmar la recuperación completa de la rata de la anestesia después de la terminación de la inhalación de isoflurano y comenzar el experimento en la cinta rodante. Asegúrese de que la rata responda a un pellizco en el dedo del pie de la extremidad posterior, pudiendo caminar o correr sin tambalearse aparentemente.
4. Mida la magnitud de las aceleraciones verticales durante el funcionamiento en cinta rodante de rata utilizando el software de aplicación siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Extraiga 10 ondas seriales y calcule individualmente las aceleraciones promedio a lo largo de los ejes tridimensionales (ejes x, y y z, Figura 1B). Las magnitudes máximas se cuantificaron definiendo las ondas sincronizadas por pasos (frecuencia de ~ 2 Hz) como aceleraciones inducidas por la carrera en cinta rodante (Figura 1C). Se utilizaron ratas para este estudio ya que su mayor tamaño corporal era adecuado para medir de manera confiable la aceleración vertical en la cabeza, lo que no era posible en ratones. Sin embargo, los ratones se utilizaron para estudios adicionales debido a la facilidad y fiabilidad con respecto al análisis cuantitativo de la respuesta de contracción de la cabeza.

2. Ajuste del sistema PHM y aplicación de PHM a ratones

1. Preajuste la amplitud de la oscilación de la plataforma y la velocidad de rotación de la leva en forma de hélice en el sistema PHM (Figura 1D) para que la magnitud y la frecuencia de la aceleración vertical coincidan con los valores obtenidos en el paso 1.4.
   NOTA: El sistema PHM comprende una estructura metálica y una plataforma de madera. La velocidad del motor se puede cambiar y controlar ajustando el dial conectado al controlador incorporado (consulte la Tabla de materiales). La escala de dial de 600 corresponde a 2 Hz, Figura 1E. La leva en forma de hélice tiene cuatro palas con alturas de paso de 5 mm (Figura 1F).
2. Anestesiar al ratón mediante inhalación de isoflurano al 1,2%.
   NOTA: Los ratones se utilizaron después de al menos 1 semana de aclimatación a los ambientes de laboratorio. Asegúrese de que el ratón no responda a un pellizco del dedo del pie de la extremidad posterior.
3. Coloque el ratón en posición prona con la cabeza y el resto del cuerpo ubicados en las plataformas oscilable y estática, respectivamente.
   NOTA: Mantener el ratón anestesiado (1,2% de isoflurano).
4. Encienda el motor para oscilar la plataforma verticalmente y aplique PHM al mouse.
   NOTA: La velocidad del motor se ajustó para oscilar la plataforma a 2 Hz (consulte el paso 2.1). Anestesiar y colocar el ratón de control en la plataforma PHM de la misma manera, pero dejar el motor apagado.

3. Funcionamiento del ratón en la cinta de correr

1. Coloque el ratón en la cinta de correr y ajuste la cinta de correr a una velocidad moderada (10 m/min)¹³.

4. Cuantificación de la respuesta de contracción de la cabeza del ratón (HTR)

1. Configure la cámara de vídeo (velocidad de fotogramas: 24 fps) para grabar todo el espacio en la caja de plástico transparente.
   NOTA: La jaula de plástico se utilizó para mantener el ratón en el campo de grabación de vídeo.
2. Administrar por vía intraperitoneal 5-hidroxitriptófano (5-HTP) (100 mg/kg) (ver Tabla de materiales), el precursor de 5-HT, a un ratón.
3. Coloque el ratón en el armazón transparente y comience a grabar durante 30 minutos.
4. Revise el video grabado (velocidad de 1/2x o 1/3x), contando las contracciones de la cabeza manualmente.
   NOTA: Los analistas no estaban cegados al procedimiento experimental. El movimiento rápido característico "similar a un tic" del ratón (ver Película suplementaria 1) se contó como espasmos de cabeza, lo que rara vez ocurre en un entorno normal de reproducción.

5. Análisis inmunohistoquímico de PFC de ratón

1. Una vez completadas las pruebas de HTR, anestesiar al ratón administrando la mezcla de midazolam (4,0 mg/kg), butorfanol (4,0 mg/kg) y medetomidina (0,3 mg/kg), perfundir con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS, y luego extirpar el cerebro siguiendo los informes previamente publicados^14,15.
2. Fije los cerebros en PFA al 4% en PBS durante 24 h adicionales a 4 °C, y guárdelos en sacarosa/PBS al 30% hasta que se hundan. Congele el compuesto de temperatura de corte óptima fijado (compuesto OCT, consulte la Tabla de materiales).
3. Recupere las secciones criogénicas del cerebro del ratón de la caja de diapositivas (consulte la Tabla de materiales). Deje los portaobjetos en toallitas limpias a temperatura ambiente hasta que las muestras se deshidraten por completo.
   NOTA: Se prepararon secciones sagitales de veinte micrómetros de espesor (lateral +0.5–1.5 mm) a partir de muestras congeladas incrustadas en un compuesto OCT utilizando un criostato (ver Tabla de materiales).
4. Use una pluma bloqueadora de líquidos (consulte la Tabla de materiales) para dibujar un círculo alrededor del tejido crioseccionado en el portaobjetos para confinar el área de propagación de la solución (0.1% Tween-20 en solución salina tamponada con Tris (TBS-T).
5. Coloque toallitas húmedas en la parte inferior de una bandeja que contenga los portaobjetos para crear un ambiente húmedo.
6. Después de la permeabilización con TBS-T, bloquear con suero de burro al 4% (ver Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 1 h.
7. Enjuague las diapositivas una vez por inmersión de 5 minutos en TBS-T.
8. Aplique 100 μL de anticuerpo primario adecuadamente diluido y la mezcla DAPI (consulte la Tabla de materiales) en cada portaobjetos, cubra la bandeja para evitar que se seque la muestra e incube durante la noche a temperatura ambiente.
9. Enjuague con TBS-T tres veces (5 minutos de incubación cada una).
10. Aplique 100 μL de anticuerpo secundario fluorescente adecuadamente diluido (conjugado con Alexa Fluor 488, 568 o 645) (consulte la Tabla de materiales) en cada portaobjetos e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
11. Enjuague con TBS-T tres veces (5 minutos de incubación cada una).
12. Monte las diapositivas con medio de montaje (consulte Tabla de materiales). Cubra los portaobjetos con cubreobjetos.
13. Vea la muestra bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados

La magnitud máxima de las aceleraciones verticales en las cabezas de las ratas durante su carrera en cinta a una velocidad moderada (20 m/min) fue de aproximadamente 1,0 × g (Figura 1C). El sistema PHM (Figura 1D) se configuró para generar picos de aceleración vertical de 1,0 × g en las cabezas de los roedores.

La aplicación de PHM (2 Hz, 30 min/día durante 7 días) a ratones atenuó significativamente su HTR ...

Discusión

Utilizando el sistema de aplicación PHM desarrollado, hemos demostrado que la señalización 5-HT en sus neuronas PFC está regulada mecánicamente. Debido a la complejidad de los efectos del ejercicio, ha sido difícil diseccionar con precisión las consecuencias del ejercicio en el contexto de la promoción de la salud. La atención se centra en los aspectos mecánicos para evitar la participación o contribución de eventos metabólicos que pueden ocurrir con o posteriormente a las actividades de ejercicio, como el c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice