Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Resumo

O presente protocolo descreve um sistema personalizado de "movimento passivo da cabeça", que reproduz acelerações mecânicas nas cabeças dos roedores geradas durante a corrida em esteira a velocidades moderadas. Permite dissecar fatores/elementos mecânicos dos efeitos benéficos do exercício físico.

Resumo

O exercício é amplamente reconhecido como eficaz para várias doenças e distúrbios físicos, incluindo aqueles relacionados à disfunção cerebral. No entanto, os mecanismos moleculares por trás dos efeitos benéficos do exercício são pouco compreendidos. Muitos exercícios físicos, particularmente aqueles classificados como exercícios aeróbicos, como correr e caminhar, produzem forças impulsivas no momento do contato do pé com o solo. Portanto, especulou-se que o impacto mecânico poderia estar implicado em como o exercício contribui para a homeostase do organismo. Para testar essa hipótese no cérebro, foi desenvolvido um sistema personalizado de "movimento passivo da cabeça" (doravante referido como PHM) que pode gerar acelerações verticais com magnitudes e modos controlados e definidos e reproduzir a estimulação mecânica que pode ser aplicada às cabeças de roedores durante a corrida em esteira a velocidades moderadas, uma intervenção típica para testar os efeitos do exercício em animais. Usando este sistema, foi demonstrado que o PHM recapitula a serotonina (5-hidroxitriptamina, doravante referida como 5-HT) receptor subtipo 2A (5-HT_2A) sinalizando nos neurônios do córtex pré-frontal (PFC) de camundongos. Este trabalho fornece protocolos detalhados para a aplicação de PHM e medição de suas acelerações mecânicas resultantes em cabeças de roedores.

Introdução

O exercício é benéfico para tratar ou prevenir diversos distúrbios físicos, incluindo doenças do estilo de vida, como diabetes mellitus e hipertensão essencial¹. Relacionado a isso, também foram acumuladas evidências sobre os efeitos positivos do exercício sobre as funções cerebrais². No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos benefícios do exercício para o cérebro permanecem principalmente não elucidados. A maioria das atividades físicas e treinos geram acelerações mecânicas na cabeça, pelo menos até certo ponto. Enquanto vários fenômenos fisiológicos são regulados mecanicamente, a importância da carga mecânica tem, na maioria dos casos, sido documentada no sistema musculoesquelético ^3,4,5. Embora o cérebro também seja submetido a forças mecânicas durante as atividades físicas, particularmente os chamados exercícios de impacto, a regulação mecânica da função cerebral fisiológica raramente foi estudada. Como a geração de acelerações mecânicas na cabeça é relativamente comum aos exercícios físicos, especula-se que a regulação mecânica possa estar implicada nos benefícios do exercício para as funções cerebrais.

A sinalização do receptor 5-HT_2A é essencial na regulação de emoções e comportamentos entre vários sinais bioquímicos que funcionam no sistema nervoso. Está envolvida em múltiplas doenças psiquiátricas ^6,7,8, nas quais o exercício tem se mostrado terapeuticamente eficaz. O receptor 5-HT_2A é um subtipo de receptor 5-HT₂ que pertence à família da serotonina e também é um membro da família do receptor acoplado à proteína G (GPCR), cuja sinalização é modulada por sua internalização, dependente de ligantes ou independente⁹. O espasmo da cabeça é um comportamento característico dos roedores, cuja quantidade (frequência) representa explicitamente a intensidade da sinalização do receptor 5-HT_2A em seus neurônios do córtex pré-frontal (PFC)^10,11. Aproveitando a estrita especificidade desta resposta alucinógena à 5-HT administrada (resposta de contração da cabeça, doravante referida como HTR; ver Filme Suplementar 1), a hipótese mencionada acima sobre as implicações mecânicas nos efeitos do exercício nas funções cerebrais foi testada. Assim, analisamos e comparamos o HTR de camundongos submetidos a exercício forçado (corrida em esteira) ou intervenção mecânica que imita o exercício (PHM).

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Nacional de Reabilitação para Pessoas com Deficiência. Ratos Sprague-Dawley machos de 8-9 semanas de idade foram usados para medir acelerações na cabeça durante a corrida em esteira e PHM. Camundongos C57BL/6 machos de 9-10 semanas de idade foram utilizados para testes de comportamento e análises histológicas do PFC. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Medição das magnitudes das acelerações ao longo dos eixos x, y e z durante a corrida em esteira

1. Anestesiar o rato com inalação de isoflurano a 1,5%.
   NOTA: Os ratos foram utilizados após pelo menos 1 semana de aclimatação ao ambiente laboratorial. Certifique-se de que o rato não está respondendo a uma pitada do dedo do pé do membro posterior.
2. Fixe o acelerômetro (consulte Tabela de materiais) no topo da cabeça do rato usando fita cirúrgica.
3. Após a recuperação completa da anestesia, colocar o rato na máquina de esteira (ver Tabela de Materiais) e ajustar a esteira a uma velocidade moderada (20 m/min)¹² (Figura 1A).
   NOTA: Demorou pelo menos 20 minutos para confirmar a recuperação completa do rato da anestesia após o término da inalação de isoflurano e iniciar o experimento na esteira. Certifique-se de que o rato é responsivo a um beliscão do dedo do pé do membro posterior, sendo capaz de andar ou correr sem cambaleamento aparente.
4. Meça a magnitude das acelerações verticais durante a corrida em esteira de ratos usando o software aplicativo seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de materiais).
   NOTA: Extraia 10 ondas seriais e calcule individualmente as acelerações médias ao longo dos eixos tridimensionais (eixos x, y e z, Figura 1B). As magnitudes de pico foram quantificadas definindo ondas sincronizadas com degraus (frequência ~2 Hz) como acelerações induzidas por corrida em esteira (Figura 1C). Ratos foram usados para este estudo, pois seu tamanho corporal maior era adequado para medir de forma confiável a aceleração vertical na cabeça, o que não era possível em camundongos. No entanto, camundongos foram usados para estudos posteriores devido à facilidade e confiabilidade em relação à análise quantitativa da resposta de contração da cabeça.

2. Ajuste do sistema PHM e aplicação do PHM em camundongos

1. Pré-defina a amplitude da oscilação da plataforma e a velocidade de rotação do came, em forma de hélice, no sistema PHM (Figura 1D), de modo que a magnitude e a frequência da aceleração vertical correspondam aos valores obtidos na etapa 1.4.
   NOTA: O sistema PHM é composto por uma estrutura metálica e plataforma de madeira. A velocidade do motor pode ser alterada e controlada ajustando o mostrador ligado ao condutor incorporado (ver Tabela de Materiais). A escala de discagem de 600 corresponde a 2 Hz, Figura 1E. O comando em forma de hélice tem quatro pás com alturas de degrau de 5 mm (Figura 1F).
2. Anestesiar o ratinho através da inalação de isoflurano a 1,2%.
   NOTA: Os ratos foram utilizados após pelo menos 1 semana de aclimatação aos ambientes de laboratório. Certifique-se de que o rato não responde a uma pinça do dedo do pé do membro posterior.
3. Coloque o rato em posição prona com a cabeça e o resto do corpo localizados nas plataformas osciláveis e estáticas, respetivamente.
   NOTA: Mantenha o rato anestesiado (1,2% de isoflurano).
4. Ligue o motor para oscilar a plataforma verticalmente e aplique PHM no mouse.
   NOTA: A velocidade do motor foi ajustada para oscilar a plataforma a 2 Hz (ver passo 2.1). Anestesiar e colocar o mouse de controle na plataforma PHM da mesma forma, mas deixe o motor desligado.

3. Corrida do mouse na esteira

1. Coloque o mouse na máquina de esteira e ajuste a esteira para uma velocidade moderada (10 m/min)¹³.

4. Quantificação da resposta de contração da cabeça do rato (HTR)

1. Configure a câmera de vídeo (taxa de quadros: 24 fps) para gravar todo o espaço na caixa de plástico transparente.
   NOTA: A gaiola de plástico foi usada para manter o mouse no campo da gravação de vídeo.
2. Por via intraperitoneal, administrar 5-hidroxitriptofano (5-HTP) (100 mg/kg) (ver Tabela de Materiais), o precursor do 5-HT, a um rato.
3. Coloque o mouse na gaiola transparente e comece a gravar por 30 minutos.
4. Revise o vídeo gravado (velocidade de 1/2x ou 1/3x), contando a cabeça se contorcendo manualmente.
   NOTA: Os analistas não estavam cegos para o procedimento experimental. O movimento rápido característico do rato "semelhante a um tique" (ver Filme Suplementar 1) foi contado como espasmos na cabeça, o que raramente ocorre em ambiente normal de reprodução.

5. Análise imuno-histoquímica do PFC de camundongos

1. Uma vez concluídos os testes de HTR, anestesiar o camundongo administrando a mistura de midazolam (4,0 mg/kg), butorfanol (4,0 mg/kg) e medetomidina (0,3 mg/kg), perfundir com paraformaldeído (PFA) a 4% na PBS e, em seguida, extirpar o cérebro seguindo relatos publicados anteriormente^14,15.
2. Pós-fixe os cérebros em 4% de PFA em PBS por mais 24 h a 4 °C e armazene em 30% de sacarose/PBS até afundar. Congelar o composto de temperatura de corte ideal fixo (composto OCT, ver Tabela de Materiais).
3. Recupere as crioseções do cérebro do rato a partir da caixa de diapositivo (consulte Tabela de Materiais). Deixe as lâminas em toalhetes limpos à temperatura ambiente até que as amostras desidratem completamente.
   NOTA: Cortes sagitais de vinte micrômetros de espessura (Lateral +0,5–1,5 mm) foram preparados a partir de amostras congeladas embutidas em composto OCT usando um criostato (ver Tabela de Materiais).
4. Use uma caneta bloqueadora de líquido (ver Tabela de Materiais) para desenhar um círculo em torno do tecido crioseccionado na lâmina para confinar a área de propagação da solução (Tween-20 a 0,1% em solução salina tamponada com Tris (TBS-T).
5. Coloque lenços umedecidos na parte inferior de uma bandeja que segura os slides para criar um ambiente úmido.
6. Após permeabilização com TBS-T, bloqueie com soro de burro a 4% (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente por 1 h.
7. Enxaguar as lâminas uma vez por imersão de 5 minutos em TBS-T.
8. Aplicar 100 μL de anticorpo primário adequadamente diluído e misturar DAPI (ver Tabela de Materiais) em cada lâmina, cobrir a bandeja para evitar a secagem da amostra e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
9. Enxaguar com TBS-T três vezes (5 min de incubação cada).
10. Aplicar 100 μL de anticorpo secundário fluorescente compatível com espécies adequadamente diluídas (conjugado com Alexa Fluor 488, 568 ou 645) (ver Tabela de Materiais) em cada lâmina e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
11. Enxaguar com TBS-T três vezes (5 min de incubação cada).
12. Monte as corrediças com meio de montagem (consulte Tabela de materiais). Cubra os slides com folhas de cobertura.
13. Veja a amostra sob um microscópio de fluorescência.

Resultados

A magnitude máxima das acelerações verticais na cabeça dos ratos durante a corrida em esteira a uma velocidade moderada (20 m/min) foi de aproximadamente 1,0 × g (Figura 1C). O sistema PHM (Figura 1D) foi montado para gerar picos de aceleração vertical de 1,0 × g na cabeça dos roedores.

A aplicação de PHM (2 Hz, 30 min/dia por 7 dias) em camundongos atenuou significativamente seu HTR em comparação com os...

Discussão

Usando o sistema de aplicação PHM desenvolvido, mostramos que a sinalização 5-HT em seus neurônios PFC é regulada mecanicamente. Devido à complexidade dos efeitos do exercício, tem sido difícil dissecar com precisão as consequências do exercício no contexto da promoção da saúde. O foco está em aspectos mecânicos para impedir o envolvimento ou a contribuição de eventos metabólicos que possam ocorrer com ou posteriormente às atividades de exercício, como o consumo de energia. Espera-se que o método d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice