Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein speziell entwickeltes "passives Kopfbewegungssystem", das mechanische Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren reproduziert, die während ihres Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten erzeugt werden. Es ermöglicht es, mechanische Faktoren / Elemente von den positiven Auswirkungen körperlicher Bewegung zu trennen.

Zusammenfassung

Bewegung ist weithin als wirksam für verschiedene Krankheiten und körperliche Störungen anerkannt, einschließlich solcher, die mit Hirnfunktionsstörungen zusammenhängen. Die molekularen Mechanismen hinter den positiven Auswirkungen von Bewegung sind jedoch kaum verstanden. Viele körperliche Trainingseinheiten, insbesondere solche, die als Aerobic-Übungen wie Joggen und Gehen eingestuft werden, erzeugen impulsive Kräfte zum Zeitpunkt des Fußkontakts mit dem Boden. Daher wurde spekuliert, dass mechanische Einflüsse daran beteiligt sein könnten, wie Bewegung zur homöostase des Organismus beiträgt. Um diese Hypothese am Gehirn zu testen, wurde ein maßgeschneidertes "passives Kopfbewegungssystem" (im Folgenden als PHM bezeichnet) entwickelt, das vertikale Beschleunigungen mit kontrollierten und definierten Größenordnungen und Modi erzeugen und mechanische Stimulation reproduzieren kann, die während des Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten auf die Köpfe von Nagetieren angewendet werden kann, eine typische Intervention, um die Auswirkungen von Bewegung bei Tieren zu testen. Durch die Verwendung dieses Systems wurde gezeigt, dass PHM den Serotonin (5-Hydroxytryptamin, im Folgenden als 5-HT) bezeichnet) Rezeptor Subtyp 2A (5-HT_2A) Signalweg in den präfrontalen Kortex (PFC) Neuronen von Mäusen rekapituliert. Diese Arbeit liefert detaillierte Protokolle für die Anwendung von PHM und die Messung der daraus resultierenden mechanischen Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren.

Einleitung

Bewegung ist vorteilhaft, um verschiedene körperliche Störungen zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich Zivilisationskrankheiten wie Diabetes mellitus und essentielle Hypertonie¹. In diesem Zusammenhang wurden auch Beweise für die positiven Auswirkungen von Bewegung auf die Gehirnfunktionen gesammelt². Die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Bewegung für das Gehirn zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend ungeklärt. Die meisten körperlichen Aktivitäten und Workouts erzeugen zumindest teilweise mechanische Beschleunigungen am Kopf. Während verschiedene physiologische Phänomene mechanisch reguliert werden, ist die Bedeutung der mechanischen Belastung in den meisten Fällen im Bewegungsapparat^{dokumentiert 3,4,5}. Obwohl das Gehirn auch bei körperlichen Aktivitäten, insbesondere sogenannten Schlagübungen, mechanischen Kräften ausgesetzt ist, wurde die mechanische Regulation der physiologischen Gehirnfunktion bisher kaum untersucht. Da die Erzeugung mechanischer Beschleunigungen am Kopf bei körperlichem Training relativ häufig ist, wurde spekuliert, dass mechanische Regulierung an den Vorteilen von Bewegung für die Gehirnfunktionen beteiligt sein könnte.

5-HT_{2A-Rezeptorsignale} sind essentiell für die Regulierung von Emotionen und Verhaltensweisen zwischen verschiedenen biochemischen Signalen, die im Nervensystem funktionieren. Es ist an multiplen psychiatrischen Erkrankungen ^6,7,8 beteiligt^, bei denen sich Bewegung als therapeutisch wirksam erwiesen hat. 5-HT_2A-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT_2-Rezeptors, der zur Serotonin-Familie gehört und auch ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie (GPCR) ist, deren Signalisierung durch seine Internalisierung moduliert wird, entweder ligandenabhängig oder -unabhängig⁹. Kopfzucken ist ein charakteristisches Verhalten von Nagetieren, dessen Menge (Frequenz) explizit die Intensität der 5-HT_{2A-Rezeptorsignalisierung} in ihren präfrontalen Kortex (PFC) Neuronen^{darstellt 10,11}. Unter Ausnutzung der strengen Spezifität dieser halluzinogenen Reaktion auf verabreichtes 5-HT (Kopfzuckenreaktion, im Folgenden als HTR bezeichnet; siehe Ergänzender Film 1) wurde die oben erwähnte Hypothese über mechanische Auswirkungen von Trainingseffekten auf Gehirnfunktionen getestet. Daher analysierten und verglichen wir die HTR von Mäusen, die entweder erzwungenen Übungen (Laufbandlauf) oder übungsnachahmenden mechanischen Eingriffen (PHM) unterzogen wurden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities genehmigt. 8-9 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet, um Beschleunigungen am Kopf während des Laufbandlaufs und PHM zu messen. 9-10 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse wurden für Verhaltenstests und histologische Analysen der PFC verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Messung von Beschleunigungen entlang der x-, y- und z-Achse während des Laufbandlaufs

1. Anästhesieren Sie die Ratte mit Inhalation von 1,5% Isofluran.
   HINWEIS: Die Ratten wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebung verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert.
2. Befestigen Sie den Beschleunigungsmesser (siehe Materialtabelle) mit chirurgischem Klebeband auf dem Kopf der Ratte.
3. Nach vollständiger Erholung von der Narkose setzen Sie die Ratte in die Laufbandmaschine (siehe Materialtabelle) und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (20 m/min)¹² ein (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Es dauerte mindestens 20 Minuten, um die vollständige Erholung der Ratte von der Anästhesie nach Beendigung der Isofluran-Inhalation zu bestätigen und das Laufbandexperiment zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Ratte auf eine Zehenklemmung der Hinterbeine reagiert und in der Lage ist, ohne offensichtliches Taumeln zu gehen oder zu laufen.
4. Messen Sie die Größe der vertikalen Beschleunigungen während des Laufbandlaufs von Ratten mit der Anwendungssoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Extrahieren Sie 10 serielle Wellen und berechnen Sie individuell die durchschnittlichen Beschleunigungen entlang der 3-dimensionalen Achsen (x-, y- und z-Achsen, Abbildung 1B). Die Spitzengrößen wurden quantifiziert, indem schrittsynchronisierte Wellen (~2 Hz-Frequenz) als laufbandinduzierte Beschleunigungen definiert wurden (Abbildung 1C). Für diese Studie wurden Ratten verwendet, da ihre größere Körpergröße geeignet war, die vertikale Beschleunigung am Kopf zuverlässig zu messen, was bei Mäusen nicht möglich war. Mäuse wurden jedoch für weitere Studien verwendet, da die quantitative Analyse der Kopfzuckenreaktion einfach und zuverlässig ist.

2. Anpassung des PHM-Systems und Anwendung von PHM an Mäusen

1. Stellen Sie die Amplitude der Schwingung der Plattform und die Rotationsgeschwindigkeit der propellerförmigen Nocke im PHM-System vor (Abbildung 1D), so dass Größe und Frequenz der vertikalen Beschleunigung mit den in Schritt 1.4 erhaltenen Werten übereinstimmen.
   HINWEIS: Das PHM-System besteht aus einem Metallrahmen und einer Holzplattform. Die Motordrehzahl kann durch Einstellen des an den eingebauten Treiber angeschlossenen Drehrads geändert und gesteuert werden (siehe Materialtabelle). Die Zifferblattskala von 600 entspricht 2 Hz, Abbildung 1E. Die propellerförmige Nocke hat vier Blätter mit 5 mm Stufenhöhe (Bild 1F).
2. Betäuben Sie die Maus durch Einatmen von 1,2% Isofluran.
   HINWEIS: Mäuse wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebungen verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert.
3. Platzieren Sie die Maus in einer Bauchlage, wobei sich der Kopf und der Rest des Körpers auf der oszillierbaren bzw. statischen Plattform befinden.
   HINWEIS: Halten Sie die Maus betäubt (1,2% Isofluran).
4. Schalten Sie den Motor ein, um die Plattform vertikal zu oszillieren, und wenden Sie PHM auf die Maus an.
   HINWEIS: Die Motordrehzahl wurde so eingestellt, dass die Plattform mit 2 Hz oszilliert wird (siehe Schritt 2.1). Betäuben und platzieren Sie die Steuermaus ebenfalls auf der PHM-Plattform, aber lassen Sie den Motor aus.

3. Laufen der Maus auf dem Laufband

1. Setzen Sie die Maus auf das Laufband und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (10 m/min)¹³ ein.

4. Quantifizierung der Kopfzuckenreaktion der Maus (HTR)

1. Richten Sie die Videokamera (Bildrate: 24 fps) so ein, dass sie den gesamten Raum im transparenten Kunststoffgehäuse aufzeichnet.
   HINWEIS: Der Kunststoffkäfig wurde verwendet, um die Maus im Bereich der Videoaufzeichnung zu halten.
2. Intraperitoneal 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) (100 mg/kg) (siehe Materialtabelle), die Vorstufe von 5-HT, einer Maus verabreichen.
3. Legen Sie die Maus in den transparenten Käfig und starten Sie die Aufnahme für 30 Minuten.
4. Überprüfen Sie das aufgenommene Video (1/2x oder 1/3x Geschwindigkeit) und zählen Sie das Kopfzucken manuell.
   HINWEIS: Die Analytiker waren nicht blind für das experimentelle Verfahren. Die charakteristische "Tic-ähnliche" schnelle Bewegung der Maus (siehe Ergänzender Film 1) wurde als Kopfzucken gezählt, das unter normaler Brutumgebung selten auftritt.

5. Immunhistochemische Analyse von Maus-PFC

1. Sobald die HTR-Tests abgeschlossen sind, betäuben Sie die Maus, indem Sie die Mischung aus Midazolam (4,0 mg / kg), Butorphanol (4,0 mg / kg) und Medetomidin (0,3 mg / kg) verabreichen, Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS und entfernen Sie dann das Gehirn nach zuvor veröffentlichten Berichten^14,15.
2. Die Gehirne in 4% PFA in PBS für weitere 24 Stunden bei 4 °C nachfixieren und in 30% Saccharose/PBS lagern, bis sie sinken. Frieren Sie die fixierte optimale Schnitttemperaturmischung (OCT-Mischung, siehe Materialtabelle) ein.
3. Rufen Sie die Kryoschnitte des Mausgehirns aus der Folienbox ab (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Objektträger auf sauberen Tüchern bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig dehydriert sind.
   HINWEIS: Zwanzig Mikrometer dicke sagittale Abschnitte (lateral +0,5–1,5 mm) wurden aus gefrorenen Proben, die in OCT-Verbindung eingebettet sind, unter Verwendung eines Kryostaten hergestellt (siehe Materialtabelle).
4. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblockerstift (siehe Materialtabelle), um einen Kreis um das kryogeschnittene Gewebe auf dem Objektträger zu zeichnen, um den Ausbreitungsbereich der Lösung einzuschließen (0,1% Tween-20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS-T).
5. Legen Sie angefeuchtete Tücher auf den Boden eines Tabletts, in dem sich die Objektträger befinden, um eine feuchte Umgebung zu schaffen.
6. Nach der Permeabilisierung mit TBS-T mit 4% Eselserum (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 h blockieren.
7. Spülen Sie die Objektträger einmal durch 5 min Eintauchen in TBS-T.
8. Tragen Sie 100 μL entsprechend verdünnten primären Antikörper und DAPI-Mischung (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf, decken Sie das Tablett ab, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
9. Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
10. Tragen Sie 100 μL eines entsprechend verdünnten speziespassenden fluoreszierenden Sekundärantikörpers (konjugiert mit Alexa Fluor 488, 568 oder 645) (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur.
11. Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
12. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium (siehe Materialtabelle). Bedecken Sie die Dias mit Deckgläsern.
13. Betrachten Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Die Spitzengröße der vertikalen Beschleunigungen an den Köpfen der Ratten während ihres Laufbandlaufs mit moderater Geschwindigkeit (20 m/min) betrug etwa 1,0 × g (Abbildung 1C). Das PHM-System (Abbildung 1D) wurde eingerichtet, um vertikale Beschleunigungsspitzen von 1,0 × g an den Köpfen der Nagetiere zu erzeugen.

Die PHM-Anwendung (2 Hz, 30 min/Tag für 7 Tage) an Mäusen dämpfte ihre HTR im Vergleich zu d...

Diskussion

Mit dem entwickelten PHM-Applikationssystem haben wir gezeigt, dass die 5-HT-Signalisierung in ihren PFC-Neuronen mechanisch reguliert wird. Aufgrund der Komplexität der Bewegungseffekte war es schwierig, die Folgen von Bewegung im Rahmen der Gesundheitsförderung genau zu analysieren. Der Fokus liegt auf mechanischen Aspekten, um die Beteiligung oder den Beitrag von Stoffwechselereignissen auszuschließen, die mit oder nach Trainingsaktivitäten auftreten können, wie z.B. Energieverbrauch. Es wird erwartet, dass die h...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice