설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

요약

본 프로토콜은 적당한 속도로 러닝머신을 달리는 동안 생성된 설치류의 머리에서 기계적 가속도를 재현하는 맞춤형 '패시브 헤드 모션'' 시스템을 설명합니다. 그것은 신체 운동의 유익한 효과로부터 기계적 요인 / 요소를 해부 할 수 있습니다.

초록

운동은 뇌 기능 장애와 관련된 것을 포함하여 다양한 질병 및 신체 장애에 효과적인 것으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 운동의 유익한 효과 뒤에 있는 분자 메커니즘은 제대로 이해되지 않았습니다. 많은 신체 운동, 특히 조깅 및 걷기와 같은 유산소 운동으로 분류되는 운동은 발이 지면에 닿을 때 충동적인 힘을 생성합니다. 따라서 기계적 충격은 운동이 유기체 항상성에 어떻게 기여하는지에 연루될 수 있다고 추측되었습니다. 뇌에 대한 이 가설을 테스트하기 위해 제어되고 정의된 크기와 모드로 수직 가속도를 생성하고 동물의 운동 효과를 테스트하기 위한 전형적인 개입인 적당한 속도로 러닝머신을 달리는 동안 설치류의 머리에 적용될 수 있는 기계적 자극을 재현할 수 있는 맞춤형 설계된 ''수동 머리 움직임''(이하 PHM이라고 함) 시스템이 개발되었습니다. 이 시스템을 사용함으로써 PHM은 마우스의 전두엽 피질 (PFC) 뉴런에서 세로토닌 (5- 하이드 록시 트립 타민, 이하 5-HT라고 함) 수용체 아형 2A (5-HT_2A) 신호 전달을 요약한다는 것이 입증되었습니다. 이 작업은 PHM을 적용하고 설치류의 머리에서 그에 따른 기계적 가속도를 측정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

운동은 당뇨병 및 본태성 고혈압과 같은 생활 습관병을 포함한 여러 신체 장애를 치료하거나 예방하는 데 유익^합니다1. 이와 관련하여 운동이 뇌 기능에 미치는 긍정적 인 효과에 대한 증거도 축적되었습니다². 그러나 뇌에 대한 운동의 이점의 기초가되는 분자 메커니즘은 주로 밝혀지지 않은 채로 남아 있습니다. 대부분의 신체 활동과 운동은 적어도 어느 정도는 머리에 기계적 가속을 생성합니다. 다양한 생리 현상이 기계적으로 조절되는 반면, 기계적 하중의 중요성은 대부분의 경우 근골격계 ^3,4,5에 문서화되어 있습니다. 뇌는 신체 활동, 특히 소위 충격 운동 중에 기계적 힘을 받지만 생리적 뇌 기능의 기계적 조절은 거의 연구되지 않았습니다. 머리에서 기계적 가속의 생성은 신체 운동에 비교적 일반적이기 때문에 기계적 조절이 뇌 기능에 대한 운동의 이점과 관련이 있을 수 있다고 추측되었습니다.

5-HT_2A 수용체 신호 전달은 신경계에서 기능하는 다양한 생화학 신호 중에서 감정과 행동을 조절하는 데 필수적입니다. 그것은 운동이 치료 적으로 효과적인 것으로 입증 된 여러 정신 질환 ^6,7,8에 관여합니다. 5-HT_2A 수용체는 세로토닌 계열에 속하는 5-HT₂ 수용체의 하위 유형이며 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 계열의 구성원이기도하며, 그 신호 전달은 리간드 의존성 또는^비의존성 9. 머리 경련은 설치류의 특징적인 행동이며, 그 양 (빈도)은 전두엽 피질 (PFC) 뉴런^10,11에서 5-HT_2A 수용체 신호 전달의 강도를 명시 적으로 나타냅니다. 투여 된 5-HT (머리-경련 반응, 이하 HTR이라고 함)에 대한이 환각 반응의 엄격한 특이성을 이용하여 뇌 기능에 대한 운동 효과의 기계적 의미에 대해 위에서 언급 한 가설을 테스트했습니다. 따라서, 우리는 강제 운동 (러닝 머신 달리기) 또는 운동 모방 기계적 개입 (PHM)을받은 마우스의 HTR을 분석하고 비교했다.

프로토콜

모든 동물 실험은 국립 장애인 재활 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 8-9 주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐는 러닝 머신 달리기 및 PHM 동안 머리에서 가속도를 측정하는 데 사용되었습니다. 9-10주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 PFC의 행동 시험 및 조직학적 분석에 사용하였다. 동물은 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조).

1. 트레드밀 주행 중 x축, y축, z축을 따른 가속도 크기 측정

1. 1.5 % 이소 플루 란을 흡입하여 쥐를 마취하십시오.
   참고: 래트는 실험실 환경에 순응한 지 적어도 1주일 후에 사용하였다. 쥐가 뒷다리 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하십시오.
2. 수술 용 테이프를 사용하여 가속도계 ( 재료 표 참조)를 쥐의 머리 위에 고정하십시오.
3. 마취에서 완전히 회복 된 후 쥐를 러닝 머신 기계 ( 재료 표 참조)에 넣고 트레드 밀링을 적당한 속도 (20m / min) ¹² 로 조정합니다 (그림 1A).
   참고: 이소플루란 흡입이 종료된 후 마취에서 쥐의 완전한 회복을 확인하고 트레드밀 실험을 시작하는 데 최소 20분이 걸렸습니다. 쥐가 뒷다리 발가락 꼬집음에 반응하여 명백한 비틀거림 없이 걷거나 달릴 수 있는지 확인하십시오.
4. 제조업체의 지침에 따라 응용 소프트웨어를 사용하여 쥐 러닝머신을 실행하는 동안 수직 가속도의 크기를 측정합니다( 재료 표 참조).
   참고: 10개의 직렬 파동을 추출하고 3차원 축(x축, y축 및 z축, 그림 1B)을 따라 평균 가속도를 개별적으로 계산합니다. 피크 크기는 스테핑 동기화 파 (~ 2Hz 주파수)를 러닝 머신 주행 유도 가속으로 정의하여 정량화되었습니다 (그림 1C). 쥐는 몸집이 더 큰 것이 머리에서 수직 가속도를 안정적으로 측정하는 데 적합했기 때문에 이 연구에 사용되었는데, 이는 생쥐에서는 불가능했습니다. 그러나 마우스는 머리 경련 반응의 정량적 분석에 관한 용이성과 신뢰성 때문에 추가 연구에 사용되었습니다.

2. PHM 시스템의 조정 및 마우스에 대한 PHM의 적용

1. PHM 시스템(그림 1D)에서 플랫폼 진동의 진폭과 프로펠러 모양의 캠의 회전 속도를 미리 설정하여 수직 가속도의 크기와 주파수가 1.4단계에서 얻은 값과 일치하도록 합니다.
   알림: PHM 시스템은 금속 프레임워크와 목재 플랫폼으로 구성됩니다. 모터 속도는 내장 드라이버에 연결된 다이얼을 조정하여 변경 및 제어할 수 있습니다( 재료 표 참조). 다이얼 스케일 600은 2Hz에 해당합니다( 그림 1E). 프로펠러 모양의 캠에는 스텝 높이가 5mm인 4개의 블레이드가 있습니다(그림 1F).
2. 1.2 % 이소 플루 란의 흡입 을 통해 마우스를 마취하십시오.
   참고: 마우스는 실험실 환경에 적응한 지 최소 1주일 후에 사용하였다. 마우스가 뒷다리 발가락 꼬임에 반응하지 않는지 확인하십시오.
3. 마우스는 머리와 몸의 나머지 부분이 각각 발진 가능한 플랫폼과 정적 플랫폼에 위치하도록 엎드린 위치에 놓습니다.
   참고: 마우스를 마취된 상태로 유지하십시오(1.2% 이소플루란).
4. 모터를 켜서 플랫폼을 수직으로 진동시키고 PHM을 마우스에 적용합니다.
   알림: 모터 속도는 플랫폼을 2Hz로 진동하도록 조정되었습니다(2.1단계 참조). 마찬가지로 마취하고 제어 마우스를 PHM 플랫폼에 놓되 모터는 꺼진 상태로 둡니다.

3. 러닝 머신에서 마우스 달리기

1. 트레드밀 머신에 마우스를 놓고 트레드밀링을 적당한 속도(10m/분)¹³로 조정합니다.

4. 마우스 머리 경련 반응(HTR)의 정량화

1. 비디오 카메라(프레임 속도: 24fps)를 설정하여 투명 플라스틱 케이스에 전체 공간을 녹화합니다.
   참고: 플라스틱 케이지는 마우스를 비디오 녹화 필드에 유지하는 데 사용되었습니다.
2. 5-HT의 전구체인 5-하이드록시트립토판(5-HTP)(100mg/kg)( 재료 표 참조)을 마우스에 복강 내 투여합니다.
3. 마우스를 투명 케이지에 넣고 30분 동안 녹화를 시작합니다.
4. 녹화된 비디오(1/2x 또는 1/3x 속도)를 검토하고 수동으로 헤드가 꼬이는 횟수를 계산합니다.
   참고 : 분석가는 실험 절차에 눈이 멀지 않았습니다. 마우스의 특징적인 "틱과 같은" 빠른 움직임( 보충 영화 1 참조)은 정상적인 사육 환경에서는 거의 발생하지 않는 머리 경련으로 계산되었습니다.

5. 마우스 PFC의 면역조직화학적 분석

1. HTR 검사가 완료되면 미다졸람(4.0mg/kg), 부토르파놀(4.0mg/kg) 및 메데토미딘(0.3mg/kg)의 혼합물을 투여하여 마우스를 마취시키고 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)와 관류한 다음 이전에 발표된 보고서^14,15에 따라 뇌를 절제합니다.
2. 뇌를 PBS의 4% PFA에 4°C에서 추가로 24시간 동안 고정하고 가라앉을 때까지 30% 자당/PBS에 보관합니다. 고정 된 최적 절단 온도 컴파운드 (OCT 컴파운드, 재료 표 참조)를 동결하십시오.
3. 슬라이드 상자에서 마우스 뇌의 냉동 섹션을 검색합니다( 재료 표 참조). 샘플이 완전히 탈수될 때까지 슬라이드를 실온에서 깨끗한 물티슈에 그대로 두십시오.
   참고: 20마이크로미터 두께의 시상 절편(측면 +0.5–1.5mm)은 저온 유지 장치를 사용하여 OCT 화합물에 내장된 냉동 샘플에서 준비되었습니다( 재료 표 참조).
4. 액체 차단제 펜 ( 재료 표 참조)을 사용하여 슬라이드의 냉동 절단 조직 주위에 원을 그려 용액의 확산 영역을 제한합니다 (트리스 완충 식염수 (TBS-T)에서 0.1 % Tween-20).
5. 젖은 물티슈를 슬라이드를 고정하는 트레이 바닥에 놓아 촉촉한 환경을 조성합니다.
6. TBS-T로 투과화 후 실온에서 1 시간 동안 4 % 당나귀 혈청 ( 재료 표 참조)으로 차단합니다.
7. 슬라이드를 TBS-T에 5분 동안 담그고 한 번 헹굽니다.
8. 적절하게 희석된 1차 항체와 DAPI( 재료 표 참조) 혼합물 100μL를 각 슬라이드에 적용하고 샘플이 건조되지 않도록 트레이를 덮고 실온에서 밤새 배양합니다.
9. TBS-T로 3 번 헹굽니다 (각각 5 분 배양).
10. 적절하게 희석된 종 일치 형광 2차 항체(Alexa Fluor 488, 568 또는 645와 접합)( 재료 표 참조) 100μL를 각 슬라이드에 적용하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
11. TBS-T로 3 번 헹굽니다 (각각 5 분 배양).
12. 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다( 재료 표 참조). 슬라이드를 커버 슬립으로 덮으십시오.
13. 형광 현미경으로 샘플을 봅니다.

결과

적당한 속도 (20m / min)로 달리는 러닝 머신 동안 쥐의 머리에서 수직 가속도의 최대 크기는 약 1.0 × g 이었습니다 (그림 1C). PHM 시스템 (그림 1D)은 설치류의 머리에서 1.0 × g 의 수직 가속 피크를 생성하도록 설정되었습니다.

마우스에 PHM 적용(2Hz, 7일 동안 30분/일)은 대조군 마우스(7일 동안 PHM 없이 매일 30분/일 동안 마?...

토론

개발 된 PHM 응용 시스템을 사용하여 PFC 뉴런의 5-HT 신호 전달이 기계적으로 조절된다는 것을 보여주었습니다. 운동 효과의 복잡성 때문에 건강 증진의 맥락에서 운동의 결과를 정확하게 해부하는 것이 어려웠습니다. 초점은 에너지 소비와 같은 운동 활동과 함께 또는 이후에 발생할 수있는 대사 사건의 참여 또는 기여를 배제하기위한 기계적 측면에 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 뇌 기능에 대...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice