JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת "תנועת ראש פסיבית" שתוכננה בהתאמה אישית, המשחזרת תאוצות מכניות בראשי מכרסמים הנוצרים במהלך ריצת ההליכון שלהם במהירויות מתונות. הוא מאפשר לנתח גורמים/אלמנטים מכניים מההשפעות החיוביות של פעילות גופנית.

Abstract

פעילות גופנית מוכרת באופן נרחב כיעילה עבור מחלות שונות והפרעות פיזיות, כולל אלה הקשורות לתפקוד לקוי של המוח. עם זאת, מנגנונים מולקולריים מאחורי ההשפעות החיוביות של פעילות גופנית אינם מובנים היטב. אימונים גופניים רבים, במיוחד אלה המסווגים כתרגילים אירוביים כגון ריצה והליכה, מייצרים כוחות אימפולסיביים בזמן מגע כף הרגל עם הקרקע. לכן, הועלתה השערה כי השפעה מכנית עשויה להיות מעורבת באופן שבו פעילות גופנית תורמת להומאוסטזיס אורגניזמי. לצורך בדיקת השערה זו על המוח, פותחה מערכת "תנועת ראש פסיבית" (להלן PHM) שתוכננה במיוחד ויכולה ליצור תאוצות אנכיות עם גדלים ומצבים מבוקרים ומוגדרים ולשחזר גירוי מכני שעשוי להיות מיושם על ראשי מכרסמים במהלך ריצת הליכון במהירויות מתונות, התערבות אופיינית לבדיקת ההשפעות של פעילות גופנית בבעלי חיים. על ידי שימוש במערכת זו, הוכח כי PHM משחזר את תת-סוג הקולטן סרוטונין (5-הידרוקסיטריפטמין, להלן 5-HT) תת-סוג 2A (5-HT2A) בתאי העצב בקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) של עכברים. עבודה זו מספקת פרוטוקולים מפורטים ליישום PHM ולמדידת התאוצות המכניות המתקבלות על ראשי מכרסמים.

Introduction

פעילות גופנית מועילה לטיפול או מניעה של מספר הפרעות פיזיות, כולל מחלות אורח חיים כגון סוכרת ויתר לחץ דם חיוני1. בהקשר זה, הצטברו גם ראיות לגבי ההשפעות החיוביות של פעילות גופנית על תפקודי המוח2. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס היתרונות של פעילות גופנית למוח עדיין אינם מובנים מאליהם. רוב הפעילויות הגופניות והאימונים מייצרים תאוצות מכניות בראש, לפחות במידה מסוימת. בעוד שתופעות פיזיולוגיות שונות מוסדרות באופן מכני, חשיבות ההעמסה המכנית תועדה ברוב המקרים במערכת השלד והשרירים 3,4,5. למרות שהמוח נתון גם לכוחות מכניים במהלך פעילות גופנית, במיוחד מה שמכונה תרגילי השפעה, ויסות מכני של תפקוד המוח הפיזיולוגי נחקר רק לעתים רחוקות. מאחר שיצירת תאוצות מכניות בראש שכיחה יחסית לאימונים גופניים, הועלתה השערה כי ויסות מכני עשוי להיות מעורב ביתרונות של פעילות גופנית לתפקודי המוח.

איתות קולטן5-HT 2A חיוני לוויסות רגשות והתנהגויות בין אותות ביוכימיים שונים המתפקדים במערכת העצבים. הוא מעורב במספר מחלות פסיכיאטריות 6,7,8, שבהן פעילות גופנית הוכחה כיעילה מבחינה טיפולית. קולטן 5-HT2A הוא תת-סוג של קולטן 5-HT2 השייך למשפחת הסרוטונין והוא גם חבר במשפחת הקולטן המצומד לחלבון G (GPCR), שהאיתות שלו מווסת על ידי הפנמתו, תלוי ליגנד או-עצמאי 9. עוויתות ראש הן התנהגות אופיינית של מכרסמים, שכמותם (תדירות) מייצגת במפורש את עוצמת האיתות של קולטן5-HT 2A בתאי העצב הקדם-מצחיים שלהם (PFC)10,11. תוך ניצול הספציפיות הקפדנית של תגובה הזויה זו ל-5-HT מנוהל (תגובת ראש-עווית, להלן HTR; ראו סרט משלים 1), נבדקה ההשערה שהוזכרה לעיל על השלכות מכניות בהשפעות פעילות גופנית על תפקודי המוח. לפיכך, ניתחנו והשווינו את ה-HTR של עכברים הנתונים לפעילות גופנית מאולצת (ריצת הליכון) או להתערבות מכנית המחקה פעילות גופנית (PHM).

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז השיקום הלאומי לאנשים עם מוגבלויות. חולדות ספראג-דאולי זכרים בני 8-9 שבועות שימשו למדידת תאוצות בראש במהלך ריצת הליכון ו-PHM. עכברי C57BL/6 זכרים בני 9-10 שבועות שימשו לבדיקות התנהגות ולניתוחים היסטולוגיים של ה-PFC. בעלי החיים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).

1. מדידת סדרי גודל של תאוצות לאורך צירי x, y ו-z במהלך ריצת הליכון

  1. הרדימו את החולדה בשאיפה של 1.5% איזופלורן.
    הערה: החולדות שימשו לאחר שבוע אחד לפחות של התאקלמות בסביבת המעבדה. ודאו שהחולדה אינה מגיבה לצביטת בוהן אחורית.
  2. תקן את מד התאוצה (ראה טבלת חומרים) על ראש החולדה באמצעות סרט ניתוח.
  3. לאחר התאוששות מלאה מההרדמה, הניחו את החולדה במכונת ההליכון (ראו טבלת חומרים), והתאימו את ההליכון למהירות בינונית (20 מטר לדקה)12 (איור 1A).
    הערה: זה לקח לפחות 20 דקות כדי לאשר את ההתאוששות המלאה של החולדה מן ההרדמה לאחר סיום שאיפת isoflurane ולהתחיל את ניסוי הליכון. ודאו שהחולדה מגיבה לצביטת בוהן אחורית, ומסוגלת ללכת או לרוץ מבלי להיראות מזעזעת.
  4. מדוד את עוצמת התאוצות האנכיות במהלך ריצת הליכון חולדה באמצעות תוכנת היישום בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    הערה: חלץ 10 גלים טוריים וחשב בנפרד את התאוצות הממוצעות לאורך הצירים התלת-ממדיים (צירי x, y ו-z, איור 1B). סדרי גודל שיא כומתו על-ידי הגדרת גלים מסונכרנים של דריכה (תדר ~2 הרץ) כתאוצות הנגרמות על-ידי ריצה בהליכון (איור 1C). חולדות שימשו למחקר זה מכיוון שגודל גופן הגדול יותר היה מתאים למדידה אמינה של התאוצה האנכית בראש, דבר שלא היה אפשרי בעכברים. עם זאת, עכברים שימשו למחקרים נוספים בגלל הקלות והאמינות בנוגע לניתוח כמותי של תגובת עווית ראש.

2. התאמת מערכת PHM ויישום PHM לעכברים

  1. הגדר מראש את המשרעת של תנודת הפלטפורמה ואת מהירות הסיבוב של המצלמה בצורת מדחף במערכת PHM (איור 1D) כך שהגודל והתדירות של התאוצה האנכית יתאימו לערכים המתקבלים בשלב 1.4.
    הערה: מערכת PHM כוללת מסגרת מתכת ופלטפורמת עץ. ניתן לשנות ולשלוט במהירות המנוע על ידי התאמת החוגה המחוברת לנהג המובנה (ראה טבלת חומרים). סולם החוגה של 600 מתאים ל-2 הרץ, איור 1E. למצלמה בצורת מדחף יש ארבעה להבים עם גובה צעד של 5 מ"מ (איור 1F).
  2. הרדמת העכבר באמצעות שאיפה של 1.2% איזופלורן.
    הערה: נעשה שימוש בעכברים לאחר שבוע אחד לפחות של התאקלמות בסביבות המעבדה. ודא שהעכבר אינו מגיב לצביטת בוהן אחורית.
  3. מקם את העכבר במצב נוטה עם הראש ואת שאר הגוף הממוקם על פלטפורמות מתנדנדות סטטיות, בהתאמה.
    הערה: שמור על העכבר מורדם (1.2% איזופלוראן).
  4. הפעל את המנוע כדי להתנדנד את הפלטפורמה אנכית, והחל PHM על העכבר.
    הערה: מהירות המנוע הותאמה לתנודה של הפלטפורמה ב-2 הרץ (ראה שלב 2.1). הרדימו והניחו את עכבר הבקרה על פלטפורמת PHM באופן דומה, אך השאירו את המנוע כבוי.

3. הפעלת העכבר על ההליכון

  1. הנח את העכבר על מכונת ההליכון וכוונן את ההליכון למהירות בינונית (10 מ'/דקה)13.

4. כימות תגובת עווית ראש העכבר (HTR)

  1. הגדר את מצלמת הווידאו (קצב פריימים: 24 fps) כדי להקליט את כל השטח במארז הפלסטיק השקוף.
    הערה: כלוב הפלסטיק שימש לשמירה על העכבר בתחום הקלטת הווידאו.
  2. מתן תוך-צפקי של 5-הידרוקסיטריפטופן (5-HTP) (100 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים), המבשר ל-5-HT, לעכבר.
  3. הנח את העכבר בכלוב השקוף והתחל להקליט למשך 30 דקות.
  4. סקור את הסרטון המוקלט (מהירות של 1/2x או 1/3x), וספור את הראש רועד באופן ידני.
    הערה: האנליסטים לא היו עיוורים להליך הניסוי. תנועה מהירה אופיינית "דמוית טיק" של עכבר (ראו סרט משלים 1) נספרה כעוויתות ראש, המתרחשות לעתים רחוקות בסביבת רבייה רגילה.

5. ניתוח אימונוהיסטוכימי של PFC עכבר

  1. לאחר השלמת בדיקות HTR, הרדימו את העכבר על ידי ניהול תערובת של מידזולם (4.0 מ"ג/ק"ג), בוטורפנול (4.0 מ"ג/ק"ג) ומדטומידין (0.3 מ"ג/ק"ג), פרפוז עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS, ולאחר מכן הוציאו את המוח בעקבות דיווחים שפורסמו בעבר14,15.
  2. לאחר תיקון המוחות ב-4% PFA ב-PBS למשך 24 שעות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס, ואחסון ב-30% סוכרוז/PBS עד שהם שוקעים. הקפיאו את תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית הקבועה (תרכובת OCT, ראו טבלת חומרים).
  3. אחזר את מקטעי הקריו של מוח העכבר מתיבת השקופיות (ראה טבלת חומרים). השאירו את השקופיות על מגבונים נקיים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות יתייבשו לחלוטין.
    הערה: חתכי סגיטל בעובי עשרים מיקרומטר (רוחבי +0.5-1.5 מ"מ) הוכנו מדגימות קפואות המשובצות בתרכובת OCT באמצעות קריוסטאט (ראו טבלת חומרים).
  4. השתמש בעט חוסם נוזלים (ראה טבלת חומרים) כדי לצייר עיגול סביב הרקמה החתוכה בשקופית כדי להגביל את אזור ההתפשטות של התמיסה (0.1% Tween-20 בתמיסת מלח עם חציצה משולשת (TBS-T).
  5. הניחו מגבונים לחים בתחתית מגש המחזיק את המגלשות כדי ליצור סביבה לחה.
  6. לאחר חלחול עם TBS-T, יש לחסום עם סרום 4% חמורים (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  7. שטפו את השקופיות פעם ב-5 דקות טבילה ב-TBS-T.
  8. יש למרוח 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל כראוי ולערבב DAPI ( ראו טבלת חומרים) על כל שקופית, לכסות את המגש כדי למנוע ייבוש הדגימה, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  9. יש לשטוף עם TBS-T שלוש פעמים (5 דקות דגירה כל אחת).
  10. יש למרוח 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי מדולל כראוי (מצומד ל-Alexa Fluor 488, 568 או 645) (ראו טבלת חומרים) על כל שקופית ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  11. יש לשטוף עם TBS-T שלוש פעמים (5 דקות דגירה כל אחת).
  12. הרכב את השקופיות עם מדיום הרכבה (ראה טבלת חומרים). כסו את השקופיות בכיסויים.
  13. צפו בדגימה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

עוצמת השיא של התאוצות האנכיות בראשי החולדות במהלך ריצת ההליכון שלהן במהירות בינונית (20 מטר לדקה) הייתה בערך 1.0 × גרם (איור 1C). מערכת PHM (איור 1D) הוקמה כדי לייצר שיאי תאוצה אנכיים של 1.0 × גרם בראשי המכרסמים.

מריחת PHM (2 הרץ, 30 דקות ליום במשך ...

Discussion

באמצעות מערכת יישומי PHM שפותחה, הראינו כי איתות 5-HT בתאי העצב שלהם ב-PFC מוסדר באופן מכני. בגלל המורכבות של השפעות פעילות גופנית, קשה לנתח במדויק את התוצאה של פעילות גופנית בהקשר של קידום בריאות. ההתמקדות היא בהיבטים מכניים כדי למנוע מעורבות או תרומה של אירועים מטבוליים שעלולים להתרחש עם או ל?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין עניין מתחרה הקשור לעבודה המתוארת במאמר זה.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המחקר התוך-מוחית של משרד הבריאות, העבודה והרווחה היפני; מענקי סיוע למחקר מדעי מהאגודה היפנית לקידום המדע (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); תוכנית נתמכת MEXT עבור קרן המחקר האסטרטגי באוניברסיטאות פרטיות, 2015-2019 ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה היפני (S1511017); קרן נאיטו למדע והנדסה. מחקר זה קיבל מימון גם מהברית למחקר והכשרה של שיקום רגנרטיבי (AR3T), הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם על שם יוניס קנדי שרייבר (NICHD), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS), והמכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר P2CHD086843.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driverOriental motorBMUD30-A2Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 miceOriental yeast companyC57BL/6JMice used in this study
CryostatLeicaCM33050SMicrotome to cut frozen samples
DC MotorOriental motorBLM230-GFV2Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serumSigma-AldrichS30-100MLBlocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-9000Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptorSanta Cruz Biotechnologysc-15073Primary antibody used for immunohistochemical staining
IsofluranePfizerv002139Inhalation anesthetic
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid BlockerDaido SangyoPAP-SMarker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Accelerometer to measure accelerations
OCT compoundSakura Finetek45833Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide boxAS ONE03-448-1Opaque box to store slides
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AApplication software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley ratsJapan SLCSlc:SDRats used in this study
Treadmill machineMuromachiMK-680System used in experiments of forced running of rats and mice

References

  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
  3. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  4. Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475 (2019).
  5. Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
  6. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
  7. Canli, T., Lesch, K. -. P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
  8. Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
  9. Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
  10. Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
  11. Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
  12. Kim, S. -. E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
  13. Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
  14. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  15. Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874 (2020).
  16. Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
  17. Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325 (2020).
  18. Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
  19. Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1855 HT 2A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved