Application du mouvement passif de la tête pour générer des accélérations définies à la tête des rongeurs

Résumé

Le présent protocole décrit un système de « mouvement passif de la tête » conçu sur mesure, qui reproduit les accélérations mécaniques à la tête des rongeurs générées pendant leur course sur tapis roulant à des vitesses modérées. Il permet de disséquer les facteurs/éléments mécaniques des effets bénéfiques de l’exercice physique.

Résumé

L’exercice est largement reconnu comme efficace pour diverses maladies et troubles physiques, y compris ceux liés au dysfonctionnement cérébral. Cependant, les mécanismes moléculaires derrière les effets bénéfiques de l’exercice sont mal compris. De nombreux entraînements physiques, en particulier ceux classés comme exercices aérobiques tels que le jogging et la marche, produisent des forces impulsives au moment du contact du pied avec le sol. Par conséquent, il a été spéculé que l’impact mécanique pourrait être impliqué dans la façon dont l’exercice contribue à l’homéostasie de l’organisme. Pour tester cette hypothèse sur le cerveau, un système de « mouvement passif de la tête » (ci-après appelé PHM) conçu sur mesure a été développé qui peut générer des accélérations verticales avec des magnitudes et des modes contrôlés et définis et reproduire la stimulation mécanique qui pourrait être appliquée à la tête des rongeurs pendant le tapis roulant à des vitesses modérées, une intervention typique pour tester les effets de l’exercice chez les animaux. En utilisant ce système, il a été démontré que le PHM récapitule la signalisation du récepteur de la sérotonine (5-hydroxytryptamine, ci-après appelée 5-HT) du récepteur 2A (5-HT_2A) dans les neurones du cortex préfrontal (PFC) de souris. Ce travail fournit des protocoles détaillés pour l’application du MPS et la mesure des accélérations mécaniques qui en résultent à la tête des rongeurs.

Introduction

L’exercice est bénéfique pour traiter ou prévenir plusieurs troubles physiques, y compris les maladies liées au mode de vie telles que le diabète sucré et l’hypertension essentielle¹. Dans le même ordre d’idées, des preuves ont également été accumulées concernant les effets positifs de l’exercice sur les fonctions cérébrales². Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents aux avantages de l’exercice pour le cerveau restent principalement non élucidés. La plupart des activités physiques et des entraînements génèrent des accélérations mécaniques à la tête, du moins dans une certaine mesure. Alors que divers phénomènes physiologiques sont régulés mécaniquement, l’importance de la charge mécanique a, dans la plupart des cas, été documentée dans le système musculo-squelettique ^3,4,5. Bien que le cerveau soit également soumis à des forces mécaniques lors d’activités physiques, en particulier des exercices dits impactants, la régulation mécanique du fonctionnement physiologique du cerveau a rarement été étudiée. Parce que la génération d’accélérations mécaniques à la tête est relativement commune aux entraînements physiques, il a été spéculé que la régulation mécanique pourrait être impliquée dans les avantages de l’exercice pour les fonctions cérébrales.

La signalisation du récepteur 5-HT_2A est essentielle pour réguler les émotions et les comportements parmi divers signaux biochimiques qui fonctionnent dans le système nerveux. Il est impliqué dans de multiples maladies psychiatriques ^6,7,8, sur lesquelles l’exercice s’est avéré thérapeutiquement efficace. Le récepteur 5-HT_2A est un sous-type du récepteur 5-HT₂ qui appartient à la famille des sérotonines et est également un membre de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), dont la signalisation est modulée par son internalisation, dépendante du ligand ou^{indépendante 9}. Les contractions de la tête sont un comportement caractéristique des rongeurs, dont la quantité (fréquence) représente explicitement l’intensité de la signalisation du récepteur 5-HT_2A dans leurs neurones du cortex préfrontal (PFC)^10,11. Profitant de la spécificité stricte de cette réponse hallucinogène au 5-HT administré (réponse à contraction de la tête, ci-après appelée HTR; voir le film supplémentaire 1), l’hypothèse mentionnée ci-dessus sur les implications mécaniques des effets de l’exercice sur les fonctions cérébrales a été testée. Ainsi, nous avons analysé et comparé le HTR de souris soumises à un exercice forcé (course sur tapis roulant) ou à une intervention mécanique imitant l’exercice (PHM).

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre national de réadaptation pour les personnes handicapées. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 8 à 9 semaines ont été utilisés pour mesurer les accélérations à la tête pendant la course sur tapis roulant et le MPS. Des souris C57BL/6 mâles âgées de 9 à 10 semaines ont été utilisées pour des tests de comportement et des analyses histologiques du PFC. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Mesure de l’amplitude des accélérations le long des axes x, y et z pendant la course sur tapis roulant

1. Anesthésier le rat par inhalation d’isoflurane à 1,5%.
   REMARQUE : Les rats ont été utilisés après au moins 1 semaine d’acclimatation à l’environnement de laboratoire. Assurez-vous que le rat ne répond pas à un pincement des orteils des membres postérieurs.
2. Fixez l’accéléromètre (voir le tableau des matériaux) sur le dessus de la tête du rat à l’aide de ruban chirurgical.
3. Après une récupération complète de l’anesthésie, placer le rat dans le tapis roulant (voir le tableau des matériaux) et ajuster le tapis roulant à une vitesse modérée (20 m/min)¹² (figure 1A).
   REMARQUE: Il a fallu au moins 20 minutes pour confirmer le rétablissement complet du rat de l’anesthésie après la fin de l’inhalation d’isoflurane et commencer l’expérience sur tapis roulant. Assurez-vous que le rat est sensible à un pincement d’orteil du membre postérieur, étant capable de marcher ou de courir sans chanceler apparent.
4. Mesurer l’ampleur des accélérations verticales pendant le fonctionnement sur tapis roulant à l’aide du logiciel d’application en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Extrayez 10 ondes en série et calculez individuellement les accélérations moyennes le long des axes à 3 dimensions (axes x, y et z, Figure 1B). Les magnitudes maximales ont été quantifiées en définissant les ondes synchronisées par pas (fréquence ~2 Hz) comme des accélérations induites par la course sur tapis roulant (Figure 1C). Des rats ont été utilisés pour cette étude car leur plus grande taille était appropriée pour mesurer de manière fiable l’accélération verticale à la tête, ce qui n’était pas possible chez la souris. Cependant, des souris ont été utilisées pour d’autres études en raison de la facilité et de la fiabilité de l’analyse quantitative de la réponse à la contraction de la tête.

2. Ajustement du système PHM et application du PHM aux souris

1. Préréglez l’amplitude de l’oscillation de la plate-forme et la vitesse de rotation de la came en forme d’hélice dans le système PHM (Figure 1D) afin que l’amplitude et la fréquence de l’accélération verticale correspondent aux valeurs obtenues à l’étape 1.4.
   NOTE: Le système PHM comprend une ossature métallique et une plate-forme en bois. La vitesse du moteur peut être modifiée et contrôlée en ajustant le cadran connecté au pilote intégré (voir le tableau des matériaux). L’échelle de numérotation de 600 correspond à 2 Hz, Figure 1E. La came en forme d’hélice comporte quatre pales avec des hauteurs de marche de 5 mm (figure 1F).
2. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane à 1,2%.
   NOTE: Les souris ont été utilisées après au moins 1 semaine d’acclimatation aux environnements de laboratoire. Assurez-vous que la souris ne répond pas à un pincement des orteils des membres postérieurs.
3. Placez la souris en position couchée sur le ventre avec la tête et le reste du corps situés respectivement sur les plates-formes oscillable et statique.
   REMARQUE : Gardez la souris anesthésiée (isoflurane à 1,2 %).
4. Allumez le moteur pour faire osciller la plate-forme verticalement et appliquez PHM à la souris.
   REMARQUE : La vitesse du moteur a été réglée pour faire osciller la plate-forme à 2 Hz (voir étape 2.1). Anesthésiez et placez la souris de contrôle sur la plate-forme PHM de la même manière, mais laissez le moteur éteint.

3. Fonctionnement de la souris sur le tapis roulant

1. Placez la souris sur le tapis roulant et réglez le tapis roulant à une vitesse modérée (10 m/min)¹³.

4. Quantification de la réponse de contraction de la tête de souris (HTR)

1. Configurez la caméra vidéo (fréquence d’images : 24 ips) pour enregistrer tout l’espace dans le boîtier en plastique transparent.
   REMARQUE: La cage en plastique a été utilisée pour garder la souris dans le champ de l’enregistrement vidéo.
2. Administrer par voie intrapéritonéale du 5-hydroxytryptophane (5-HTP) (100 mg/kg) (voir le tableau des matières), le précurseur du 5-HT, à une souris.
3. Placez la souris dans la cage transparente et commencez l’enregistrement pendant 30 min.
4. Passez en revue la vidéo enregistrée (vitesse 1/2x ou 1/3x), en comptant manuellement les contractions de la tête.
   NOTE: Les analystes n’ont pas été aveuglés par la procédure expérimentale. Le mouvement rapide caractéristique de la souris (voir le film supplémentaire 1) a été compté comme des contractions de la tête, ce qui se produit rarement dans un environnement de reproduction normal.

5. Analyse immunohistochimique des PFC chez la souris

1. Une fois les tests HTR terminés, anesthésier la souris en administrant le mélange de midazolam (4,0 mg / kg), de butorphanol (4,0 mg / kg) et de médétomidine (0,3 mg / kg), perfuser avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS, puis exciser le cerveau à la suite des rapports précédemment publiés^14,15.
2. Postfixez les cerveaux dans 4% PFA dans PBS pendant 24 heures supplémentaires à 4 ° C, et stockez-les dans 30% de saccharose / PBS jusqu’à ce qu’ils coulent. Congeler le composé à température de coupe optimale fixe (composé OCT, voir le tableau des matières).
3. Récupérez les sections cryogéniques du cerveau de la souris à partir de la boîte à diapositives (voir le tableau des matériaux). Laissez les lames sur des lingettes propres à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons se déshydratent complètement.
   REMARQUE : Des coupes sagittales de vingt micromètres d’épaisseur (latérales +0,5–1,5 mm) ont été préparées à partir d’échantillons congelés incorporés dans un composé OCT à l’aide d’un cryostat (voir le tableau des matériaux).
4. Utilisez un stylo bloqueur de liquide (voir le tableau des matériaux) pour dessiner un cercle autour du tissu cryosectionné sur la lame afin de confiner la zone de propagation de la solution (0,1 % de Tween-20 dans une solution saline tamponnée Tris (TBS-T).
5. Placez des lingettes humides sur le fond d’un plateau contenant les lames pour créer un environnement humide.
6. Après perméabilisation avec TBS-T, bloquer avec du sérum d’ânesse à 4% (voir tableau des matières) à température ambiante pendant 1 h.
7. Rincer les lames une fois par immersion de 5 minutes dans TBS-T.
8. Appliquer 100 μL d’anticorps primaires et de DAPI (voir le tableau des matières) sur chaque lame, couvrir le plateau pour éviter de sécher l’échantillon et incuber pendant une nuit à température ambiante.
9. Rincer avec TBS-T trois fois (5 minutes d’incubation chacun).
10. Appliquer 100 μL d’anticorps secondaire fluorescent adapté aux espèces correctement dilué (conjugué avec Alexa Fluor 488, 568 ou 645) (voir le tableau des matériaux) sur chaque lame et incuber pendant 1 h à température ambiante.
11. Rincer avec TBS-T trois fois (5 minutes d’incubation chacun).
12. Montez les glissières avec un support de montage (voir Tableau des matériaux). Couvrez les diapositives avec des bordereaux.
13. Visualisez l’échantillon au microscope à fluorescence.

Résultats

L’amplitude maximale des accélérations verticales à la tête des rats pendant leur course sur tapis roulant à une vitesse modérée (20 m/min) était d’environ 1,0 × g (figure 1C). Le système PHM (Figure 1D) a été mis en place pour générer des pics d’accélération verticale de 1,0 × g à la tête des rongeurs.

L’application de PHM (2 Hz, 30 min/jour pendant 7 jours) à des souris a significativeme...

Discussion

En utilisant le système d’application PHM développé, nous avons montré que la signalisation 5-HT dans leurs neurones PFC est régulée mécaniquement. En raison de la complexité des effets de l’exercice, il a été difficile de disséquer avec précision les conséquences de l’exercice dans le contexte de la promotion de la santé. L’accent est mis sur les aspects mécaniques pour empêcher l’implication ou la contribution d’événements métaboliques qui peuvent survenir avec ou après des activités d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)	Sigma-Aldrich	H9772	Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driver	Oriental motor	BMUD30-A2	Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 mice	Oriental yeast company	C57BL/6J	Mice used in this study
Cryostat	Leica	CM33050S	Microtome to cut frozen samples
DC Motor	Oriental motor	BLM230-GFV2	Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11057	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-31571	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21206	Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML	Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-9000	Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor	Santa Cruz Biotechnology	sc-15073	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Isoflurane	Pfizer	v002139	Inhalation anesthetic
KimWipe	NIPPON PAPER CRECIA	S-200	Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid Blocker	Daido Sangyo	PAP-S	Marker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)	EMD Millipore (Merck)	MAB377	Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-Light	Switchscience	SSCI-023641	Accelerometer to measure accelerations
OCT compound	Sakura Finetek	45833	Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934	Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-Fos	Santa Cruz Biotechnology	sc-52	Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide box	AS ONE	03-448-1	Opaque box to store slides
Spike2	Cambridge electronic design limited (CED)	N/A	Application software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley rats	Japan SLC	Slc:SD	Rats used in this study
Treadmill machine	Muromachi	MK-680	System used in experiments of forced running of rats and mice