JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает специально разработанную систему «пассивного движения головы», которая воспроизводит механические ускорения на головах грызунов, генерируемые во время беговой дорожки с умеренными скоростями. Это позволяет препарировать механические факторы / элементы от благотворного воздействия физических упражнений.

Аннотация

Физические упражнения широко признаны эффективными при различных заболеваниях и физических расстройствах, в том числе связанных с дисфункцией головного мозга. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе благотворного воздействия физических упражнений, плохо изучены. Многие физические тренировки, особенно те, которые классифицируются как аэробные упражнения, такие как бег трусцой и ходьба, производят импульсивные силы во время контакта ног с землей. Поэтому было высказано предположение, что механическое воздействие может быть связано с тем, как физические упражнения способствуют гомеостазу организма. Для проверки этой гипотезы на мозге была разработана специально разработанная система «пассивного движения головы» (далее именуемая PHM), которая может генерировать вертикальные ускорения с контролируемыми и определенными величинами и режимами и воспроизводить механическую стимуляцию, которая может быть применена к головам грызунов во время беговой дорожки с умеренными скоростями, типичное вмешательство для проверки эффектов упражнений на животных. Используя эту систему, было продемонстрировано, что PHM рекапитулирует серотониновый (5-гидрокситриптамин, далее называемый 5-HT) рецептор подтипа 2A (5-HT2A), сигнализирующий в нейронах префронтальной коры (PFC) мышей. Эта работа предоставляет подробные протоколы для применения PHM и измерения его результирующих механических ускорений на головах грызунов.

Введение

Физические упражнения полезны для лечения или профилактики нескольких физических расстройств, включая заболевания образа жизни, такие как сахарный диабет и эссенциальная гипертензия1. В связи с этим также были накоплены данные о положительном влиянии физических упражнений на функции мозга2. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе преимуществ физических упражнений для мозга, остаются в основном неочевидными. Большинство физических нагрузок и тренировок генерируют механические ускорения в голове, по крайней мере, в некоторой степени. В то время как различные физиологические явления механически регулируются, важность механической нагрузки в большинстве случаев была задокументирована в костно-мышечной системе 3,4,5. Хотя мозг также подвергается механическим силам во время физических нагрузок, особенно так называемых ударных упражнений, механическая регуляция физиологической функции мозга редко изучается. Поскольку генерация механических ускорений в голове относительно распространена для физических тренировок, было высказано предположение, что механическая регуляция может быть связана с преимуществами упражнений для функций мозга.

Передача сигналов рецептора 5-HT2A необходима для регулирования эмоций и поведения среди различных биохимических сигналов, которые функционируют в нервной системе. Он участвует в множественных психиатрических заболеваниях 6,7,8, при которых физические упражнения доказали свою терапевтическую эффективность. Рецептор 5-HT2A представляет собой подтип рецептора 5-HT2, который принадлежит к семейству серотонинов, а также является членом семейства рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), передача сигналов которого модулируется его интернализацией, либо лиганд-зависимой, либо -независимой9. Подергивание головы является характерным поведением грызунов, количество (частота) которого явно представляет интенсивность передачи сигналов рецептора 5-HT2A в их нейронах префронтальной коры (ПФК)10,11. Используя строгую специфику этой галлюциногенной реакции на введенный 5-HT (ответ на подергивание головы, далее называемый HTR; см. Дополнительный фильм 1), была проверена упомянутая выше гипотеза о механических последствиях воздействия упражнений на функции мозга. Таким образом, мы проанализировали и сравнили HTR мышей, подвергшихся либо принудительному упражнению (бег на беговой дорожке), либо механическому вмешательству, имитирующему упражнения (PHM).

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Национального реабилитационного центра для инвалидов. 8-9-недельные самцы крыс Sprague-Dawley использовались для измерения ускорений в голове во время беговой дорожки и PHM. 9-10-недельные самцы мышей C57BL/6 использовались для поведенческих тестов и гистологических анализов PFC. Животные были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Измерение величин ускорений по осям x-, y- и z-осям во время беговой дорожки

  1. Обезболить крысу ингаляцией 1,5% изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс использовали по крайней мере через 1 неделю акклиматизации в лабораторных условиях. Убедитесь, что крыса не реагирует на защемление заднего пальца ноги.
  2. Закрепите акселерометр (см. Таблицу материалов) поверх головы крысы с помощью хирургической ленты.
  3. После полного восстановления после анестезии поместите крысу в тренажер для беговой дорожки (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте беговую дорожку до умеренной скорости (20 м/мин)12 (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потребовалось не менее 20 минут, чтобы подтвердить полное выздоровление крысы от анестезии после прекращения ингаляции изофлурана и начать эксперимент на беговой дорожке. Убедитесь, что крыса реагирует на защемление заднего пальца ноги, будучи в состоянии ходить или бегать без видимого пошатывания.
  4. Измерьте величину вертикальных ускорений во время беговой дорожки крыс с помощью прикладного программного обеспечения, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките 10 последовательных волн и индивидуально рассчитайте средние ускорения вдоль 3-мерных осей (оси x-, y- и z-оси, рисунок 1B). Пиковые величины были количественно определены путем определения ступенчато-синхронизированных волн (~ частота 2 Гц) как ускорения, вызванные беговой дорожкой (рисунок 1C). Крысы были использованы для этого исследования, так как их больший размер тела подходил для надежного измерения вертикального ускорения в голове, что было невозможно у мышей. Тем не менее, мыши были использованы для дальнейших исследований из-за легкости и надежности в отношении количественного анализа реакции на подергивание головы.

2. Настройка системы PHM и применение PHM к мышам

  1. Предварительно установите амплитуду колебаний платформы и скорость вращения кулачка в форме пропеллера в системе PHM (рисунок 1D), чтобы величина и частота вертикального ускорения соответствовали значениям, полученным на шаге 1.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система PHM состоит из металлического каркаса и деревянной платформы. Скорость двигателя можно изменять и контролировать, регулируя циферблат, подключенный к встроенному драйверу (см. Таблицу материалов). Шкала циферблата 600 соответствует 2 Гц, рисунок 1Е. Кулачок в форме пропеллера имеет четыре лопасти с высотой шага 5 мм (рисунок 1F).
  2. Обезболивают мышь путем вдыхания 1,2% изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши использовались по крайней мере через 1 неделю акклиматизации в лабораторных условиях. Убедитесь, что мышь не реагирует на защемление заднего пальца ноги.
  3. Поместите мышь в положение лежа с головой и остальной частью тела, расположенной на колеблющейся и статической платформах соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышь под наркозом (1,2% изофлурана).
  4. Включите двигатель, чтобы он колебал платформу вертикально, и нанесите PHM на мышь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость двигателя была отрегулирована таким образом, чтобы колебать платформу при частоте 2 Гц (см. шаг 2.1). Также обезболивайте и поместите контрольную мышь на платформу PHM, но оставьте двигатель выключенным.

3. Бег мышки по беговой дорожке

  1. Поместите мышь на беговую дорожку и отрегулируйте беговую дорожку до умеренной скорости (10 м/мин)13.

4. Количественная оценка реакции мыши на подергивание головы (HTR)

  1. Настройте видеокамеру (частота кадров: 24 кадра в секунду) для записи всего пространства в прозрачном пластиковом корпусе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая клетка использовалась для удержания мыши в области видеозаписи.
  2. Внутрибрюшинно вводят 5-гидрокситриптофан (5-HTP) (100 мг/кг) (см. Таблицу материалов), предшественник 5-HT, мыши.
  3. Поместите мышь в прозрачную клетку и начните запись в течение 30 минут.
  4. Просмотрите записанное видео (скорость 1/2x или 1/3x), подсчитывая подергивание головы вручную.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитики не были слепы к экспериментальной процедуре. Характерное «тикообразное» быстрое движение мыши (см. Дополнительный фильм 1) было учтено как подергивание головы, которое редко возникает в нормальной среде размножения.

5. Иммуногистохимический анализ ПФК мыши

  1. Как только тесты HTR завершены, анестезируют мышь, вводя смесь мидазолама (4,0 мг / кг), буторфанола (4,0 мг / кг) и медетомидина (0,3 мг / кг), перфузируют с 4% параформальдегидом (PFA) в PBS, а затем иссекают мозг после ранее опубликованных сообщений14,15.
  2. Постфиксируйте мозг в 4% PFA в PBS в течение дополнительных 24 ч при 4 °C и храните в 30% сахарозы / PBS до тех пор, пока они не утонут. Заморозьте соединение с оптимальной температурой резания (соединение OCT, см. Таблицу материалов).
  3. Извлеките криосеки мозга мыши из слайд-поля (см. Таблицу материалов). Оставьте слайды на чистых салфетках при комнатной температуре до тех пор, пока образцы полностью не обезвоживаются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сагиттальные срезы толщиной двадцать микрометра (боковые +0,5–1,5 мм) были получены из замороженных образцов, внедренных в соединение OCT с использованием криостата (см. Таблицу материалов).
  4. Используйте ручку блокатора жидкости (см. Таблицу материалов), чтобы нарисовать круг вокруг криосекционной ткани на слайде, чтобы ограничить область распространения раствора (0,1% Tween-20 в трис-буферном физиологическом растворе (TBS-T).
  5. Поместите влажные салфетки на дно лотка, удерживающего горки, чтобы создать влажную среду.
  6. После пермеабилизации TBS-T блокируют 4% ослиной сывороткой (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  7. Промойте слайды один раз на 5 мин погружением в TBS-T.
  8. Нанесите 100 мкл соответствующим образом разбавленного первичного антитела и смеси DAPI (см. Таблицу материалов) на каждый слайд, накройте лоток, чтобы избежать высыхания образца, и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре.
  9. Промыть TBS-T три раза (по 5 мин инкубации).
  10. Наносите 100 мкл соответствующим образом разбавленного флуоресцентного вторичного антитела (конъюгированного с Alexa Fluor 488, 568 или 645) (см. Таблицу материалов) на каждый слайд и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
  11. Промыть TBS-T три раза (по 5 мин инкубации).
  12. Смонтируйте слайды с монтажным носителем (см. Таблицу материалов). Закройте слайды обложками.
  13. Просмотрите образец под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

Пиковая величина вертикальных ускорений на головах крыс во время беговой дорожки с умеренной скоростью (20 м/мин) составляла примерно 1,0 × g (рисунок 1C). Система PHM (рисунок 1D) была создана для генерации пиков вертикального ускорения 1,0 × g на голова?...

Обсуждение

Используя разработанную систему применения PHM, мы показали, что передача сигналов 5-HT в их нейронах PFC механически регулируется. Из-за сложности воздействия физических упражнений было трудно точно проанализировать последствия физических упражнений в контексте укрепления здоровья. Осн...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет никакого конкурирующего интереса, связанного с работой, описанной в данной статье.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Фондом внутренних исследований министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии; Гранты на научные исследования от Японского общества содействия развитию науки (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Поддерживаемая MEXT программа для Фонда стратегических исследований в частных университетах, 2015-2019 от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии (S1511017); Научно-технический фонд Наито. Это исследование также получило финансирование от Альянса по исследованиям и обучению регенеративной реабилитации (AR3T), который поддерживается Национальным институтом детского здоровья и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (NICHD), Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) и Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) Национальных институтов здравоохранения под номером награды P2CHD086843.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driverOriental motorBMUD30-A2Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 miceOriental yeast companyC57BL/6JMice used in this study
CryostatLeicaCM33050SMicrotome to cut frozen samples
DC MotorOriental motorBLM230-GFV2Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serumSigma-AldrichS30-100MLBlocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-9000Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptorSanta Cruz Biotechnologysc-15073Primary antibody used for immunohistochemical staining
IsofluranePfizerv002139Inhalation anesthetic
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid BlockerDaido SangyoPAP-SMarker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Accelerometer to measure accelerations
OCT compoundSakura Finetek45833Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide boxAS ONE03-448-1Opaque box to store slides
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AApplication software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley ratsJapan SLCSlc:SDRats used in this study
Treadmill machineMuromachiMK-680System used in experiments of forced running of rats and mice

Ссылки

  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
  3. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  4. Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475 (2019).
  5. Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
  6. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
  7. Canli, T., Lesch, K. -. P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
  8. Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
  9. Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
  10. Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
  11. Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
  12. Kim, S. -. E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
  13. Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
  14. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  15. Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874 (2020).
  16. Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
  17. Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325 (2020).
  18. Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
  19. Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1855 HT2A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены