Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Resumen

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Resumen

En las cianobacterias, el ficobilisoma es un complejo de proteína de antena vital que cosecha luz y transfiere energía al fotosistema I y II para la fotoquímica. El estudio de la estructura y composición del ficobilisoma es de gran interés para los científicos porque revela la evolución y divergencia de la fotosíntesis en las cianobacterias. Este protocolo proporciona un método detallado y optimizado para romper las células de cianobacterias a bajo costo por un batidor de cuentas de manera eficiente. El ficobilisoma intacto se puede aislar del extracto celular mediante ultracentrifugación por gradiente de sacarosa. Este método ha demostrado ser adecuado tanto para cianobacterias modelo como no modelo con diferentes tipos de células. También se proporciona un procedimiento paso a paso para confirmar la integridad y la propiedad de las ficobiliproteínas mediante espectroscopia de fluorescencia 77K y SDS-PAGE teñido por sulfato de zinc y azul coomassie. El ficobilisoma aislado también puede ser sometido a análisis estructurales y compositivos adicionales. En general, este protocolo proporciona una guía de inicio útil que permite a los investigadores que no están familiarizados con las cianobacterias aislar y caracterizar rápidamente el ficobilisoma intacto.

Introducción

El ficobilisoma (PBS) es un enorme complejo pigmentario-proteico soluble en agua que se une al lado citoplasmático de los fotosistemas en las membranas tilacoides de las ^{cianobacterias1}. El PBS se compone principalmente de ficobiliproteínas coloreadas y proteínas enlazadoras ^incoloras1,2. Las ficobiliproteínas se pueden dividir en cuatro grupos principales: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina y aloficocianina3. Los cuatro grupos principales absorben diferentes longitudes de onda de energía lumínica en el rango de 490-650 nm, que las clorofilas absorbieron de manera ^ineficiente3. El PBS puede servir como una antena de recolección de luz para recolectar energía de la luz y entregarla al Photosystem II e ^I4.

La estructura y composición de PBS varían de una especie a otra. En conjunto, se han identificado tres formas de ficobilisoma (hemidiscodial, en forma de haz y en forma de varilla) en diferentes especies de cianobacterias5. Incluso en la misma especie, la composición del PBS cambia en respuesta al medio ambiente, como la calidad de la luz y el agotamiento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, el procedimiento experimental para aislar PBS de cianobacterias ha sido fundamental en el estudio de ^PBS12. Durante varias décadas, muchos protocolos diferentes han aislado PBS y analizado su estructura, composición y función6,7,8,12,13,14,15,16,17. La amplia variedad de métodos para el aislamiento de PBS proporciona flexibilidad para aislar el complejo en diferentes especies con diferentes reactivos e instrumentos. Sin embargo, también hace que la elección de un protocolo adecuado sea más difícil para los científicos que no están familiarizados con las cianobacterias y el PBS. Por lo tanto, se desarrolla un protocolo generalizado y sencillo en este trabajo para aquellos interesados en iniciar el aislamiento de PBS de cianobacterias.

Los métodos para aislar PBS de publicaciones anteriores se resumen aquí. Dado que pbS es un complejo de proteínas solubles en agua y se disocia fácilmente, se requiere un tampón de fosfato de alta fuerza iónica para estabilizar PBS durante la ^{extracción18}. Varios artículos de investigación que describen métodos para el aislamiento de PBS de cianobacterias se han publicado en el pasado. La mayoría de los métodos requieren una alta concentración de tampón de fosfato8,14,15,18,19. Sin embargo, los procedimientos para la alteración mecánica de las células varían, como la extracción asistida por perlas de vidrio, la ^{sonicación20} y la prensa francesa6,8,14. Se pueden obtener diferentes ficobiliproteínas por precipitación con sulfato de ^amonio20 y purificadas por ^HPLC21 o una columna ^{cromatográfica22}. Por otro lado, el PBS intacto se puede aislar fácilmente mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa6,8,15.

En este protocolo, se utilizaron un modelo de cianobacteria y un modelo de cianobacteria no modelo como materiales para el aislamiento de PBS. Son el modelo unicelular tolerante a la glucosa Synechocystis sp. PCC 6803 (en adelante Syn6803) y el no modelo filamentoso Leptolyngbya sp. JSC-1 (en adelante JSC-1), respectivamente7,23,24. El protocolo comienza por la interrupción de las cianobacterias unicelulares y filamentosas en un tampón de fosfato de alta resistencia iónica. Después de la lisis, los sobrenadantes se recogen por centrifugación y luego se tratan con un detergente no iónico (Tritón X-100) para solubilizar las proteínas solubles en agua de las membranas tilacoides. Las proteínas solubles en agua totales se aplican a un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo para fraccionar el PBS. El gradiente de sacarosa discontinua en este protocolo consiste en cuatro soluciones de sacarosa y particiona el PBS intacto en las fracciones más bajas de la capa de ^sacarosa25. La integridad de PBS se puede analizar mediante SDS-PAGE, tinción de zinc y espectroscopia de fluorescencia 77K6,7,8,26. Este método es adecuado para científicos que tienen como objetivo aislar PBS intacto de cianobacterias y estudiar sus propiedades espectrales, estructurales y de composición.

Hay varias ventajas de este protocolo. (1) Este método está estandarizado y se puede utilizar para aislar PBS intacto de cianobacterias unicelulares y filamentosas. La mayoría de los artículos describen el método que se aplicó en cualquiera de los dos tipos de cianobacterias4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método se realiza a temperatura ambiente, ya que el PBS se disocia a baja ^{temperatura19,27}. (3) Este método describe el uso de un batidor de cuentas para interrumpir las células; por lo tanto, es más barato y más seguro que la prensa francesa de alta presión y el posible daño auditivo del sonicador en otros métodos8,13,14,20. (4) Este método aísla PBS intacto por ultracentruga de gradiente de sacarosa. De esta manera, el PBS intacto con diferentes tamaños y PBS parcialmente disociado se puede separar en función de la concentración de sacarosa.

Protocolo

La Synechocystis sp. PCC 6803, la cepa modelo tolerante a la glucosa, se obtuvo del Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán. Leptolyngbya sp. JSC-1, el filamentoso no modelo, se obtuvo del Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU.

1. Cultivo celular y cosecha

1. Inocular células Syn6803 o JSC-1 utilizando un bucle de inoculación metálico en un matraz cónico de 100 mL que contiene 50 mL de medio B-HEPES28. Cultive las células a 30 °C bajo fotones de 50 μmol ^{m-2 s-1} (LED de luz blanca) en 1% (v/v) de _CO2 con agitación constante mediante un agitador magnético (120 rpm) hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento exponencial medio (_OD750 = 0,6-0,8).
   NOTA: Cosechar el cultivo celular cuando la densidad óptica del cultivo a 750 nm (_OD750) alcanza 0.6-0.8 transfiriéndose a un nuevo matraz. La densidad óptica se utilizó rutinariamente para estimar la densidad celular microbiana en cultivos ^líquidos29. Las longitudes de onda de 720-750 nm se utilizaron en diversos estudios para medir el crecimiento de cianobacterias30,31,32. En este protocolo, _OD750 se utiliza porque JSC-1 puede producir pigmentos que absorben la luz roja ^lejana7. Alternativamente, también se utilizó la concentración de clorofila para medir el crecimiento de ^{cianobacterias33}.
2. Transfiera el cultivo celular (_OD750 ~ 0.8) a un matraz cónico de 1L y diluirlo a _OD750 = 0.2 en 500 mL de medio B-HEPES. Cultivar el cultivo hasta la fase de crecimiento exponencial tardío (_OD750 = 0.8-1.0) en la misma condición mencionada anteriormente (paso 1.1) y luego cosechar el cultivo por centrifugación.
3. Centrifugar el cultivo a 10.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente y desechar completamente el sobrenadante.
   NOTA: Los pellets de células se pueden almacenar a -80 °C durante un máximo de 6 meses.

2. Lisis celular

1. Suspenda los gránulos celulares y lávelos dos veces con tampón de fosfato K de 0,75 M, pH 7.
   NOTA: Para hacer un tampón de fosfato de K de 0,75 M a pH 7, prepare 1,5 M de _K2HPO4 y 1,5 M de _KH2PO4 por separado. Mezclar 615 mL de 1,5 M _K2HPO4 y 385 ml de 1,5M _KH2PO4 para obtener 1,5 M K-fosfato tampón a pH 7. Simplemente diluirlo con la misma cantidad de _ddH2O para hacer 0.75 M K-fosfato tampón a pH 7.
2. Pellet las células en tubos centrífugos de 50 ml por centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un tampón de fosfato K de 0,75 M. Mida el peso húmedo del pellet mediante una balanza electrónica y resuspenda 1 g de peso húmedo del pellet en 5 ml del tampón.
   NOTA: El peso húmedo de un pellet se midió restando el peso de un tubo de centrífuga vacío del peso del tubo de centrífuga que contiene el pellet celular.
3. Agregue 1 ml de suspensión celular y 0.4-0.6 g de perlas de vidrio de 0.1 mm (consulte la Tabla de materiales) en un vial de tapa de rosca de 2 ml.
4. Rompa las celdas durante 30 s con un batidor de cuentas (consulte la Tabla de materiales). Deje que los tubos se enfríen en un baño de agua a temperatura ambiente durante 2 minutos y repita el ciclo de rotura 5 veces.
5. Después de la lisis, centrífuga los viales a 500 x g durante 10 s a temperatura ambiente. Recoge el sobrenadante con una pipeta en un tubo centrífugo de 15 ml. Lave las perlas con 0,5 ml de tampón de fosfato K de 0,75 M una vez, luego transfiéralas al mismo tubo de centrífuga.
6. Agregue Triton X-100 (2% p/v, concentración final) a la suspensión celular lisada e incube en un agitador oscilante (40 rpm) a temperatura ambiente hasta que la solución se vuelva homogénea (~20 min).
7. Centrifugar los tubos a 17.210 g durante 20 minutos para eliminar las células intactas y los restos de células grandes. Guarde el sobrenadante sin la capa superior de micela Tritón a temperatura ambiente durante un máximo de 1 h.
   NOTA: El sobrenadante contiene dos capas separadas. La capa hidrofóbica superior de Tritón X contiene proteínas de unión a la clorofila y ficobilisomas hidrofóbicos en forma de ^bastón6. La capa acuosa inferior contiene PBS soluble en agua.

3. Preparación de los tampones de gradiente de sacarosa y aislamiento de PBS

1. Hacer cuatro concentraciones de sacarosa (2.0 M, 1.0 M, 0.75 M y 0.5 M) en tampón de 0.75 M K-fosfato a pH 7.
   NOTA: Se sugiere utilizar un tampón de fosfato K de 1,5 M a pH 7 para preparar el gradiente de sacarosa porque la adición de sacarosa diluye la concentración de tampón de K-fosfato. Después de que la sacarosa esté completamente disuelta, agregue _ddH2O para ajustar la concentración a 0.75 M, pH 7.
2. Coloque 2,8 ml de tampón de sacarosa de 2,0 M en la parte inferior del tubo centrífugo de 40 ml y colóquelo con tres capas de soluciones de sacarosa (8 ml de 1,0 M; 12 ml de 0,75 m y 11 ml de 0,5 m para el tubo centrífugo de 40 ml), y finalmente contenga PBS la fracción sobrenadante (3,0 ml) (Figura 1A).
   NOTA: Agregue con cuidado la solución de sacarosa y permita que la sacarosa caiga muy lentamente dentro del tubo. Sostenga la punta de la pipeta justo encima de la superficie de la solución en el tubo mientras carga la solución. Las capas de sacarosa se pueden observar cuando se superponen lentamente.
3. Centrífuga los gradientes resultantes a 125.800 x g durante ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: Se requiere una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) para este paso.
4. Tras la ultracentruga, condensar el PBS fraccionado y las ficobiliproteínas entre las capas. Se observaron bandas azules en Syn6803 (bandas púrpuras mostradas en JSC-1) en las interfaces (Figura 1D).
5. Recoge lentamente las fracciones con una pipeta de la parte superior de los gradientes de sacarosa. Retire la sacarosa concentrando repetidamente (3.500 x g durante 20 min) y diluyendo las fracciones con un tampón de fosfato K de 0,75 M en unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 10 K, ver Tabla de Materiales).

4. Medición de la fluorescencia de PBS a 77K

NOTA: Un fluorímetro equipado con un contenedor de nitrógeno líquido (ver Tabla de Materiales) se utiliza para medir espectros de fluorescencia a 77K.

1. Diluya la muestra concentrada de PBS con un tampón de fosfato K de 0,75 M para obtener al menos 500 μL.
   NOTA: Las concentraciones de ficocianina de las muestras fueron de ~4,2 μg ^mL-1 según la fórmula: (_OD615 0,474 x _OD652)/5,34 [mg/mL]³⁴.
2. Agregue 500 μL de la muestra de PBS a un tubo de vidrio transparente y congele el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado. Mueva el tubo congelado a un recipiente Transparente de Dewar (consulte la Tabla de materiales) prellenado con nitrógeno líquido.
   NOTA: El diámetro interior del tubo de vidrio es de 3 mm en este protocolo. Se utilizaron tubos de vidrio delgados para minimizar la reabsorción de la emisión de longitud de onda corta en la muestra.
3. Elija las longitudes de onda de excitación para la ficoeritrina y la ficocianina para que sean 550 nm y 580 nm, respectivamente.
   NOTA: Las emisiones de fluorescencia se registraron de 560-800 nm (para excitación de 550 nm) o 600-800 nm (para excitación de 580 nm).

5. Análisis SDS-PAGE de PBS

1. Intercambio tampón de las muestras concentradas de PBS en 0,75 M de K-fosfato con 50 mM de tampón Tris (pH 8,0) en unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular 3K, ver Tabla de Materiales).
2. Mezclar 50 μL de solución de PBS con 10 μL de tampón de carga 6x SDS [300 mM Tris pH 6.8, 12% (p/v) dodecil sulfato de sodio, 0.06% (p/v) azul de bromfenol, 50% (v/v) glicerol, 6% (v/v) β-Mercaptoetanol] (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga e incubar a 95 °C durante 10 min en un bloque de calor.
3. Separe las muestras de proteínas mediante SDS-PAGE (8%-20% (p/v) gel de poliacrilamida) y continúe con la tinción de zinc y Coomassie. El procedimiento detallado se ha descrito en la ^Referencia8.
4. Para la tinción de zinc, incube el gel en una solución de ZnSO4 de 50 mM durante 10 min a temperatura ambiente, lave el gel con agua destilada y visualice la fluorescencia inducida por zinc bajo irradiación UV (312 nm).
5. Para la tinción de azul coomassie, incube el gel en tampón de tinción Coomassie Blue [0.25% (p/v) de Coomassie R-250, 10% (v/v) de ácido acético, 50% (v/v) de metanol, ver Tabla de materiales] durante 1 h a temperatura ambiente. Lave el gel con agua destilada dos veces para eliminar el tampón de tinción residual e incube el gel con tampón de detención [10% (v / v) ácido acético, 30% (v / v) metanol] en un agitador de balanceo (40 rpm) a temperatura ambiente durante la noche. Visualice el gel completamente desmovido con una cámara digital o un escáner.

Resultados

Las células Syn6803 y JSC-1 se cultivaron en matraces cónicos con agitación constante en medio B-HEPES a 30 °C, bajo una luz blanca LED (50 fotones μmol ^m-2s-1) en una cámara de crecimiento llena de 1% (v/v) de _CO2. En la fase de crecimiento exponencial (_OD750 = ~0.5), las células se subcultivaron en medio fresco con una densidad óptica final _OD750 = ~0.2. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial tardío (_OD750 = 0,6-0,8), los cultiv...

Discusión

Este protocolo describe un método simple y estándar para aislar PBS intacto en dos tipos de cianobacterias, el modelo unicelular Syn6803 y el filamentoso no modelo JSC-1. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización celular y la ultracentrifugación en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. En general, la interrupción de las células filamentosas es más complicada que las unicelulares. El aumento de la cantidad del material de partida (el peso húmedo del pellet celular) y la repetición del b...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer