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要約

現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。

要約

シアノバクテリアでは、フィコビリソームは光を収穫し、光化学のために光システムIとIIにエネルギーを伝達する重要なアンテナタンパク質複合体です。系統の構造と組成を研究することは、シアノバクテリアにおける光合成の進化と発散を明らかにするため、科学者にとって大きな関心事です。このプロトコルは、ビードビーターによって効率的にシアノバクテリア細胞を低コストで破壊する詳細かつ最適化された方法を提供します。その後、無傷のフィコビリソームを、ショ糖勾配超遠心分離によって細胞抽出物から分離することができる。この方法は、異なる細胞タイプのモデルおよび非モデルシアノバクテリアの両方に適している実証されている。77K蛍光分光法と硫酸亜鉛とクマシーブルー染色SDS-PAGEによるフィコビリタンパク質の完全性と性質を確認するためのステップバイステップの手順も提供されています。分離されたフィコビリソームは、さらなる構造解析および組成解析を行うこともできます。全体として、このプロトコルは、シアノバクテリアに精通していない研究者が無傷のフィコビリソームを迅速に単離し、特徴付けることを可能にする有用な開始ガイドを提供する。

概要

フィコビリソーム(PBS)は、シアノバクテリア1のチラコイド膜中の光系の細胞質側に付着する巨大な水溶性色素タンパク質複合体です。PBSは主に、着色されたフィコビリタンパク質と無色リンカータンパク質1,2で構成されています。フィコビリタンパク質は、フィコエリスリン、フィコエリコシアニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン3の4つの主要なグループに分けることができます。4つの主要なグループは、クロロフィルが非効率的に吸収した490〜650nmの範囲で光エネルギーの異なる波長を吸収する3。PBSは光エネルギーを集め、それを光システムIIおよびI4に渡すライトハーベニングアンテナとして役立つことができる。

PBSの構造と組成は種によって異なります。総称して、異なるシアノバクテリア種5において、フィコビリソーム(ヘミディスコジアル、束状、および棒状)の3つの形状が同定されている。同種においても、PBSの組成は、光質や栄養枯渇などの環境に応じて変化する6,7,8,9,10,11。そこで、シアノバクテリアからPBSを単離する実験手順は、PBS12の研究に役立っています。数十年にわたり、多くの異なるプロトコルがPBSを分離し、その構造、組成、および機能6,7,8,12,13,14,15,16,17を分析してきました。PBSの分離のための多種多様な方法は確かに異なる試薬および器械と異なった種の複合体を単離する柔軟性を提供する。しかし、それはまた、シアノバクテリアやPBSに慣れていない科学者にとって、適切なプロトコルを選択することがより困難になります。したがって、チアノバクテリアからのPBS分離を開始することに興味がある人のために、この研究では一般化された簡単なプロトコルが開発されています。

前の出版物からPBSを分離する方法をここに要約します。PBSは水溶性タンパク質複合体であり容易に解約されるため、抽出時にPBSを安定化させるために高いイオン強度リン酸緩衝液が必要となる。チアノバクテリウムからのPBSの分離方法を記述したいくつかの研究記事が過去に公開されています。.ほとんどの方法は、高濃度のリン酸緩衝液8,14,15,18,19を必要とする。しかし、細胞の機械的破壊のための手順は、例えば、ガラスビーズ支援抽出、超音波20、およびフランスの圧知6、8,14など、様々です。異なるフィコビリタンパク質は、硫酸アンモニウム20で沈殿し、HPLC21またはクロマトグラフィーカラム22で精製することによって得ることができる。一方、無傷のPBSは、スクロース密度勾配超遠心分離6,8,15によって容易に単離することができる。

このプロトコルでは、1つのモデルシアノバクテリウムと1つの非モデルシアノバクテリウムがPBS分離の材料として使用されました。これらは、モデル単細胞グルコース耐性シネクロシスティスsp.PCC 6803(以下Syn6803)および非モデル糸状レプトレングビヤsp.JSC-1(以下JSC-1)、それぞれ7,23,24である。このプロトコルは、高イオン強度リン酸緩衝液中の単細胞および糸状シアノバクテリアの破壊によって始まります。溶解後、上清を遠心分離によって回収し、非イオン性洗剤(Triton X-100)で処理し、チラコイド膜から水溶性タンパク質を可溶化する。全水溶性タンパク質は、不連続なスクロース密度勾配に適用され、PBSを分画する。このプロトコルの不連続なスクロース勾配は、4つのスクロース溶液で構成され、スクロース層25の最下端に無傷のPBSを仕分ける。PBSの完全性はSDS-PAGE、亜鉛染色、および77K蛍光分光法6、7、8、26によって分析することができる。この方法は、シアノバクテリアから無傷のPBSを分離し、そのスペクトル、構造、および組成特性を研究することを目指す科学者に適しています。

このプロトコルには、いくつかの利点があります。(1)この方法は標準化されており、単細胞および糸状シアノバクテリアの両方から無傷のPBSを単離するために使用することができます。ほとんどの記事は、いずれかのタイプのシアノバクテリア4、7,8,12,13,14,16,18に適用される方法を記載しています。(2)この方法は室温で行い、PBSが低温19,27で解化するようにする。(3) この方法は、ビーズビーターを使用して細胞を破壊する方法を説明します。したがって、それは高圧フランスのプレスよりも安価で安全であり、他の方法で超音波処理器からの損傷を聞く可能性8、13、14、20。(4)この方法は、スクロース勾配超遠心分離により、そのままPBSを分離する。このようにして、異なるサイズおよび部分的に解離したPBSを有する無傷のPBSは、スクロース濃度に基づいて分離することができる。

プロトコル

シネコシスティスsp. PCC 6803は、モデルグルコース耐性株を、台湾のアカデミア・シニカのチュウ・シュアン博士から得た。非モデルフィラメントであるレプトロンビー sp. JSC-1 は、米国ペンシルベニア州立大学のドナルド・A・ブライアント博士から入手しました。

1. 細胞培養と収穫

  1. 金属接種ループを用いてSyn6803またはJSC-1細胞を50mLのB-HEPES培地28を含む100 mL円錐形フラスコに接種します。30°C下で30°C50 μmol光子m-2 s-1 (白色光LED)で細胞を1%(v/v)CO2 で培養し、磁気スターラー(120rpm)で一定の攪拌を行い、培養が中指数成長期(OD750 = 0.6-0.8)に達するまで培養します。
    注:新しいフラスコに移すことによって、750 nm(OD750)で培養した光学密度が0.6-0.8に達した場合に細胞培養を収穫します。光学密度は、液体培養液中の微生物細胞密度を推定するために日常的に使用された29。720〜750nmの波長をシアノバクテリアの増殖を測定するための様々な研究に使用しました30,31,32。このプロトコルでは、JSC-1が遠赤色光7を吸収する顔料を生成できるため、OD750が使用されます。あるいは、シアノバクテリア33の増殖を測定するためにクロロフィル濃度も使用された。
  2. 細胞培養物(OD750 ~0.8)を1L円錐形フラスコに移し、500mLのB-HEPES培地中でOD750 =0.2に希釈します。上記と同じ条件(ステップ1.1)で後期指数成長期(OD750 =0.8-1.0)まで培養を成長させ、遠心分離によって培養物を収穫する。
  3. 室温で20分間10,000xg で培養を遠心し、上清を完全に捨てます。
    注:細胞ペレットは、6ヶ月まで-80 °Cで保存することができます。

2. 細胞のライシス

  1. 細胞ペレットを懸濁し、0.75 M K-リン酸バッファー pH 7 で 2 回洗浄します。
    注:pH 7で0.75 M Kリン酸バッファーを作るために、K2HPO4の1.5 MおよびKH2PO4の1.5 Mを別々に準備して下さい。1.5 M K2HPO4の615 mLと1.5M KH2PO4の385 mlを混合して、pH 7で1.5 M Kリン酸バッファーを得る。同量のddH2Oで希釈するだけで、pH7で0.75M K-リン酸バッファーを作ります。
  2. ペレットは、室温で20分間10,000 x g で遠心分離することにより50 mL遠心分離管で細胞をペレット化します。上清を捨て、0.75 M K-リン酸バッファーで細胞を再懸濁します。電子バランスでペレットの湿重量を測定し、バッファーの5mLにペレットの1gの湿潤重量を再懸濁する。
    注:ペレットの湿式重量は、細胞ペレットを含む遠心管の重量から空の遠心管の重量を差し引くことによって測定した。
  3. セルサスペンション1mL、0.1mmガラスビーズ( 材料表参照)を2mLスクリューキャップバイアルに加えます。
  4. ビーズビーターで30 sのセルを分割します( 材料表を参照)。チューブを室温の水浴で2分間冷却し、破断サイクルを5回繰り返します。
  5. リシス後、バイアルを室温で10sの場合は500xgで遠心する。 15 mL遠心チューブにピペットで上清を収集します。0.5 mLの0.75 M K-リン酸バッファーでビーズを1回洗い、同じ遠心管に移します。
  6. Lysed細胞懸濁液にTriton X-100(2%w/v、最終濃度)を加え、溶液が均質になるまで室温(40rpm)でロッキングシェーカー(40rpm)でインキュベートします(〜20分)。
  7. チューブを17,210gで20分間遠心分離し、無傷の細胞と大きな細胞の破片を除去します。上トリトンミセル層を含まない上清を室温で1時間保存します。
    注: 上清には 2 つの分離されたレイヤーが含まれています。上の疎水性トリトンX層は、クロロフィル結合タンパク質および疎水性棒状のフィコビリソーム6を含む。下層水層は水溶性PBSを含む。

3. スクロースの勾配バッファーとPBS分離の調製

  1. pH 7で4つの濃度のショ糖(2.0 M、1.0 M、0.75 Mおよび0.5 M)を0.75 M K-リン酸緩衝液で作ります。
    注:スクロースを添加するとK-リン酸緩衝液の濃度が希薄化するため、pH 7で1.5M K-リン酸バッファーを使用してスクロース勾配を調製することが推奨されます。スクロースを完全に溶解させた後、ddH2Oを加えて濃度を0.75M、pH7に調整します。
  2. 2.0 Mショ糖バッファーの 2.8 mL を 40 mL 遠心分離管の下部に配置し、3 層のショ糖溶液(1.0 M の 8 mL、0.75 M の 12 mL、0.5 M の 11 mL を 40 mL 遠心分離管)に重ね合わせ、最後に PBS 含有の超遠分率 (図 1)) を配置します。
    注:慎重にスクロース溶液を追加し、スクロースがチューブの内部に非常にゆっくりと落とすようにします。ピペットチップをチューブ内の溶液表面のすぐ上に持ち、溶液をロードします。スクロース層は、ゆっくりと層化すると観察できる。
  3. 25°Cで〜16h-20 hの125,800 x g で得られた勾配の遠心分離:このステップには超遠心分離機( 材料表を参照)が必要です。
  4. 超遠心分離時に、画層間の分画されたPBSとフィコビリタンパク質を凝縮する。インターフェースでは、Syn6803の青色帯(JSC-1に示された紫色のバンド)が観察されました(図1D)。
  5. ショ糖勾配の上からピペットで分数をゆっくりと収集します。繰り返し濃縮(3,500 x g 20分間)、膜遠心フィルター単位で0.75 M K-リン酸バッファーで分画を希釈することにより、スクロースを除去します(10 K分子量カットオフ、 材料表を参照)。

4. 77KでのPBS蛍光測定

注:液体窒素容器を搭載した蛍光計( 材料表参照)を用いて、77Kで蛍光スペクトルを測定します。

  1. 濃縮したPBSサンプルを0.75 M K-リン酸バッファーで希釈し、少なくとも 500 μL を得ます。
    注:サンプルのフィコシアニン濃度は、式に基づいて〜4.2 μg mL-1 であった:(OD615 0.474 x OD652)/5.34[mg/mL]34。
  2. 透明なガラスチューブにPBSサンプル500μLを加え、完全に凍結するまで液体窒素でチューブを凍結します。液体窒素であらかじめ充填された透明なデュワーコンテナ( 材料表を参照)に凍結チューブを移動します。
    注:ガラス管の内径は、このプロトコルでは3mmです。薄いガラス管を用いて、試料中の短波長発光の再吸収を最小限に抑えた。
  3. フィコエリスリンとフィコシアニンの励起波長をそれぞれ550 nmと580 nmに選択します。
    注:蛍光放出は560-800 nm(550 nm励起用)または600-800 nm(580 nm励起用)から記録されました。

5. PBSのSDS-ページ分析

  1. バッファー交換は、膜遠心フィルター単位でトリスバッファー(pH 8.0)の50 mMとK-リン酸の0.75 Mで濃縮PBSサンプルを交換します (3K分子量カットオフ, 材料表参照)。
  2. 6x SDSローディングバッファの10 μLでPBS溶液50 μLを混合する[300 mM Tris pH 6.8、 12%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、0.06%(w/v)ブロフェンノールブルー、50%(v/v)グリセロール、6%(v/v)βメルカプトエタノール]マイクロ遠心チューブ( 材料表を参照)、95°Cで95°Cで熱ブロックで10分間インキュベートします。
  3. タンパク質サンプルをSDS-PAGE(8%-20%(w/v)ポリアクリルアミドゲル)で分離し、亜鉛とクマシー染色を継続します。詳細な手順については、Reference8 で説明されています。
  4. 亜鉛染色の場合、ゲルを室温で10分間50 mM ZnSO4 溶液でインキュベートし、蒸留水でゲルを洗浄し、UV照射(312nm)下で亜鉛誘導蛍光を可視化します。
  5. クマシーブルー染色の場合、クーマシーブルー染色バッファー[0.25%(w/v)のクーマッシーR-250、酢酸の10%(v/v)、メタノールの50%(v/v)、室温で1時間の 材料表を参照してください。蒸留水でゲルを2回洗浄して残留染色バッファーを除去し、ゲルを脱染色バッファー[10%(v/v)酢酸、30%(v/v)メタノール)を室温でロッキング シェーカー(40 rpm)でインキュベートします。デジタルカメラまたはスキャナで完全にデステインゲルを可視化します。

結果

Syn6803およびJSC-1細胞は、1%(v/v)CO2で満たされた成長室で、B-HEPES培地で一定の攪拌を行い、LED白色光(50μmol光子m-2s-1)下で円錐形フラスコで培養した。指数成長期(OD750=〜0.5)において、細胞を最終光学密度OD750=〜0.2で新鮮な培地にサブ培養した。後期指数成長相(OD750 = 0.6-0.8)に達した後、培養物を回収し、遠心分離(20分間室温で10,000 x g)した?...

ディスカッション

このプロトコルは、シアノバクテリア、単細胞モデルSyn6803、および糸状非モデルJSC-1で無傷のPBSを単離するための簡単で標準的な方法を説明しています。プロトコルの重要なステップは、セルの均質化とスクロースの不連続な密度勾配の超遠心化です。一般的に、糸状細胞の破壊は単細胞細胞よりも複雑である。出発物質の量(細胞ペレットの湿重量)およびビーズ叩きの繰り返し量を増加さ?...

開示事項

著者らは競合する関心を宣言しない。

謝辞

著者らは、超遠心分離機の便利な使用のために、国立台湾大学ライフサイエンス大学テクノロジー・コモンズに感謝している。シアノバクテリア株 シネコシスティス sp.PCC 6803と レプトリンビヤ sp.JSC-1は、米国ペンシルベニア州立大学のアカデミア・シニカのチュウ博士、シーウアン、ドナルド・A・ブライアント博士からそれぞれ贈られました。この研究は、理工省(台湾)(109-2636-B-002-013-および110-2628-B-002-065-)と文部省(台湾)の湯山若手学者プログラム(109V11102および110V1102)によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mm glass beadsBioSpec11079101for PBS extraction
13 mL centrifugation tubeHitachi13PAultracentrifugation
40 mL centrifugation tubeHitachi40PAultracentrifugation
Acetic acidMerck8.1875.2500for Coomassie Blue staining
B-HEPES mediumA modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250SigmaB-0149for Coomassie Blue staining
Bromophenol blueWako pure chemical industries2-291protein loading buffer
Electronic balanceRadwagWLC 2/A2/C/2for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometerHitachiF-7000Spectrophotometer
GlycerolBioShopGly001.500protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifugeHitachiCR22Nfor buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessoryHitachi5J0-0112The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
MethanolMerck1.07018,2511for Coomassie Blue staining
MicrocentrifugeThermo FisherPico 21for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607for PBS extraction
Potassium phosphate dibasicPanReac AppliChem121512.121for PBS extraction
Potassium phosphate monobasicPanReac AppliChem141509.121for PBS extraction
Screw cap vialBioSpec10832for PBS extraction
SmartView Pro ImagerMajor ScienceUVCI-2300for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfateZymesetBSD101protein loading buffer
SucroseZymesetBSU101for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
TrisBioShopTRS 011.1protein loading buffer
Triton X-100BioShopTRX 506.500for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filterMilliporeUFC901024for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filterMilliporeUFC500324for buffer exchange
UltracentrifugeHitachiCP80WXultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometerAgilentCary 60Spectrophotometer
Zinc sulfatePanReac AppliChem131787.121for Znic staining
β-MercaptoethanolBioBasicMB0338protein loading buffer

参考文献

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