Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

Riepilogo

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

Abstract

Nei cianobatteri, il ficobilisoma è un complesso proteico antenna vitale che raccoglie la luce e trasferisce energia al fotosistema I e II per la fotochimica. Studiare la struttura e la composizione del ficobilisoma è di grande interesse per gli scienziati perché rivela l'evoluzione e la divergenza della fotosintesi nei cianobatteri. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato e ottimizzato per rompere le cellule cianobatteriche a basso costo da un battitore di perline in modo efficiente. Il ficobilisoma intatto può quindi essere isolato dall'estratto cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo metodo ha dimostrato di essere adatto sia per cianobatteri modello che non modello con diversi tipi di cellule. Viene inoltre fornita una procedura passo-passo per confermare l'integrità e la proprietà delle ficobiliproteine mediante spettroscopia di fluorescenza 77K e SDS-PAGE colorato da solfato di zinco e Coomassie Blue. Il ficobilisoma isolato può anche essere sottoposto ad ulteriori analisi strutturali e compositive. Nel complesso, questo protocollo fornisce un'utile guida di partenza che consente ai ricercatori che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare e caratterizzare rapidamente il ficobilisoma intatto.

Introduzione

Il ficobilisoma (PBS) è un enorme complesso pigmento-proteina solubile in acqua che si attacca al lato citoplasmatico dei fotosistemi nelle membrane tilacoidi dei ^{cianobatteri1}. La PBS è composta principalmente da ficobiliproteine colorate e proteine linker ^incolori1,2. Le ficobiliproteine possono essere suddivise in quattro gruppi principali: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina e alloficocianina3. I quattro gruppi principali assorbono diverse lunghezze d'onda dell'energia luminosa nell'intervallo 490-650 nm, che le clorofille hanno assorbito in modo ^{inefficiente3}. Il PBS può fungere da antenna per la raccolta della luce per la raccolta dell'energia luminosa e la consegna al fotosistema II e ^I4.

La struttura e la composizione del PBS variano da specie a specie. Collettivamente, tre forme di ficobilisoma (emidiscodiale, a forma di fascio e a forma di bastoncello) sono state identificate in diverse specie cianobatteriche5. Anche nella stessa specie, la composizione del PBS cambia in risposta all'ambiente, come la qualità della luce e l'esaurimento dei nutrienti6,7,8,9,10,11. Pertanto, la procedura sperimentale per isolare PBS dai cianobatteri è stata determinante nello studio di ^PBS12. Nel corso di diversi decenni, molti protocolli diversi hanno isolato PBS e analizzato la sua struttura, composizione e funzione6,7,8,12,13,14,15,16,17. L'ampia varietà di metodi per l'isolamento PBS fornisce infatti flessibilità nell'isolare il complesso in diverse specie con diversi reagenti e strumenti. Tuttavia, rende anche più difficile la scelta di un protocollo adatto per gli scienziati che non hanno familiarità con cianobatteri e PBS. Pertanto, in questo lavoro viene sviluppato un protocollo generalizzato e diretto per coloro che sono interessati ad avviare l'isolamento PBS dai cianobatteri.

I metodi per isolare PBS dalle pubblicazioni precedenti sono riassunti qui. Poiché PBS è un complesso proteico solubile in acqua ed è facilmente dissociato, è necessario un tampone fosfato ad alta forza ionica per stabilizzare PBS durante ^{l'estrazione18}. Diversi articoli di ricerca che descrivono i metodi per l'isolamento della PBS dal cianobatterio sono stati pubblicati in passato. La maggior parte dei metodi richiede un'alta concentrazione di tampone fosfato8,14,15,18,19. Tuttavia, le procedure per l'interruzione meccanica delle cellule variano, come l'estrazione assistita da perle di vetro, la ^{sonicazione20} e la stampa francese6,8,14. Diverse ficobiliproteine possono essere ottenute per precipitazione con solfato di ^ammonio20 e purificate da ^HPLC21 o da una colonna cromatografica22. D'altra parte, il PBS intatto può essere facilmente isolato dall'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio6,8,15.

In questo protocollo, un cianobatterio modello e un cianobatterio non modello sono stati utilizzati come materiali per l'isolamento PBS. Sono modello unicellulare tollerante al glucosio Synechocystis sp. PCC 6803 (di seguito Syn6803) e Leptolyngbya sp. filamentosa non modello JSC-1 (di seguito JSC-1), rispettivamente7,23,24. Il protocollo inizia con l'interruzione dei cianobatteri unicellulari e filamentosi in un tampone fosfato ad alta resistenza ionica. Dopo la lisi, i supernatanti vengono raccolti per centrifugazione e quindi trattati con un detergente non ionico (Triton X-100) per solubilizzare le proteine idrosolubili dalle membrane tilacoidi. Le proteine idrosolubili totali vengono applicate a un gradiente di densità discontinuo di saccarosio per frazionare il PBS. Il gradiente discontinuo di saccarosio in questo protocollo è costituito da quattro soluzioni di saccarosio e suddivide il PBS intatto nelle frazioni più basse dello strato di ^saccarosio25. L'integrità del PBS può essere analizzata mediante SDS-PAGE, colorazione dello zinco e spettroscopia di fluorescenza 77K6,7,8,26. Questo metodo è adatto per gli scienziati che mirano a isolare PBS intatto dai cianobatteri e studiare le sue proprietà spettrali, strutturali e compositive.

Ci sono diversi vantaggi di questo protocollo. (1) Questo metodo è standardizzato e può essere utilizzato per isolare PBS intatto da cianobatteri sia unicellulari che filamentosi. La maggior parte degli articoli descrive il metodo che si applicava in entrambi i tipi di cianobatteri4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Questo metodo viene eseguito a temperatura ambiente, poiché PBS si dissocia a bassa ^{temperatura19,27}. (3) Questo metodo descrive l'uso di un battitore di perline per interrompere le cellule; pertanto, è più economico e più sicuro della stampa francese ad alta pressione e possibili danni all'udito da sonicatore in altri metodi8,13,14,20. (4) Questo metodo isola il PBS intatto mediante ultracentrizzazione a gradiente di saccarosio. In questo modo, PBS intatto con dimensioni diverse e PBS parzialmente dissociato può essere separato in base alla concentrazione di saccarosio.

Protocollo

Il Synechocystis sp. PCC 6803, il ceppo modello tollerante al glucosio, è stato ottenuto dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, il filamentoso non modello, è stato ottenuto dal Dr. Donald A. Bryant della Pennsylvania State University, USA.

1. Coltura cellulare e raccolta

1. Inoculare le celle Syn6803 o JSC-1 utilizzando un anello di inoculazione metallico in un pallone conico da 100 ml contenente 50 mL di B-HEPES ^medium28. Coltura le cellule a 30 °C sotto 50 μmol fotoni ^{m-2 s-1} (LED a luce bianca) in 1% (v/v) di _CO2 con agitazione costante da parte di un agitatore magnetico (120 rpm) fino a quando la coltura raggiunge la fase di crescita media-esponenziale (_OD750 = 0,6-0,8).
   NOTA: Raccogliere la coltura cellulare quando la densità ottica della coltura a 750 nm (_OD750) raggiunge 0,6-0,8 trasferendola in un nuovo pallone. La densità ottica è stata abitualmente utilizzata per stimare la densità delle cellule microbiche in colture ^liquide29. Le lunghezze d'onda da 720-750 nm sono state utilizzate in vari studi per misurare la crescita cianobatterica30,31,32. In questo protocollo, _OD750 viene utilizzato perché JSC-1 può produrre pigmenti che assorbono la luce rossa ^lontana7. In alternativa, la concentrazione di clorofilla è stata utilizzata anche per misurare la crescita dei ^{cianobatteri33}.
2. Trasferire la coltura cellulare (_OD750 ~ 0,8) in un matraccio conico da 1 L e diluirla a _OD750 = 0,2 in 500 mL di terreno B-HEPES. Coltivare la coltura fino alla fase di crescita esponenziale tardiva (_OD750 = 0,8-1,0) nella stessa condizione sopra menzionata (fase 1.1) e quindi raccogliere la coltura mediante centrifugazione.
3. Centrifugare la coltura a 10.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente ed eliminare completamente il surnatante.
   NOTA: I pellet di celle possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi.

2. Lisi cellulare

1. Sospendere i pellet cellulari e lavare due volte con tampone K-fosfato da 0,75 M, pH 7.
   NOTA: Per produrre un tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7, preparare separatamente 1,5 M di _K2HPO4 e 1,5 M di _KH2PO4. Mescolare 615 mL di 1,5 M _K2HPO4 e 385 ml di 1,5M _KH2PO4 per ottenere 1,5 M di tampone K-fosfato a pH 7. Basta diluirlo con la stessa quantità di _ddH2O per ottenere un tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7.
2. Pellet le celle in tubi centrifuga da 50 mL mediante centrifugazione a 10.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospese le cellule con un tampone K-fosfato da 0,75 M. Misurare il peso umido del pellet con una bilancia elettronica e risospesare 1 g di peso umido del pellet in 5 mL del tampone.
   NOTA: Il peso umido di un pellet è stato misurato sottraendo il peso di un tubo centrifugo vuoto dal peso del tubo della centrifuga contenente il pellet cellulare.
3. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare e 0,4-0,6 g di perle di vetro da 0,1 mm (vedere Tabella dei materiali) in un flaconcino con tappo a vite da 2 mL.
4. Rompere le celle per 30 s da un battitore di perline (vedi Tabella dei materiali). Lasciare raffreddare i tubi a bagnomaria a temperatura ambiente per 2 minuti e ripetere il ciclo di rottura 5 volte.
5. Dopo la lisi, centrifugare i flaconcini a 500 x g per 10 s a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante con una pipetta in un tubo centrifugo da 15 ml. Lavare le perline con 0,5 mL di tampone K-fosfato da 0,75 M una volta, quindi trasferirle nello stesso tubo della centrifuga.
6. Aggiungere Triton X-100 (2% p/v, concentrazione finale) alla sospensione cellulare lisata e incubare su uno shaker a dondolo (40 rpm) a temperatura ambiente fino a quando la soluzione diventa omogenea (~20 min).
7. Centrifugare i tubi a 17.210 g per 20 minuti per rimuovere le celle intatte e i detriti cellulari di grandi dimensioni. Conservare il surnatante senza lo strato superiore di micella Triton a temperatura ambiente per un massimo di 1 ora.
   NOTA: il surnatante contiene due strati separati. Lo strato idrofobico superiore di Triton X contiene proteine leganti la clorofilla e ficobilisomi idrofobici a forma di ^bastoncello6. Lo strato acquoso inferiore contiene PBS solubile in acqua.

3. Preparazione dei tamponi gradienti di saccarosio e isolamento PBS

1. Effettuare quattro concentrazioni di saccarosio (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M e 0,5 M) in tampone K-fosfato da 0,75 M a pH 7.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare un tampone K-fosfato da 1,5 M a pH 7 per preparare il gradiente di saccarosio perché l'aggiunta di saccarosio diluisce la concentrazione di tampone K-fosfato. Dopo che il saccarosio è completamente disciolto, aggiungere _ddH2O per regolare la concentrazione a 0,75 M, pH 7.
2. Posizionare 2,8 mL di tampone di saccarosio da 2,0 M sul fondo del tubo della centrifuga da 40 mL e sovrapporre con tre strati di soluzioni di saccarosio (8 mL di 1,0 M; 12 mL di 0,75 M e 11 mL di 0,5 M per tubo centrifugo da 40 mL), e infine PBS contenente la frazione surnatante (3,0 mL) (Figura 1A).
   NOTA: Aggiungere con cautela la soluzione di saccarosio e lasciare che il saccarosio goccioli molto lentamente all'interno del tubo. Tenere la punta della pipetta appena sopra la superficie della soluzione nel tubo durante il caricamento della soluzione. Gli strati di saccarosio possono essere osservati quando sono stratificati lentamente.
3. Centrifugare i gradienti risultanti a 125.800 x g per ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: per questo passaggio è necessaria un'ultracentrifuga (vedi Tabella dei materiali).
4. Dopo l'ultracentocuzione, condensare il PBS frazionato e le ficobiliproteine tra gli strati. Bande blu in Syn6803 (bande viola mostrate in JSC-1) sono state osservate nelle interfacce (Figura 1D).
5. Raccogliere lentamente le frazioni con una pipetta dalla parte superiore dei gradienti di saccarosio. Rimuovere il saccarosio concentrandosi ripetutamente (3.500 x g per 20 min) e diluendo le frazioni con tampone K-fosfato da 0,75 M in unità filtranti centrifughe a membrana (cut-off a peso molecolare 10 K, vedere Tabella dei materiali).

4. Misurazione della fluorescenza PBS a 77K

NOTA: Un fluorimetro dotato di un contenitore di azoto liquido (vedi Tabella dei materiali) viene utilizzato per misurare gli spettri di fluorescenza a 77K.

1. Diluire il campione PBS concentrato con tampone K-fosfato da 0,75 M per ottenere almeno 500 μL.
   NOTA: Le concentrazioni di ficocianina dei campioni erano ~4,2 μg ^mL-1 in base alla formula: (_OD615 0,474 x _OD652)/5,34 [mg/mL]³⁴.
2. Aggiungere 500 μL del campione PBS a un tubo di vetro trasparente e congelare il tubo in azoto liquido fino a quando non è completamente congelato. Spostare il tubo congelato in un contenitore Dewar trasparente (vedi Tabella dei materiali) preriempito con azoto liquido.
   NOTA: Il diametro interno del tubo di vetro è di 3 mm in questo protocollo. Sono stati utilizzati sottili tubi di vetro per ridurre al minimo il riassorbimento dell'emissione di lunghezza d'onda corta nel campione.
3. Scegli le lunghezze d'onda di eccitazione per la ficoeritrina e la ficocianina rispettivamente a 550 nm e 580 nm.
   NOTA: le emissioni di fluorescenza sono state registrate da 560-800 nm (per l'eccitazione a 550 nm) o 600-800 nm (per l'eccitazione a 580 nm).

5. Analisi SDS-PAGE di PBS

1. Scambio tampone dei campioni PBS concentrati in 0,75 M di K-fosfato con 50 mM di tampone Tris (pH 8,0) in unità filtranti centrifughe a membrana (cut-off a peso molecolare 3K, vedi Tabella dei materiali).
2. Mescolare 50 μL di soluzione PBS con 10 μL di 6x tampone di carico SDS [300 mM Tris pH 6,8, 12% (p/v) sodio dodecil solfato, 0,06% (p/v) blu bromfenolo, 50% (v/v) glicerolo, 6% (v/v) β-mercaptoetanolo] (vedere Tabella dei materiali) in un tubo di microrifrifuga e incubare a 95 °C per 10 minuti in un blocco termico.
3. Separare i campioni proteici con SDS-PAGE (8%-20% (p/v) gel di poliacrilammide) e continuare con la colorazione di zinco e Coomassie. La procedura dettagliata è stata descritta in ^Reference8.
4. Per la colorazione dello zinco, incubare il gel in soluzione ZnSO4 da 50 mM per 10 minuti a temperatura ambiente, lavare il gel con acqua distillata e visualizzare la fluorescenza indotta dallo zinco sotto irradiazione UV (312 nm).
5. Per la colorazione blu Coomassie, incubare il gel nel tampone colorante Coomassie Blue [0,25% (p/v) di Coomassie R-250, 10% (v/v) di acido acetico, 50% (v/v) di metanolo, vedere Tabella dei materiali] per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare il gel con acqua distillata due volte per rimuovere il tampone di colorazione residuo e incubare il gel con tampone di destaining [10% (v/v) acido acetico, 30% (v/v) metanolo] su uno shaker a dondolo (40 rpm) a temperatura ambiente durante la notte. Visualizza il gel completamente decorticato con una fotocamera digitale o uno scanner.

Risultati

Le cellule Syn6803 e JSC-1 sono state coltivate in palloni conici con agitazione costante in mezzo B-HEPES a 30 °C, sotto una luce bianca a LED (50 fotoni μmol ^m-2s-1) in una camera di crescita riempita con l'1% (v/v) di _CO2. Nella fase di crescita esponenziale (_OD750 = ~0,5), le cellule sono state sottocoltate in mezzo fresco con una densità ottica finale _OD750 = ~0,2. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale tardiva (_OD750 = 0,6-0,8), le c...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo semplice e standard per isolare PBS intatto in due tipi di cianobatteri, il modello unicellulare Syn6803 e il filamentoso non modello JSC-1. Le fasi critiche del protocollo sono l'omogeneizzazione cellulare e l'ultracentrifugazione su un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Generalmente, la distruzione delle cellule filamentose è più complicata di quelle unicellulari. L'aumento della quantità di materiale di partenza (il peso umido del pellet cellulare) e la ripetizione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer