시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

요약

현재 프로토콜은 불연속 자당 밀도 그라데이션을 통해 원심분리에 의한 시아노박테리아로부터의 피코빌리좀의 분리를 자세히 설명합니다. 그대로 피코빌리좀의 분획은 77K 형광 스펙트럼 및 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된다. 결과 물리경분획은 TEM 및 질량 분광법 분석의 음수 염색에 적합합니다.

초록

시아노박테리아에서 피코빌리솜은 빛을 수확하고 광화학을 위해 광시스템 I와 II로 에너지를 전달하는 중요한 안테나 단백질 복합체입니다. 식물성 생물의 구조와 구성을 연구하는 것은 시아노 박테리아에서 광합성의 진화와 차이를 드러내기 때문에 과학자들에게 큰 관심사입니다. 이 프로토콜은 비드 비터에 의해 저렴한 비용으로 시아노균 세포를 분해하는 상세하고 최적화된 방법을 제공합니다. 그대로 피코빌리솜은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 세포 추출물로부터 분리될 수 있다. 이 방법은 다른 세포 모형을 가진 모형 및 비 모형 시아노박테리아 둘 다에 적합한 다는 것을 보여주었습니다. 또한 77K 형광 분광기 및 아연 황산염 및 쿠마시 블루에 의해 얼룩진 SDS-PAGE에 의해 물리 코빌리단백질의 무결성과 특성을 확인하기 위한 단계별 절차가 제공됩니다. 격리된 피코빌리솜은 또한 추가 구조 및 조성 분석을 실시할 수 있다. 전반적으로,이 프로토콜은 치아 노 박테리아에 익숙하지 않은 연구원이 신속하게 분리하고 그대로 피코빌리솜을 특성화 할 수있는 유용한 시작 가이드를 제공합니다.

서문

Phycobilisome (PBS)는 시아노 박테리아¹의 틸라코이드 막에서 광시스템의 세포질 측에 부착하는 거대한 수용성 안료 단백질 복합체입니다. PBS는 주로 유색 물리 단백질과 무색 링커 단백질^1,2로 구성됩니다. 물리코빌리단백질은 물리에리스린, 피코에리스로시아닌, 피코시아닌 및 동종코시아니닌³의 4가지 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다. 4개의 주요 단은 엽록소가 비효율적으로 흡수한 490-650 nm 범위에서 다른 광에너지를 흡수합니다³. PBS는 광 에너지를 수집하고 광시스템 II 및 ^I4에 전달하기 위한 광 수확 안테나 역할을 할 수 있습니다.

PBS의 구조와 구성은 종마다 다릅니다. 전체적으로, 피코빌리솜의 세 가지 모양 (헤미디스탈, 번들 모양 및 막대 모양)은 다른 시아노박테리아 종⁵에서 확인되었습니다. 같은 종에서도 PBS의 조성은 광질 및 영양 고갈과 같은 환경에 반응하여 변화합니다6,7,8,9,10,11. 따라서, 시아노박테리아로부터 PBS를 분리하는 실험 절차는 ^PBS12를 공부하는 데 중요한 역할을 해왔다. 수십 년 동안 많은 다른 프로토콜은 PBS를 격리하고 그 구조, 구성 및 기능을 분석6,7,8,12,13,14,15,16,17. PBS 절연을 위한 다양한 방법은 실제로 다른 시약 및 계측기로 다른 종의 복합체를 분리하는 유연성을 제공합니다. 그러나, 그것은 또한 시아노 박테리아와 PBS에 익숙하지 않은 과학자에 대 한 적합 한 프로토콜을 선택 하 여 더 어렵게. 따라서, 일반화되고 간단한 프로토콜은 시아노박테리아에서 PBS 격리를 시작하는 데 관심이있는 사람들을 위해이 작품에서 개발된다.

이전 간행물에서 PBS를 격리하는 방법은 여기에 요약되어 있습니다. PBS는 수용성 단백질 복합체이며 쉽게 해리되기 때문에 추출 시 PBS를 안정화하기 위해서는 이온 강도가 높은 인산염 버퍼가 필요합니다¹⁸. 시아노박테리움에서 PBS의 격리를 위한 방법을 설명하는 몇몇 연구 기사는 과거에 간행되었습니다. 대부분의 방법은 인산염 완충제의 고농도를 필요로^{8,14,15,18,19}. 그러나, 세포의 기계적 중단을 위한 절차는 유리 구슬 보조 추출, 초음파 처리²⁰ 및 프랑스 프레스^6,8,14와 같이 변화합니다. 상이한 물리코빌리단백질은 황산암모늄을 함유한 침전을 통해 ^{얻어지고 HPLC21} 또는 크로마토그래피 컬럼²²에 의해 정제될 수 있다. 한편, 그대로 PBS는 자당밀도 그라데이션 ^6,8,15에 의해 쉽게 분리될 수 있다.

이 프로토콜에서, 1개의 모형 cyanobacterium 및 1개의 비 모형 cyanobacterium는 PBS 격리를 위한 물질로 이용되었습니다. 이들은 모델 단세포 포도당 내성 Synechocystis sp. PCC 6803 (이하 Syn6803) 및 비 모델 필라멘트 렙토렝비아 sp. JSC-1 (이하 JSC-1), 각각 ^7,23,24이다. 프로토콜은 고온 강도 인산염 버퍼에서 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아의 중단에 의해 시작됩니다. 용해 후, 슈퍼나탕은 원심분리에 의해 채취한 다음, 틸라코이드 막으로부터 수용성 단백질을 용해시키기 위해 니오니안 세제(Triton X-100)로 처리됩니다. 총 수용성 단백질은 PBS를 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 그라데이션에 적용됩니다. 이 프로토콜의 불연속 자당 그라데이션은 4개의 자당 솔루션으로 구성되며, 자당 계층²⁵의 가장 낮은 분수에서 그대로 PBS를 분할합니다. PBS의 무결성은 SDS-PAGE, 아연 염색 및 77K 형광 분광기^6,7,8,26에 의해 분석될 수 있다. 이 방법은 시아노박테리아에서 온전한 PBS를 분리하고 스펙트럼, 구조 및 조성 특성을 연구하는 것을 목표로 하는 과학자들에게 적합합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 장점이 있습니다. (1) 이 방법은 표준화되어 단세포 및 필라멘트 시아노박테리아 모두에서 온전한 PBS를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 대부분의 논문은 시아노박테리아^{4,7,8,12,13,14,16,18}의 한 가지 유형에 적용되는 방법을 설명합니다. (2) PBS가 저온^19,27에서 해리됨에 따라 이 방법은 실온에서 수행됩니다. (3) 이 방법은 비드 비터를 사용하여 세포를 방해하는 방법을 설명합니다. 따라서, 그것은 고압 프랑스어 프레스보다 저렴하고 안전하고 다른 방법으로 초음파 처리기에서 가능한 청력 손상^8,13,14,20. (4) 이 방법은 자당 그라데이션 초원심분리에 의해 그대로 PBS를 분리한다. 이러한 방식으로, 크기가 다르고 부분적으로 해리된 PBS를 가진 온전한 PBS는 자당 농도에 따라 분리될 수 있다.

프로토콜

시코시스테티스 SP. PCC 6803, 모델 포도당 내성 균주, 박사에서 얻은 추, Hsiu-An 아카데미아 시니카, 대만. 렙토렝비아 SP. JSC-1, 비 모델 필라멘트, 미국 펜실베니아 주립 대학에서 박사 도널드 A. 브라이언트에서 얻은.

1. 세포 배양 및 수확

1. 비헤페스 배지²⁸의 50mL를 포함하는 100mL 원추형 플라스크로 금속 접종 루프를 사용하여 접종Syn6803 또는 JSC-1 세포를 접종한다. 배양이 중간 지수 성장 단계(_OD750 = 0.6-0.8)에 도달할 때까지 자기 교반기(120 rpm)에 의해 일정한 교_{반을 하는} 50 μmol 광자 ^{m-2 s-1}(백색광 LED) 하에서 30°C에서 세포를 배양한다.
   참고: 750nm(_OD750)에서 배양의 광학 밀도가 0.6-0.8에 도달하면 새로운 플라스크로 이송하여 세포 배양을 수확한다. 광학 밀도는 액체 배양에서 미생물 세포 밀도를 추정하기 위해 일상적으로 사용되었다²⁹. 720-750 nm의 파장은 시아노균 성장 ^30,31,32를 측정하기 위한 다양한 연구에서 사용되었다. 이 프로토콜에서 _OD750은 JSC-1이 극^한광7을 흡수하는 안료를 생성할 수 있기 때문에 사용됩니다. 대안적으로, 엽록소 농도는 또한 시아노박테리아³³의 성장을 측정하기 위해 사용되었다.
2. 세포 배양(_OD750 ~0.8)을 1L 원추형 플라스크로 전송하고 B-HEPES 배지의 _{500mL에서 OD750} = 0.2로 희석한다. 상기(1.1단계)와 동일한 조건에서 후기 지수 성장 단계(_OD750 = 0.8-1.0)까지 배양을 성장시키고 원심분리에 의해 배양을 수확한다.
3. 원심 분리기 는 실온에서 20 분 동안 10,000 x g 의 문화를 원심분리하고 상체를 완전히 폐기합니다.
   참고: 세포 펠릿은 최대 6개월 동안 -80°C로 저장할 수 있습니다.

2. 세포 리시스

1. 세포 펠릿을 일시 중단하고 0.75 M K-인산염 완충제, pH 7로 두 번 세척한다.
   참고: pH 7에서 0.75 M K-인산염 버퍼를 만들려면 K2HPO4 1.5M, _KH2PO4 1.5M을 별도로 준비한다. pH 7에서 1.5M _K2HPO4 및 1.5M _KH2PO4 385ml의 615mL를 혼합하여 1.5M K-인산염 버퍼를 얻습니다. pH 7에서 0.75 M K-인산염 버퍼를 만들기 위해 동일한 양의 _ddH2O로 희석하기만 하면 됩니다.
2. 펠릿 은 실온에서 20 분 동안 10,000 x g 에서 원심 분리로 50 mL 원심 분리구의 세포를 펠릿합니다. 상체를 버리고 0.75 M K-인산염 버퍼로 세포를 다시 중단합니다. 전자 균형에 의해 펠릿의 젖은 무게를 측정하고 완충제의 5mL에서 펠릿의 젖은 무게 1g을 다시 중단합니다.
   참고: 펠릿의 젖은 무게는 세포 펠릿을 포함하는 원심분리기 관의 무게에서 빈 원심분리기 튜브의 무게를 빼서 측정되었다.
3. 셀 서스펜션 1mL과 0.1mm 유리 구슬 0.4-0.6g을 2mL 나사 캡 바이알에 넣습니다.
4. 비드 비터로 셀을 30s로 끊습니다( 재료 표 참조). 튜브가 실온 수조에서 2 분 동안 식히고 브레이킹 사이클을 5 번 반복하십시오.
5. 용해 후, 실온에서 10 s에 대 한 500 x g 에서 바이알원심을 원심 분리. 파이펫으로 15mL 원심분리기 튜브로 상체를 수집합니다. 구슬은 0.75 M K-인산염 버퍼0.5mL로 한 번 세척한 다음 동일한 원심분리기 튜브로 옮겨냅니다.
6. 트리톤 X-100(2% w/v, 최종 농도)을 용액이 균질해질 때까지 실온에서 흔들 셰이커(40rpm)에 인큐베이션한다.
7. 20 분 동안 17,210 g 의 튜브를 원심 분리하여 그대로 세포와 큰 세포 파편을 제거합니다. 상부 트리톤 미셀 층없이 상온에서 최대 1 시간 동안 상체를 저장합니다.
   참고: 상체에는 두 개의 분리된 레이어가 포함되어 있습니다. 상부 소수성 트리톤 X 층에는 엽록소 결합 단백질과 소수성 막대 모양의 피코빌리좀이 포함되어 있습니다⁶. 더 낮은 수성 층에는 수용성 PBS가 포함되어 있습니다.

3. 자당 그라데이션 버퍼 및 PBS 격리 준비

1. pH 7에서 0.75 M K-인산염 버퍼로 4개의 자당(2.0M, 1.0M, 0.75M 및 0.5M)의 4개의 농도를 만듭니다.
   참고: pH 7에서 1.5M K-인산염 버퍼를 사용하여 자당구를 첨가하면 K-인산염 버퍼의 농도가 희석되기 때문에 자당 그라데이션을 준비하는 것이 좋습니다. 자당이 완전히 용해 된 후 _ddH2O를 추가하여 농도를 0.75 M, pH 7로 조정합니다.
2. 2.8m의 2.8m 자당 버퍼를 40mL 원심분리기 튜브 의 바닥에 놓고 3층의 자당 용액(8mL 1.0ML, 0.75M의 12mL, 40mL 원심분리관용 0.5mL) 및 마지막으로 PBS-3(1.3)를 함유하고 있습니다.
   참고: 자당 용액을 조심스럽게 추가하고 자당이 튜브 내부에 매우 천천히 떨어질 수 있도록 합니다. 솔루션을 로드하는 동안 튜브의 솔루션 표면 바로 위에 파이펫 팁을 누릅니다. 자당 층은 천천히 계층화 될 때 관찰 할 수 있습니다.
3. 25°C.NOTE에서 ~16h-20 h에 대해 125,800 x g 의 결과 그라데이션원 원심분리기: 이 단계에 대해 초원심분리기( 재료표 참조)가 요구된다.
4. 초원심분리시, 분획된 PBS와 물리코빌리단백질을 층 사이에 응축한다. Syn6803(JSC-1에서 보여진 보라색 밴드)의 파란색 밴드가 인터페이스(그림 1D)에서 관찰되었다.
5. 자당 그라데이션의 상단에서 파이펫으로 분수를 천천히 수집합니다. 반복적으로 농축하여 자당을 제거 (3,500 x g 20 분) 멤브레인 원심 필터 단위에서 0.75 M K-인산염 완충제와 분획을 희석 (10 K 분자 량 컷오프, 재료의 표를 참조).

4. 77K에서 PBS 형광 측정

참고: 액체 질소 용기가 장착된 형광계( 재료 표 참조)는 77K에서 형광 스펙트럼을 측정하는 데 사용됩니다.

1. 농축 된 PBS 샘플을 0.75 M K-인산염 버퍼로 희석하여 적어도 500 μL을 얻습니다.
   참고: 시료의 피코시아닌 농도는 수식에 따라 ~4.2 μg ^mL-1 이었다: (_OD615 0.474 x _OD652)/5.34 [mg/mL]³⁴.
2. PBS 샘플의 500 μL을 투명 유리 튜브에 추가하고 완전히 얼릴 때까지 액체 질소로 튜브를 고정시십시오. 냉동 튜브를 액체 질소로 미리 채워진 투명 드워 용기( 재료 표 참조)로 이동합니다.
   참고: 유리 튜브의 내경은 이 프로토콜에서 3mm입니다. 얇은 유리 튜브는 샘플에서 단파장 방출의 재흡수를 최소화하기 위해 사용되었다.
3. 각각 550nm와 580nm로 물리에리트린과 피코시아닌의 난동을 선택한다.
   참고: 형광 배출량은 560-800 nm(550nm 흥분)또는 600-800 nm(580nm 흥분)에서 기록되었습니다.

5. PBS의 SDS 페이지 분석

1. 완충체는 멤브레인 원심 필터 단위(3K 분자량 컷오프, 재료표 참조)에서 50mM의 Tris 버퍼(pH 8.0)를 K-인산염 0.75M로 농축 된 PBS 샘플을 교환한다.
2. PBS 용액 50 μL을 6x SDS 로딩 버퍼의 10 μL과 혼합 [300 mM Tris pH 6.8, 12% (w/v) 나트륨 도데딜 황산염, 0.06% (w/v) 브로페놀 블루, 50% (v/v) 글리세롤, 6% (v/v) β-메르카포에탄올] 마이크로센트심분리튜브에서 95°C에서 10분간 10분간 배양하였다.
3. 단백질 샘플을 SDS-PAGE(8%-20% (w/v) 폴리아크라이글라미드 젤로 분리하고 아연 및 쿠마시 염색을 계속합니다. 자세한 절차는 ^Reference8에 설명되어 있습니다.
4. 아연 염색의 경우 실온에서 10분 동안 50mM ZnSO4 용액으로 젤을 배양하고, 증류수로 젤을 세척하고, 자외선 조사(312nm)에서 아연으로 인한 형광을 시각화합니다.
5. 쿠마시 블루 스테인링의 경우, 쿠마시 블루 스테인닝 버퍼 [0.25% (w/v) 쿠마시 R-250, 아세트산의 10% (v/v), 메탄올의 50% (v/v)의 젤을 실내 온도에서 1시간 동안 참조하십시오. 잔류 염색 버퍼를 제거하고 탈색 버퍼 [10% (v/v) 아세트산, 30% (v/v) 메탄올]으로 젤을 밤새 실온에서 흔들 셰이커(40rpm)로 배양하기 위해 증류수로 젤을 세척한다. 완전히 스테인드된 젤을 디지털 카메라 또는 스캐너로 시각화합니다.

결과

Syn6803 및 JSC-1 세포는 30°C에서 B-HEPES 배지에서 일정한 교반을 하는 원추형 플라스크에서 재배되었으며, LED 백색광(50 μmol 광자 ^m-2s-1)에서 1%(v/v) _CO2로 채워진 성장 챔버에서 재배하였다. 기하급수적 성장 단계(_OD750 = ~0.5)에서, 세포는 최종 광학 밀도 _OD750 = ~0.2를 가진 신선한 배지로 하위 배양되었다. 후기 지수 성장 단계(_OD750 = 0.6-0.8)에 도달한 후 배양...

토론

이 프로토콜은 시아노박테리아, 단세포 모델 Syn6803 및 필라멘트 비모델 JSC-1의 두 가지 유형에서 그대로 PBS를 격리하는 간단하고 표준적인 방법을 설명합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 자당의 불연속 밀도 그라데이션에 세포 균질화 및 초원심 분리입니다. 일반적으로 필라멘트 세포의 중단은 단세포 세포보다 더 복잡합니다. 시작 물질의 양을 증가 (세포 펠릿의 젖은 무게) 및 구슬 구타의 반복?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer