Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Zusammenfassung

In Cyanobakterien ist das Phycobilisom ein lebenswichtiger Antennenproteinkomplex, der Licht erntet und Energie an das Photosystem I und II für die Photochemie überträgt. Die Untersuchung der Struktur und Zusammensetzung von Phycobilisom ist für Wissenschaftler von großem Interesse, da sie die Evolution und Divergenz der Photosynthese in Cyanobakterien aufdeckt. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte und optimierte Methode, um Cyanobakterienzellen kostengünstig durch einen Perlenschläger effizient zu brechen. Das intakte Phycobilisom kann dann aus dem Zellextrakt durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden. Diese Methode hat gezeigt, dass sie sowohl für Modell- als auch für Nicht-Modell-Cyanobakterien mit unterschiedlichen Zelltypen geeignet ist. Ein schrittweises Verfahren wird auch bereitgestellt, um die Integrität und Eigenschaft von Phycobiliproteinen durch 77K-Fluoreszenzspektroskopie und SDS-PAGE, die mit Zinksulfat und Coomassie Blue gefärbt wurden, zu bestätigen. Das isolierte Phycobilisom kann auch weiteren Struktur- und Zusammensetzungsanalysen unterzogen werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen hilfreichen Startleitfaden, der es Forschern, die mit Cyanobakterien nicht vertraut sind, ermöglicht, intakte Phycobilisomen schnell zu isolieren und zu charakterisieren.

Einleitung

Phycobilisom (PBS) ist ein riesiger wasserlöslicher Pigment-Protein-Komplex, der sich an die zytoplasmatische Seite der Photosysteme in den Thylakoidmembranen von Cyanobakterien ^bindet1. PBS besteht hauptsächlich aus farbigen Phycobiliproteinen und farblosen Linkerproteinen1,2. Die Phycobiliproteine können in vier Hauptgruppen unterteilt werden: Phycoerythrin, Phycoerythrocyanin, Phycocyanin und Allophycocyanin3. Die vier Hauptgruppen absorbieren unterschiedliche Wellenlängen der Lichtenergie im Bereich von 490-650 nm, die Chlorophylle ineffizient ^{absorbierten3}. Das PBS kann als Lichtsammelantenne dienen, um Lichtenergie zu sammeln und an Photosystem II und ^I4 abzugeben.

Die Struktur und Zusammensetzung von PBS variiert von Art zu Art. Insgesamt wurden drei Formen von Phycobilisomen (hemidiscodial, bündelförmig und stäbchenförmig) in verschiedenen Cyanobakterienspezies ^{identifiziert5}. Selbst bei den gleichen Arten ändert sich die Zusammensetzung von PBS als Reaktion auf die Umwelt, wie Lichtqualität und Nährstoffmangel6,7,8,9,10,11. Daher war das experimentelle Verfahren zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien maßgeblich an der Untersuchung von ^{PBS12 beteiligt}. Über mehrere Jahrzehnte haben viele verschiedene Protokolle PBS isoliert und seine Struktur, Zusammensetzung und Funktion analysiert6,7,8,12,13,14,15,16,17. Die große Vielfalt an Methoden zur PBS-Isolierung bietet in der Tat Flexibilität bei der Isolierung des Komplexes in verschiedenen Spezies mit unterschiedlichen Reagenzien und Instrumenten. Es erschwert jedoch auch die Auswahl eines geeigneten Protokolls für Wissenschaftler, die mit Cyanobakterien und PBS nicht vertraut sind. Daher wird in dieser Arbeit ein verallgemeinertes und einfaches Protokoll für diejenigen entwickelt, die daran interessiert sind, die PBS-Isolierung aus Cyanobakterien zu beginnen.

Die Methoden zur Isolierung von PBS aus früheren Publikationen sind hier zusammengefasst. Da PBS ein wasserlöslicher Proteinkomplex ist und leicht dissoziiert werden kann, ist ein hochionischer Phosphatpuffer erforderlich, um PBS während der Extraktion zu ^{stabilisieren18}. Mehrere Forschungsartikel, die Methoden zur Isolierung von PBS aus Cyanobakterien beschreiben, wurden in der Vergangenheit veröffentlicht. Die meisten Methoden erfordern eine hohe Konzentration an Phosphatpuffer8,14,15,18,19. Die Verfahren zur mechanischen Störung der Zellen variieren jedoch, wie z. B. glasperlengestützte Extraktion, ^{Beschallung20} und French Press6,8,14. Verschiedene Phycobiliproteine können durch Fällung mit ^{Ammoniumsulfat20} gewonnen und mittels ^HPLC21 oder einer chromatographischen Säule ^{gereinigt werden22}. Auf der anderen Seite kann intaktes PBS leicht durch Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation isoliert werden6,8,15.

In diesem Protokoll wurden ein Modellcyanobakterium und ein Nicht-Modell-Cyanobakterium als Materialien für die PBS-Isolierung verwendet. Es handelt sich um einzellige glucosetolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (im Folgenden Syn6803) und nicht-modellartige filamentöse Leptolyngbya sp. JSC-1 (im Folgenden JSC-1) bzw. ^7,23,24. Das Protokoll beginnt mit dem Aufbrechen der einzelligen und filamentösen Cyanobakterien in einem hochionischen Phosphatpuffer. Nach der Lyse werden die Überstände durch Zentrifugation gesammelt und dann mit einem nichtionischen Reinigungsmittel (Triton X-100) behandelt, um die wasserlöslichen Proteine aus den Thylakoidmembranen zu lösen. Die gesamten wasserlöslichen Proteine werden auf einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um das PBS zu fraktionieren. Der diskontinuierliche Saccharosegradient in diesem Protokoll besteht aus vier Saccharoselösungen und teilt das intakte PBS in die niedrigsten Anteile der Saccharoseschicht ^auf25. Die Integrität von PBS kann durch SDS-PAGE, Zinkfärbung und 77K-Fluoreszenzspektroskopie6,7,8,26 analysiert werden. Diese Methode eignet sich für Wissenschaftler, die intaktes PBS aus Cyanobakterien isolieren und seine spektralen, strukturellen und kompositorischen Eigenschaften untersuchen wollen.

Es gibt mehrere Vorteile dieses Protokolls. (1) Diese Methode ist standardisiert und kann zur Isolierung von intaktem PBS sowohl aus einzelligen als auch aus filamentösen Cyanobakterien verwendet werden. Die meisten Artikel beschreiben die Methode, die in einer der beiden Arten von Cyanobakterien angewendet wurde4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Diese Methode wird bei Raumtemperatur durchgeführt, da PBS bei niedriger Temperatur dissoziiert19,27. (3) Diese Methode beschreibt die Verwendung eines Perlenschlägers, um die Zellen zu stören; Daher ist es billiger und sicherer als Hochdruck-French-Presse und mögliche Hörschäden durch Ultraschall in anderen Methoden8,13,14,20. (4) Diese Methode isoliert intaktes PBS durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation. Auf diese Weise können intaktes PBS mit unterschiedlichen Größen und teilweise dissoziiertes PBS basierend auf der Saccharosekonzentration getrennt werden.

Protokoll

Der Synechocystis sp. PCC 6803, der Glukose-tolerante Modellstamm, wurde von Dr. Chu, Hsiu-An an der Academia Sinica, Taiwan, erhalten. Leptolyngbya sp. JSC-1, das Nicht-Modell-Filament, wurde von Dr. Donald A. Bryant an der Pennsylvania State University, USA, erhalten.

1. Zellkultur und Ernte

1. Impfen von Syn6803- oder JSC-1-Zellen unter Verwendung einer metallischen Impfschleife in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml B-HEPES-Medium28. Kultivieren Sie die Zellen bei 30 °C unter 50 μmol Photonen ^{m-2 s-1} (Weißlicht-LED) in 1% (v/v) _CO2 unter ständigem Rühren durch einen Magnetrührer (120 U/min), bis die Kultur eine mittlere exponentielle Wachstumsphase erreicht (_OD750 = 0,6-0,8).
   ANMERKUNG: Ernten Sie die Zellkultur, wenn die optische Dichte der Kultur bei 750 nm (_OD750) 0,6-0,8 erreicht, indem Sie sie in einen neuen Kolben überführen. Die optische Dichte wurde routinemäßig verwendet, um die mikrobielle Zelldichte in flüssigen Kulturen ^{abzuschätzen29}. Die Wellenlängen von 720-750 nm wurden in verschiedenen Studien zur Messung des Cyanobakterienwachstums verwendet30,31,32. In diesem Protokoll wird _OD750 verwendet, weil JSC-1 Pigmente erzeugen kann, die fernrotes Licht ^absorbieren7. Alternativ wurde auch die Chlorophyllkonzentration verwendet, um das Wachstum von Cyanobakterien zu ^messen33.
2. Die Zellkultur (_OD750 ~0,8) wird in einen 1L-Erlenmeyerkolben überführt und auf _OD750 = 0,2 in 500 mL B-HEPES-Medium verdünnt. Züchten Sie die Kultur bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase (_OD750 = 0,8-1,0) in dem oben genannten Zustand (Schritt 1.1) und ernten Sie die Kultur dann durch Zentrifugation.
3. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 10.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand vollständig.
   HINWEIS: Die Zellpellets können bei -80 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.

2. Zelllyse

1. Suspendieren Sie die Zellpellets und waschen Sie sie zweimal mit 0,75 M K-Phosphatpuffer, pH 7.
   ANMERKUNG: Um 0,75 M K-Phosphatpuffer bei pH 7 herzustellen, werden 1,5 M _K2HPO4 und 1,5 M _KH2PO4 separat hergestellt. Mischen Sie 615 ml 1,5 M _K2HPO4 und 385 ml 1,5 M _KH2PO4, um 1,5 M K-Phosphatpuffer bei pH 7 zu erhalten. Verdünnen Sie es einfach mit der gleichen Menge _ddH2O, um 0,75 M K-Phosphatpuffer bei pH 7 herzustellen.
2. Pelletieren Sie die Zellen in 50 mL Zentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen mit 0,75 M K-Phosphat-Puffer. Messen Sie das Nassgewicht des Pellets mit einer elektronischen Waage und resuspendieren Sie 1 g Nassgewicht des Pellets in 5 ml des Puffers.
   ANMERKUNG: Das Nassgewicht eines Pellets wurde gemessen, indem das Gewicht eines leeren Zentrifugenröhrchens vom Gewicht des Zentrifugenröhrchens, das das Zellpellet enthielt, abgezogen wurde.
3. 1 ml Zellsuspension und 0,4-0,6 g 0,1 mm Glasperlen (siehe Materialtabelle) in eine 2 mL Schraubverschlussfläschchen geben.
4. Brechen Sie die Zellen für 30 s mit einem Perlenschläger (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Schläuche in einem Wasserbad bei Raumtemperatur 2 min abkühlen und wiederholen Sie den Bremszyklus 5 Mal.
5. Nach der Lyse zentrifugieren Sie die Fläschchen bei 500 x g für 10 s bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 0,5 ml 0,75 M K-Phosphat-Puffer und geben Sie sie dann in dasselbe Zentrifugenröhrchen um.
6. Triton X-100 (2% w/v, Endkonzentration) in die lysierte Zellsuspension geben und auf einem Schaukelschüttler (40 U/min) bei Raumtemperatur inkubieren, bis die Lösung homogen wird (~20 min).
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.210 g für 20 min, um die intakten Zellen und großen Zelltrümmer zu entfernen. Lagern Sie den Überstand ohne die obere Triton-Mizellenschicht bei Raumtemperatur bis zu 1 h.
   HINWEIS: Der Überstand enthält zwei getrennte Schichten. Die obere hydrophobe Triton-X-Schicht enthält Chlorophyll-bindende Proteine und hydrophobe stäbchenförmige Phycobilisomen6. Die untere wässrige Schicht enthält wasserlösliches PBS.

3. Vorbereitung der Saccharose-Gradientenpuffer und PBS-Isolierung

1. Vier Konzentrationen Saccharose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M und 0,5 M) in 0,75 M K-Phosphat-Puffer bei pH 7 herstellen.
   ANMERKUNG: Es wird empfohlen, 1,5 M K-Phosphatpuffer bei pH 7 zu verwenden, um den Saccharosegradienten herzustellen, da die Zugabe von Saccharose die Konzentration des K-Phosphatpuffers verdünnt. Nachdem saccharose vollständig gelöst ist, fügen Sie _ddH2O hinzu, um die Konzentration auf 0,75 M, pH 7 einzustellen.
2. 2,8 ml 2,0 m Saccharosepuffer am Boden des 40 mL Zentrifugenröhrchens platzieren und mit drei Schichten Saccharoselösungen (8 ml 1,0 m; 12 ml 0,75 m und 11 ml 0,5 m für 40 ml Zentrifugenröhrchen) überlagern und schließlich PBS-haltiger Überstandsfraktion (3,0 ml) (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Fügen Sie vorsichtig die Saccharoselösung hinzu und lassen Sie die Saccharose sehr langsam in das Röhrchen fallen. Halten Sie die Pipettenspitze knapp über der Oberfläche der Lösung in das Röhrchen, während Sie die Lösung laden. Saccharoseschichten können beobachtet werden, wenn sie langsam geschichtet werden.
3. Zentrifugieren Sie die resultierenden Gradienten bei 125.800 x g für ~16h-20 h bei 25 °C.HINWEIS: Für diesen Schritt ist eine Ultrazentrifuge (siehe Materialtabelle) erforderlich.
4. Kondensieren Sie bei der Ultrazentrifugation die fraktionierten PBS- und Phycobiliproteine zwischen den Schichten. Blaue Bänder in Syn6803 (violette Bänder in JSC-1) wurden in den Grenzflächen beobachtet (Abbildung 1D).
5. Sammeln Sie die Fraktionen langsam mit einer Pipette von der Oberseite der Saccharosegradienten. Entfernen Sie die Saccharose durch wiederholtes Konzentrieren (3.500 x g für 20 min) und Verdünnen der Fraktionen mit 0,75 M K-Phosphatpuffer in Membranzentrifugalfiltereinheiten (10 K Molekulargewichtsgrenzwert, siehe Materialtabelle).

4. Messung der PBS-Fluoreszenz bei 77K

HINWEIS: Ein Fluorimeter, das mit einem Behälter für flüssigen Stickstoff ausgestattet ist (siehe Materialtabelle), wird verwendet, um Fluoreszenzspektren bei 77K zu messen.

1. Verdünnen Sie die konzentrierte PBS-Probe mit 0,75 M K-Phosphat-Puffer, um mindestens 500 μL zu gewinnen.
   ANMERKUNG: Die Konzentrationen von Phycocyanin der Proben betrugen ~4,2 μg ^mL-1 basierend auf der Formel: (_OD615 0,474 x _OD652)/5,34 [mg/ml]³⁴.
2. Geben Sie 500 μL der PBS-Probe in ein transparentes Glasröhrchen und frieren Sie das Röhrchen in flüssigem Stickstoff ein, bis es vollständig gefroren ist. Bewegen Sie das gefrorene Röhrchen in einen transparenten Dewar-Behälter (siehe Materialtabelle), der mit flüssigem Stickstoff vorgefüllt ist.
   HINWEIS: Der Innendurchmesser des Glasrohrs beträgt in diesem Protokoll 3 mm. Dünne Glasröhren wurden verwendet, um die Resorption der kurzwelligen Emission in der Probe zu minimieren.
3. Wählen Sie die Anregungswellenlängen für Phycoerythrin und Phycocyanin auf 550 nm bzw. 580 nm.
   ANMERKUNG: Fluoreszenzemissionen wurden von 560-800 nm (für 550 nm Anregung) oder 600-800 nm (für 580 nm Anregung) aufgezeichnet.

5. SDB-PAGE Analyse von PBS

1. Pufferaustausch der konzentrierten PBS-Proben in 0,75 M K-Phosphat mit 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) in Membranzentrifugalfiltereinheiten (3K Molekulargewichts-Cut-off, siehe Materialtabelle).
2. Mischen Sie 50 μL PBS-Lösung mit 10 μL 6x SDS-Ladepuffer [300 mM Tris pH 6,8, 12% (w/v) Natriumdodecylsulfat, 0,06% (w/v) Bromphenolblau, 50% (v/v) Glycerin, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (siehe Materialtabelle) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie bei 95 °C für 10 min in einem Hitzeblock.
3. Trennen Sie die Proteinproben durch SDS-PAGE (8%-20% (w/v) Polyacrylamidgel) und fahren Sie mit der Zink- und Coomassie-Färbung fort. Das detaillierte Vorgehen wurde in ^Referenz8 beschrieben.
4. Zur Zinkfärbung das Gel in 50 mM ZnSO4-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, das Gel mit destilliertem Wasser waschen und zinkinduzierte Fluoreszenz unter UV-Bestrahlung (312 nm) visualisieren.
5. Für die Coomassie-Blaufärbung wird das Gel in Coomassie Blue-Färbepuffer [0,25 % (w/v) Coomassie R-250, 10 % (v/v) Essigsäure, 50 % (v/v) Methanol, siehe Materialtabelle] für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie das Gel zweimal mit destilliertem Wasser, um den verbleibenden Färbepuffer zu entfernen, und inkubieren Sie das Gel mit entwertendem Puffer [10% (v/v) Essigsäure, 30% (v/v) Methanol] auf einem Schaukelschüttler (40 U/min) bei Raumtemperatur über Nacht. Visualisieren Sie das vollständig entfleckte Gel mit einer Digitalkamera oder einem Scanner.

Ergebnisse

Die Zellen Syn6803 und JSC-1 wurden in konischen Kolben unter ständigem Rühren in B-HEPES-Medium bei 30 °C unter einem LED-Weißlicht (50 μmol Photonen ^m-2s-1) in einer mit 1% (v/v) _CO2 gefüllten Wachstumskammer kultiviert. In der exponentiellen Wachstumsphase (_OD750 = ~0,5) wurden die Zellen in frisches Medium mit einer endgültigen optischen Dichte _OD750 = ~0,2 subkulturiert. Nach Erreichen der späten exponentiellen Wachstumsphase (_OD750 = 0,6-0,8)...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und Standardmethode zur Isolierung von intaktem PBS in zwei Arten von Cyanobakterien, dem einzelligen Modell Syn6803 und dem fadenförmigen Nicht-Modell JSC-1. Die kritischen Schritte des Protokolls sind die Zellhomogenisierung und die Ultrazentrifugation auf einem diskontinuierlichen Dichtegradienten von Saccharose. Im Allgemeinen ist die Störung von filamentösen Zellen komplizierter als einzellige. Die Erhöhung der Menge des Ausgangsmaterials (das Nassgewicht des Zellpellets...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy.
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer