Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

Résumé

Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Résumé

Chez les cyanobactéries, le phycobilisome est un complexe protéique d’antenne vital qui récolte la lumière et transfère de l’énergie aux photosystèmes I et II pour la photochimie. L’étude de la structure et de la composition du phycobilisome est d’un grand intérêt pour les scientifiques car elle révèle l’évolution et la divergence de la photosynthèse chez les cyanobactéries. Ce protocole fournit une méthode détaillée et optimisée pour casser efficacement les cellules cyanobactériennes par un batteur de perles. Le phycobilisome intact peut ensuite être isolé de l’extrait cellulaire par ultracentrifugation par gradient de saccharose. Cette méthode s’est avérée adaptée aux cyanobactéries modèles et non modèles avec différents types de cellules. Une procédure étape par étape est également fournie pour confirmer l’intégrité et la propriété des phycobiliprotéines par spectroscopie de fluorescence 77K et SDS-PAGE coloré par sulfate de zinc et bleu de Coomassie. Le phycobilisome isolé peut également être soumis à d’autres analyses structurelles et compositionnelles. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un guide de départ utile qui permet aux chercheurs qui ne connaissent pas les cyanobactéries d’isoler et de caractériser rapidement les phycobilisomes intacts.

Introduction

Le phycobilisome (PBS) est un énorme complexe pigment-protéine soluble dans l’eau qui se fixe au côté cytoplasmique des photosystèmes dans les membranes thylakoïdes des cyanobactéries1. Le PBS est principalement composé de phycobiliprotéines colorées et de protéines linker ^incolores1,2. Les phycobiliprotéines peuvent être divisées en quatre grands groupes : la phycoérythrine, la phycoérythricyanine, la phycocyanine et l’allophycocyanine3. Les quatre grands groupes absorbent différentes longueurs d’onde d’énergie lumineuse dans la gamme de 490 à 650 nm, que les chlorophylles absorbent de manière ^inefficace3. Le PBS peut servir d’antenne de collecte de lumière pour collecter l’énergie lumineuse et la fournir aux photosystèmes II et ^I4.

La structure et la composition du PBS varient d’une espèce à l’autre. Collectivement, trois formes de phycobilisomes (hémidiscodiales, en forme de faisceau et en forme de bâtonnet) ont été identifiées chez différentes espèces de cyanobactéries5. Même chez la même espèce, la composition du PBS change en fonction de l’environnement, comme la qualité de la lumière et l’épuisement des nutriments6,7,8,9,10,11. Par conséquent, la procédure expérimentale visant à isoler le PBS des cyanobactéries a joué un rôle déterminant dans l’étude du ^PBS12. Pendant plusieurs décennies, de nombreux protocoles différents ont isolé le PBS et analysé sa structure, sa composition et sa fonction6,7,8,12,13,14,15,16,17. La grande variété de méthodes d’isolement pbs offre en effet une flexibilité dans l’isolation du complexe chez différentes espèces avec différents réactifs et instruments. Cependant, cela rend également le choix d’un protocole approprié plus difficile pour les scientifiques peu familiers avec les cyanobactéries et le PBS. Par conséquent, un protocole généralisé et simple est développé dans ce travail pour ceux qui s’intéressent à commencer l’isolement PBS des cyanobactéries.

Les méthodes d’isolement du PBS des publications précédentes sont résumées ici. Étant donné que le PBS est un complexe protéique soluble dans l’eau et qu’il est facilement dissocié, un tampon phosphate à haute résistance ionique est nécessaire pour stabiliser le PBS pendant ^{l’extraction18}. Plusieurs articles de recherche décrivant des méthodes d’isolement du PBS à partir de cyanobactéries ont été publiés dans le passé. La plupart des méthodes nécessitent une forte concentration de tampon phosphate8,14,15,18,19. Cependant, les procédures de perturbation mécanique des cellules varient, telles que l’extraction assistée par billes de verre, la ^sonication20 et la presse Français ^6,8,14. Différentes phycobiliprotéines peuvent être obtenues par précipitation avec du sulfate ^{d’ammonium20} et purifiées par ^CLHP21 ou une colonne ^{chromatographique22}. D’autre part, le PBS intact peut être facilement isolé par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose6,8,15.

Dans ce protocole, une cyanobactérie modèle et une cyanobactérie non modèle ont été utilisées comme matériaux pour l’isolation PBS. Il s’agit de Synechocystis sp. PCC 6803 (ci-après Syn6803) et de Leptolyngbya sp. JSC-1 filamenteux non modèle, tolérant au glucose, et de Leptolyngbya sp. JSC-1 (ci-après JSC-1), ^{respectivement7,23,24}. Le protocole commence par la perturbation des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses dans un tampon phosphate à haute résistance ionique. Après lyse, les surnageants sont collectés par centrifugation puis traités avec un détergent non ionique (Triton X-100) pour solubiliser les protéines hydrosolubles des membranes thylakoïdes. Les protéines totales solubles dans l’eau sont appliquées sur un gradient de densité de saccharose discontinu pour fractionner le PBS. Le gradient de saccharose discontinu dans ce protocole se compose de quatre solutions de saccharose et divise le PBS intact dans les fractions les plus faibles de la couche de ^saccharose25. L’intégrité du PBS peut être analysée par SDS-PAGE, coloration au zinc et spectroscopie de fluorescence 77K6,7,8,26. Cette méthode convient aux scientifiques qui visent à isoler le PBS intact des cyanobactéries et à étudier ses propriétés spectrales, structurelles et compositionnelles.

Il y a plusieurs avantages de ce protocole. (1) Cette méthode est normalisée et peut être utilisée pour isoler le PBS intact des cyanobactéries unicellulaires et filamenteuses. La plupart des articles décrivent la méthode qui s’appliquait à l’un ou l’autre type de cyanobactéries4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Cette méthode est réalisée à température ambiante, car le PBS se dissocie à basse ^{température19,27}. (3) Cette méthode décrit l’utilisation d’un batteur de perles pour perturber les cellules; par conséquent, il est moins cher et plus sûr que la presse à Français à haute pression et les dommages auditifs possibles du sonicator dans d’autres méthodes8,13,14,20. (4) Cette méthode isole le PBS intact par ultracentrifugation par gradient de saccharose. De cette façon, le PBS intact avec différentes tailles et le PBS partiellement dissocié peuvent être séparés en fonction de la concentration en saccharose.

Protocole

La Synechocystis sp. PCC 6803, la souche modèle tolérante au glucose, a été obtenue auprès du Dr Chu, Hsiu-An à l’Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, le filamenteux non modèle, a été obtenu auprès du Dr Donald A. Bryant à la Pennsylvania State University, aux États-Unis.

1. Culture cellulaire et récolte

1. Inoculez des cellules Syn6803 ou JSC-1 à l’aide d’une boucle d’inoculation métallique dans une fiole conique de 100 mL contenant 50 mL de milieu B-HEPES28. Cultiver les cellules à 30 °C sous 50 μmol photons ^{m-2 s-1} (LED à lumière blanche) dans 1% (v/v) de _CO2 sous agitation constante par un agitateur magnétique (120 tr/min) jusqu’à ce que la culture atteigne une phase de croissance moyenne exponentielle (_OD750 = 0,6-0,8).
   REMARQUE: Récoltez la culture cellulaire lorsque la densité optique de la culture à 750 nm (_OD750) atteint 0,6-0,8 en transférant dans une nouvelle fiole. La densité optique a été couramment utilisée pour estimer la densité des cellules microbiennes dans les cultures ^liquides29. Les longueurs d’onde de 720 à 750 nm ont été utilisées dans diverses études pour mesurer la croissance des cyanobactéries30,31,32. Dans ce protocole, _OD750 est utilisé parce que JSC-1 peut produire des pigments qui absorbent la lumière rouge ^lointaine7. Alternativement, la concentration de chlorophylle a également été utilisée pour mesurer la croissance des cyanobactéries33.
2. Transférer la culture cellulaire (_OD750 ~ 0,8) dans une fiole conique de 1 L et la diluer dans _OD750 = 0,2 dans 500 mL de milieu B-HEPES. Cultiver la culture jusqu’à la phase de croissance exponentielle tardive (_OD750 = 0,8-1,0) dans le même état mentionné ci-dessus (étape 1.1) puis récolter la culture par centrifugation.
3. Centrifuger la culture à 10 000 x g pendant 20 min à température ambiante et éliminer complètement le surnageant.
   REMARQUE: Les granulés de cellules peuvent être conservés à -80 ° C jusqu’à 6 mois.

2. Lyse des cellules

1. Suspendez les granulés de la cellule et lavez deux fois avec un tampon K-phosphate de 0,75 M, pH 7.
   REMARQUE: Pour faire un tampon de K-phosphate de 0,75 M à pH 7, préparer 1,5 M de _K2HPO4 et 1,5 M de _KH2PO4 séparément. Mélanger 615 mL de 1,5 M _K2HPO4 et 385 ml de 1,5 M _KH2PO4 pour obtenir un tampon K-phosphate de 1,5 M à pH 7. Il suffit de le diluer avec la même quantité de _ddH2O pour obtenir un tampon K-phosphate de 0,75 M à pH 7.
2. Pelleter les cellules dans des tubes centrifuges de 50 mL par centrifugation à 10 000 x g pendant 20 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec un tampon K-phosphate de 0,75 M. Mesurer le poids humide de la pastille à l’aide d’une balance électronique et remettre en suspension 1 g de poids humide de la pastille dans 5 mL du tampon.
   REMARQUE: Le poids humide d’une pastille a été mesuré en soustrayant le poids d’un tube de centrifugeuse vide du poids du tube de centrifugeuse contenant la pastille de cellule.
3. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire et 0,4 à 0,6 g de billes de verre de 0,1 mm (voir tableau des matériaux) dans un flacon à bouchon à vis de 2 mL.
4. Casser les cellules pendant 30 s à l’aide d’un batteur de perles (voir Tableau des matériaux). Laissez les tubes refroidir dans un bain-marie à température ambiante pendant 2 min et répétez le cycle de rupture 5 fois.
5. Après lyse, centrifuger les flacons à 500 x g pendant 10 s à température ambiante. Recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Lavez les billes avec 0,5 mL de tampon K-phosphate de 0,75 M une fois, puis transférez-les dans le même tube de centrifugeuse.
6. Ajouter Triton X-100 (2 % p/v, concentration finale) à la suspension à cellules lysées et incuber sur un agitateur à bascule (40 tr/min) à température ambiante jusqu’à ce que la solution devienne homogène (~20 min).
7. Centrifuger les tubes à 17 210 g pendant 20 min pour éliminer les cellules intactes et les gros débris cellulaires. Conservez le surnageant sans la couche supérieure de triton micelle à température ambiante jusqu’à 1 h.
   REMARQUE : Le surnageant contient deux couches séparées. La couche hydrophobe supérieure de Triton X contient des protéines de liaison à la chlorophylle et des phycobilisomes hydrophobes en forme de bâtonnet6. La couche aqueuse inférieure contient du PBS soluble dans l’eau.

3. Préparation des tampons de gradient de saccharose et isolation PBS

1. Faire quatre concentrations de saccharose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M et 0,5 M) dans un tampon K-phosphate de 0,75 M à pH 7.
   REMARQUE: Il est suggéré d’utiliser un tampon K-phosphate de 1,5 M à pH 7 pour préparer le gradient de saccharose, car l’ajout de saccharose dilue la concentration de tampon K-phosphate. Une fois le saccharose complètement dissous, ajouter du _ddH2O pour ajuster la concentration à 0,75 M, pH 7.
2. Placer 2,8 mL de tampon de saccharose de 2,0 M au fond du tube de centrifugeuse de 40 mL et superposer avec trois couches de solutions de saccharose (8 mL de 1,0 M; 12 mL de 0,75 M et 11 mL de 0,5 M pour tube centrifuge de 40 mL), et enfin PBS contenant la fraction surnageante (3,0 mL) (Figure 1A).
   REMARQUE: Ajoutez soigneusement la solution de saccharose et laissez le saccharose tomber très lentement à l’intérieur du tube. Tenez l’embout de la pipette juste au-dessus de la surface de la solution dans le tube pendant le chargement de la solution. Les couches de saccharose peuvent être observées lorsqu’elles sont stratifiées lentement.
3. Centrifuger les gradients résultants à 125 800 x g pendant ~16h-20 h à 25 °C.NOTE: Une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) est nécessaire pour cette étape.
4. Lors de l’ultra-centrifugation, condenser le PBS fractionné et les phycobiliprotéines entre les couches. Des bandes bleues dans Syn6803 (bandes violettes montrées dans JSC-1) ont été observées dans les interfaces (Figure 1D).
5. Collectez lentement les fractions avec une pipette à partir du haut des gradients de saccharose. Éliminer le saccharose en concentrant à plusieurs reprises (3 500 x g pendant 20 min) et en diluant les fractions avec un tampon K-phosphate de 0,75 M dans des unités de filtration centrifuge à membrane (seuil de poids moléculaire de 10 K, voir tableau des matériaux).

4. Mesure de la fluorescence PBS à 77K

REMARQUE: Un fluorimètre équipé d’un récipient d’azote liquide (voir tableau des matériaux) est utilisé pour mesurer les spectres de fluorescence à 77K.

1. Diluer l’échantillon concentré de PBS avec un tampon K-phosphate de 0,75 M pour obtenir au moins 500 μL.
   REMARQUE : Les concentrations de phycocyanine des échantillons étaient d’environ 4,2 μg ^mL-1 selon la formule suivante : (_OD615 0,474 x _OD652)/5,34 [mg/mL]³⁴.
2. Ajouter 500 μL de l’échantillon de PBS dans un tube en verre transparent et congeler le tube dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé. Déplacez le tube congelé dans un récipient Dewar transparent (voir tableau des matériaux) prérempli d’azote liquide.
   REMARQUE: Le diamètre intérieur du tube de verre est de 3 mm dans ce protocole. Des tubes de verre minces ont été utilisés pour minimiser la réabsorption de l’émission de courte longueur d’onde dans l’échantillon.
3. Choisissez les longueurs d’onde d’excitation de la phycoérythrine et de la phycocyanine à 550 nm et 580 nm, respectivement.
   REMARQUE: Les émissions de fluorescence ont été enregistrées de 560 à 800 nm (pour une excitation de 550 nm) ou de 600 à 800 nm (pour une excitation de 580 nm).

5. Analyse SDS-PAGE du PBS

1. Échange tampon des échantillons concentrés de PBS dans 0,75 M de K-phosphate avec 50 mM de tampon Tris (pH 8,0) dans des unités de filtration centrifuge à membrane (seuil de poids moléculaire 3K, voir Tableau des matériaux).
2. Mélanger 50 μL de solution de PBS avec 10 μL de tampon de chargement SDS 6x [300 mM Tris pH 6,8, 12 % (p/v) de dodécylsulfate de sodium, 0,06 % (p/v) de bleu de bromphénol, 50 % (v/v) de glycérol, 6 % (v/v) β-mercaptoéthanol] (voir tableau des matériaux) dans un tube de microcentrifuge et incuber à 95 °C pendant 10 min dans un bloc thermique.
3. Séparez les échantillons de protéines par SDS-PAGE (gel de polyacrylamide à 8% à 20% (p / v)) et continuez avec la coloration au zinc et à Coomassie. La procédure détaillée a été décrite dans la référence ⁸.
4. Pour la coloration au zinc, incuber le gel dans une solution de ZnSO4 de 50 mM pendant 10 min à température ambiante, laver le gel avec de l’eau distillée et visualiser la fluorescence induite par le zinc sous irradiation UV (312 nm).
5. Pour la coloration bleu Coomassie, incuber le gel dans un tampon de coloration Coomassie Blue [0,25 % (p/v) de Coomassie R-250, 10 % (v/v) d’acide acétique, 50 % (v/v) de méthanol, voir tableau des matières] pendant 1 h à température ambiante. Laver le gel avec de l’eau distillée deux fois pour éliminer le tampon de coloration résiduel et incuber le gel avec un tampon de déscoloration [10% (v / v) d’acide acétique, 30% (v / v) de méthanol] sur un agitateur à bascule (40 tr / min) à température ambiante pendant la nuit. Visualisez le gel entièrement coloré avec un appareil photo numérique ou un scanner.

Résultats

Les cellules Syn6803 et JSC-1 ont été cultivées dans des flacons coniques avec agitation constante en milieu B-HEPES à 30 °C, sous une lumière blanche LED (photons ^m-2s-1 de 50 μmol) dans une chambre de croissance remplie de 1% (v/v) de _CO2. À la phase de croissance exponentielle (_OD750 = ~0,5), les cellules ont été sous-cultivées en milieu frais avec une densité optique finale _OD750 = ~0,2. Après avoir atteint la phase de croissance exponentielle tardiv...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple et standard pour isoler le PBS intact dans deux types de cyanobactéries, le modèle unicellulaire Syn6803 et le non-modèle filamenteux JSC-1. Les étapes critiques du protocole sont l’homogénéisation cellulaire et l’ultracentrifugation sur un gradient de densité discontinu de saccharose. Généralement, la perturbation des cellules filamenteuses est plus compliquée que les cellules unicellulaires. L’augmentation de la quantité de matière première (le poids humide de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 mm glass beads	BioSpec	11079101	for PBS extraction
13 mL centrifugation tube	Hitachi	13PA	ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube	Hitachi	40PA	ultracentrifugation
Acetic acid	Merck	8.1875.2500	for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium			A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue	Wako pure chemical industries	2-291	protein loading buffer
Electronic balance	Radwag	WLC 2/A2/C/2	for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer	Hitachi	F-7000	Spectrophotometer
Glycerol	BioShop	Gly001.500	protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR22N	for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1			from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory	Hitachi	5J0-0112	The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectra
Methanol	Merck	1.07018,2511	for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic	PanReac AppliChem	121512.121	for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic	PanReac AppliChem	141509.121	for PBS extraction
Screw cap vial	BioSpec	10832	for PBS extraction
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate	Zymeset	BSD101	protein loading buffer
Sucrose	Zymeset	BSU101	for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803			glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	protein loading buffer
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC901024	for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter	Millipore	UFC500324	for buffer exchange
Ultracentrifuge	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer	Agilent	Cary 60	Spectrophotometer
Zinc sulfate	PanReac AppliChem	131787.121	for Znic staining
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	protein loading buffer