Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Resumen

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Resumen

La tomografía de coherencia óptica (OCT) ofrece un método no invasivo para el diagnóstico de la retinopatía. La máquina OCT puede capturar imágenes transversales de la retina a partir de las cuales se puede calcular el grosor de la retina. Aunque la OCT es ampliamente utilizada en la práctica clínica, su aplicación en la investigación básica no es tan frecuente, especialmente en animales pequeños como los ratones. Debido al pequeño tamaño de sus globos oculares, es difícil realizar exámenes de imágenes de fondo de ojo en ratones. Por lo tanto, se requiere un sistema especializado de imágenes de retina para acomodar las imágenes de OCT en animales pequeños. Este artículo demuestra un sistema específico de animales pequeños para los procedimientos de examen de la OCT y un método detallado para el análisis de imágenes. Se presentan los resultados del examen de OCT retiniana de ratones knockout con receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (Vldlr) y ratones C57BL / 6J. Las imágenes OCT de ratones C57BL / 6J mostraron capas retinianas, mientras que las de ratones knockout Vldlr mostraron neovascularización subretiniana y adelgazamiento de la retina. En resumen, el examen de OCT podría facilitar la detección y medición no invasiva de la retinopatía en modelos de ratón.

Introducción

La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una técnica de imagen que puede proporcionar imágenes in vivo de alta resolución y transversales para el tejido 1,2,3,4,5,6,7,8, especialmente para el examen no invasivo en la retina 9,10,11,12 . También se puede utilizar para cuantificar algunos biomarcadores importantes, como el grosor de la retina y el grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina. El principio de la OCT es la reflectometría de coherencia óptica, que obtiene información tisular transversal a partir de la coherencia de la luz reflejada de una muestra y la convierte en una forma gráfica o digital a través de un sistema informático⁷. La OCT es ampliamente utilizada en las clínicas de oftalmología como una herramienta esencial para el diagnóstico, seguimiento y manejo de pacientes con trastornos de la retina. También puede proporcionar información sobre la patogénesis de las enfermedades de la retina.

Además de las aplicaciones clínicas, la OCT también se ha utilizado en estudios con animales. Aunque la patología es el estándar de oro de la caracterización morfológica, la OCT tiene la ventaja de las imágenes in vivo no invasivas y el seguimiento longitudinal. Además, se ha demostrado que la OCT está bien correlacionada con la histopatología en modelos animales de retinopatía 11,13,14,15,16,17,18,19,20. El ratón es el animal más utilizado en estudios biomédicos. Sin embargo, sus pequeños globos oculares plantean un desafío técnico para la realización de imágenes de OCT en ratones.

En comparación con la OCT utilizada por primera vez para imágenes de la retina en ratones^21,22, la OCT en animales pequeños ahora se ha optimizado con respecto a los sistemas de hardware y software. Por ejemplo, la OCT, en combinación con el seguidor, reduce significativamente la relación señal-ruido; Las actualizaciones del sistema de software OCT permiten detectar automáticamente más capas de retina; y el proyector DLP integrado ayuda a reducir los artefactos de movimiento.

El receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (Vldlr) es una proteína transmembrana en las células endoteliales. Se expresa en las células endoteliales vasculares de la retina, en las células epiteliales pigmentarias de la retina y alrededor de la membrana limitante externa^23,24. La neovascularización subretiniana es el fenotipo de los ratones knockout Vldlr ²³. Por lo tanto, los ratones knockout Vldlr se utilizan para investigar la patogénesis y la terapia potencial de la neovascularización subretiniana. Este artículo demuestra la aplicación de imágenes OCT para detectar lesiones retinianas en ratones knockout Vldlr, con la esperanza de proporcionar alguna referencia técnica para la investigación de la retinopatía en modelos de animales pequeños.

Protocolo

Las operaciones se realizaron siguiendo la Declaración sobre el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología. El diseño experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal institucional (Comité de Ética Médica de JSIEC, EC 20171213(4)-P01). En este estudio se utilizaron ratones C57BL / 6J de dos meses de edad y ratones knockout Vldlr . Había 7 ratones en cada grupo, todos los cuales eran hembras y pesaban de 20 g a 24 g.

1. Condiciones experimentales

1. Asigne los ratones a dos grupos: un grupo experimental formado por ratones knockout Vldlr y un grupo de control formado por ratones C57BL/6J.
2. Alimente a los ratones con comida y agua convencionalmente.
3. Criar a los ratones en el laboratorio animal en condiciones estables de temperatura ambiente (22 °C), humedad (50-60%), ciclo luz-oscuridad (12 h-12 h) e intensidad de luz ambiente (350-400 lux).
4. Preparar el equipo experimental: tomografía de coherencia óptica con oftalmoscopio láser de barrido confocal (cSLO) para animales pequeños (Figura 1A).
5. Preparar todos los materiales necesarios para el experimento (Figura 1B) y pesar los ratones (Figura 1C).

2. Registros de información

1. Registre la información: grupo, código, fecha de nacimiento, edad, sexo, peso y dosis de anestesia.

3. Inicio y prueba del instrumento

1. Encienda la computadora e inicie el software.
2. Haga clic en el botón Programa de prueba para completar el programa de prueba.
3. Encienda el termostato y precaliéntelo a la temperatura de 37 °C.
4. Inicie el procedimiento del módulo OCT después de la prueba del programa.
5. Cree un nuevo asunto y rellene la información del ratón.
6. Precalienta la manta eléctrica y cúbrela con toallas quirúrgicas.

4. Anestesia

1. Use polvo anestésico liofilizado que contenga Tiletamine y Zolazepam para preparar la mezcla anestésica.
   NOTA: Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para la elección, dosis y vía de administración de anestesia. Anestesiar al animal con un anestésico que proporcionará inmovilidad y pérdida de percepción del dolor durante al menos 1 hora, después de lo cual el animal se recupera rápidamente. La dosificación debe basarse en la duración del tiempo de experimento, el peso del animal y otros factores.
2. Anestesiar al animal usando la mezcla anestésica preparada. Asegúrese de mantener al animal caliente durante todo el procedimiento hasta la recuperación.

5. Aplicación de gotas midriáticas

1. Logre la sujeción manual del mouse por el desaliño, haga que el globo ocular sobresalga ligeramente y gire la cabeza del mouse con un ojo hacia arriba.
2. Aplicar las gotas midriáticas para dilatar las pupilas (Figura 2A).
3. Compruebe si hay dilatación de la pupila después de 10 min.

6. Colocación del ratón

1. Coloque un mouse en una plataforma de manta eléctrica.
2. Cubra ambos ojos con gel médico de hialuronato de sodio (Figura 2B).
3. Atornille una lente esférica doble 60 D (lente preestablecida) en el dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
4. Coloque una lente de contacto 100 D en la córnea del ratón con el lado cóncavo tocando el gel de hialuronato de sodio en la superficie corneal (Figura 2C, D y Figura 3A-II).
5. Coloque el ratón en la pequeña plataforma animal de temperatura constante y mantenga el ojo a 1-2 mm de distancia de la lente del dispositivo cSLO (Figura 3A).
6. Ajuste el ángulo de la lente de contacto con fórceps para mantener la pupila en el centro de la lente.
7. Ajuste los ajustes de la cabeza para que el ojo mire hacia adelante.

7. Oftalmoscopio láser de barrido confocal (cSLO)

1. Haga clic en el botón OCT , elija el módulo del mouse e inicie el programa cSLO (Figura 4B).
2. Seleccione el modo IR (fuente de luz: luz roja) y ajuste el parámetro (rango: 2047, Figura 4D).
3. Seleccione el ojo a examinar (ojo derecho: figura 4C-1; ojo izquierdo: figura 4C-2).
4. Controle la palanca y mueva la lente predefinida hacia la lente de contacto lentamente.
5. Ajuste el valor de las dioptrías hasta que la imagen del polo posterior sea clara (Figura 4E).
6. Haga más ajustes para alinear la imagen del polo posterior de la retina, centrándola en la cabeza del nervio óptico.

8. Tomografía de coherencia óptica (OCT)

1. Inicie el programa OCT (Figura 4G).
2. Haga clic en la barra de progreso hacia arriba y hacia abajo hasta que aparezca la imagen de OCT (Figura 4H).
3. Ajuste los parámetros: Rango mínimo (Figura 4I) = 0-20, Rango máximo (Figura 4J) = 40-60.
4. Ajuste la distancia preestablecida de la lente y la dirección de la posición hasta obtener una imagen OCT ideal.
5. Seleccione la posición de escaneo moviendo la línea estándar en el cSLO (Figura 4M).
6. Comience a escanear desde la cabeza del nervio óptico.
7. Recopilar imágenes en el mismo orden para cada ojo: línea horizontal: cabeza del nervio óptico → superior → inferior; Línea vertical: Cabeza del nervio óptico → nasal → temporal.
8. Recopila imágenes desde cuatro direcciones.
9. Haga clic en Promedio para superponer las señales de imagen cSLO y OCT (Figura 4F y Figura 4O).
10. Haga clic en el botón de disparo para adquirir la imagen SLO-OCT (Figura 4P).
11. Guarde y exporte todas las imágenes (Figura 4Q, R).

9. El final del experimento (después del examen PTU)

1. Coloque el mouse sobre la manta eléctrica para mantenerlo caliente hasta que se despierte.
   NOTA: El ratón debe ser monitoreado hasta que recupere suficiente conciencia para mantener la decúbito esternal. La exposición postoperatoria a la luz brillante debe minimizarse.
2. Retire la lente de contacto 100 D.
3. Aplique el gel ocular de levofloxacina para proteger la córnea.
4. Vuelva a colocar el ratón en la jaula después de que se despierte.
   NOTA: Asegúrese de que el ratón examinado no se devuelva a la compañía de otros ratones hasta que se recupere por completo.
5. Apague el software y apague el equipo.
6. Limpie la lente de contacto 100 D con agua; Seque la lente.
7. Limpiar y desinfectar el ambiente.

10. Análisis de imágenes

1. Compare las imágenes OCT de ratones knockout Vldlr con las de ratones C57BL / 6J.
2. Observe múltiples posiciones: escaneos verticales y horizontales que pasan a través de la papila óptica; exploraciones superiores, inferiores, nasales y temporales; y exploraciones anormales en el sitio de reflexión.
3. Observe el grosor, la forma, las capas y las lesiones de reflectancia anormal de la retina en cada imagen, así como la interfaz vítrea de la retina y el cuerpo vítreo.
4. Registre las ubicaciones, características y números de lesiones.

11. Corrección de la estratificación retiniana

1. Haga clic en Examen de carga en la interfaz de OCT (Figura 5A).
2. Llame a las imágenes OCT de un mouse desde una ventana emergente.
3. Seleccionar imágenes: escaneo de imágenes OCT a través de la papila óptica, horizontal o verticalmente.
4. Haga doble clic en la imagen en el contenedor de medios para mostrarla en la pantalla (Figura 5C).
5. Haga clic en Detección de capas para completar la estratificación automática en la retina (Figura 5D).
6. Seleccione las líneas divisorias a ambos lados de la capa preparada para el análisis (Figura 6D-10).
7. Seleccione una línea divisoria separada (Figura 6B-6) y haga clic en Editar capa (Figura 6A-1) para activar la línea cuando aparezca un círculo rojo (Figura 6B-7).
8. Ajuste el espaciado (Figura 6A-4, por ejemplo, 50) y el rango límite (Figura 6A-5, por ejemplo, 50).
9. Modifique la línea divisoria moviendo el círculo rojo (compare la línea divisoria verde en la Figura 6B y la Figura 6C; La figura 6C muestra el resultado modificado).

12. Espesor de laminación retiniana

1. Haga clic en el botón Marcador de medida (Figura 6D-9).
2. Seleccione la línea divisoria de la capa a analizar (por ejemplo, en la capa nuclear externa, seleccione la 4ª y^5ª línea divisoria de la lista) para mostrar el límite de la capa en la imagen OCT (Figura 6D-10).
3. Seleccione Conectar con capa (Figura 6D-11) y Permanezca conectado en movimiento (Figura 6D-12).
4. Seleccione el área para mostrar los resultados (la columna seleccionada está coloreada, Figura 6D-13).
5. Haga clic en la posición a analizar en la imagen de OCT para que aparezca la línea de medición (perpendicular al eje horizontal y consistente con el color del área resultante) (Figura 6D-14).
6. Haga clic en la siguiente columna para la siguiente medición y revele los datos anteriores (Figura 6E-15).
7. Lea el valor de Vert (grosor de la posición medida) en la fila Longitud en μm (tejido) (Figura 6E, rectángulo rojo).
8. Haga clic en Eliminar marcador (Figura 6E-16) y Nuevo marcador (Figura 6E-17) para volver a realizar la prueba de modo que los resultados cubran los datos originales (si es necesario volver a medirlos).
9. Presione Imprimir Scr en el teclado para guardar capturas de pantalla, o haga clic en Guardar examen para guardar directamente (Figura 5H).
10. Ingrese los datos en una hoja de cálculo o software estadístico para el análisis estadístico.

13. Medición del espesor total de la retina

1. Seleccione la línea 1 (ILM, membrana limitante interna, figura 7B) y la línea 7 (OS-RPE, SG: segmentos fotorreceptores externos; EPR: capa epitelial pigmentaria retiniana, figura 7C) en la lista de la esquina superior derecha.
   NOTA: El grosor retiniano completo significa el grosor de la capa del neurepitelio retiniano, que es la retina entre ILM y OS-RPE en OCT).
2. Mida el grosor de la retina en ambos lados de la papila óptica en un intervalo específico.
   1. Por ejemplo: a partir de la apariencia de la estructura retiniana en el borde de la papila óptica, medir 4 valores con un espaciado de 200 μm de la regla horizontal (Figura 7G, H).
3. Registra todos los valores medidos en una hoja de cálculo.
4. Utilice múltiples pruebas t (una por fila) para comparar los valores medidos de cada posición correspondiente en ambos grupos.

Resultados

Gracias a los escaneos de alta resolución de OCT, se pueden observar las capas de la retina del ratón y se pueden identificar reflejos anormales y sus ubicaciones exactas. Las imágenes de OCT retiniana de ratones knockout Vldlr y ratones C57BL / 6J se compararon en este estudio. Las imágenes OCT de todos los ratones C57BL / 6J mostraron varias capas retinianas con diferente reflectividad, y la demarcación fue clara (Figura 8D). En contraste, todos los ratones knockout Vldlr...

Discusión

En este estudio, se aplicaron imágenes de OCT utilizando un sistema de imágenes de retina de animales pequeños para evaluar los cambios retinianos en ratones knockout Vldlr , que demuestran desprendimiento vítreo posterior incompleto, neovascularización subretiniana y adelgazamiento del grosor de la retina. La OCT es un método de imagen no invasivo para examinar la condición de la retina in vivo. La mayoría de los dispositivos OCT están diseñados para el examen ocular humano. El tamaño del eq...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg