Anwendung der optischen Kohärenztomographie auf ein Mausmodell der Retinopathie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine in vivo bildgebende Technik mittels optischer Kohärenztomographie, um die Diagnose und quantitative Messung der Retinopathie bei Mäusen zu erleichtern.

Zusammenfassung

Die optische Kohärenztomographie (OCT) bietet eine nichtinvasive Methode zur Diagnose der Retinopathie. Das OCT-Gerät kann Netzhautschnittbilder erfassen, aus denen die Netzhautdicke berechnet werden kann. Obwohl die OCT in der klinischen Praxis weit verbreitet ist, ist ihre Anwendung in der Grundlagenforschung nicht so verbreitet, insbesondere bei Kleintieren wie Mäusen. Aufgrund der geringen Größe ihrer Augäpfel ist es schwierig, Fundusbildgebungsuntersuchungen bei Mäusen durchzuführen. Daher ist ein spezielles Netzhautbildgebungssystem erforderlich, um die OCT-Bildgebung an kleinen Tieren zu ermöglichen. Dieser Artikel zeigt ein kleintierspezifisches System für OCT-Untersuchungsverfahren und eine detaillierte Methode zur Bildanalyse. Die Ergebnisse der retinalen OCT-Untersuchung von Vldlr-Knockout-Mäusen (Very-Low-Density Lipoprotein Receptor) und C57BL/6J-Mäusen werden vorgestellt. Die OCT-Bilder von C57BL/6J-Mäusen zeigten Netzhautschichten, während die von Vldlr-Knockout-Mäusen subretinale Neovaskularisation und Netzhautausdünnung zeigten. Zusammenfassend könnte die OCT-Untersuchung den nichtinvasiven Nachweis und die Messung von Retinopathie in Mausmodellen erleichtern.

Einleitung

Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist ein bildgebendes Verfahren, das in vivo hochauflösende und Querschnittsbildgebung für Gewebe 1,2,3,4,5,6,7,8 liefern kann, insbesondere für die nichtinvasive Untersuchung in der Netzhaut 9,10,11,12 . Es kann auch verwendet werden, um einige wichtige Biomarker wie die Netzhautdicke und die Dicke der retinalen Nervenfaserschicht zu quantifizieren. Das Prinzip der OCT ist die optische Kohärenzreflektometrie, die aus der Kohärenz des von einer Probe reflektierten Lichts Gewebequerschnittsinformationen erhält und diese über ein Computersystem in eine grafische oder digitale Form umwandelt⁷. OCT wird häufig in Augenkliniken als wesentliches Werkzeug für Diagnose, Nachsorge und Management von Patienten mit Netzhauterkrankungen eingesetzt. Es kann auch Einblicke in die Pathogenese von Netzhauterkrankungen geben.

Neben klinischen Anwendungen wurde OCT auch in Tierversuchen eingesetzt. Obwohl die Pathologie der Goldstandard der morphologischen Charakterisierung ist, hat die OCT den Vorteil der nichtinvasiven In-vivo-Bildgebung und der longitudinalen Nachsorge. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die OCT gut mit der Histopathologie in Retinopathie-Tiermodellen^korreliert ist 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Die Maus ist das am häufigsten verwendete Tier in biomedizinischen Studien. Seine kleinen Augäpfel stellen jedoch eine technische Herausforderung für die Durchführung von OCT-Bildgebung bei Mäusen dar.

Im Vergleich zur OCT, die erstmals für die Netzhautbildgebung bei Mäusen verwendet wurde^21,22, wurde die OCT bei Kleintieren nun hinsichtlich Hard- und Softwaresystemen optimiert. Zum Beispiel reduziert OCT in Kombination mit dem Tracker das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich; System-Upgrades der OCT-Software ermöglichen die automatische Erkennung weiterer Netzhautschichten. und der integrierte DLP-Beamer hilft, die Bewegungsartefakte zu reduzieren.

Der Very-Low-Density-Lipoproteinrezeptor (Vldlr) ist ein Transmembranprotein in Endothelzellen. Es wird auf retinalen vaskulären Endothelzellen, retinalen Pigmentepithelzellen und um die äußere Grenzmembran^23,24 exprimiert. Subretinale Neovaskularisation ist der Phänotyp von Vldlr-Knockout-Mäusen ²³. Daher werden Vldlr-Knockout-Mäuse verwendet, um die Pathogenese und mögliche Therapie der subretinalen Neovaskularisation zu untersuchen. Dieser Artikel demonstriert die Anwendung der OCT-Bildgebung zur Erkennung von Netzhautläsionen bei Vldlr-Knockout-Mäusen, in der Hoffnung, eine technische Referenz für die Retinopathieforschung in Kleintiermodellen zu liefern.

Protokoll

Die Operationen wurden nach der Erklärung über die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung der Association for Research in Vision and Ophthalmology durchgeführt. Das Versuchsdesign wurde von der institutionellen Tierethikkommission (Medical Ethics Commission of JSIEC, EC 20171213(4)-P01) genehmigt. In dieser Studie wurden zwei Monate alte C57BL/6J-Mäuse und Vldlr-Knockout-Mäuse verwendet. Es gab 7 Mäuse in jeder Gruppe, die alle weiblich waren und 20 g bis 24 g wogen.

1. Versuchsbedingungen

1. Ordnen Sie die Mäuse zwei Gruppen zu: einer experimentellen Gruppe, die aus Vldlr-Knockout-Mäusen besteht, und einer Kontrollgruppe, die aus C57BL/6J-Mäusen besteht.
2. Füttern Sie die Mäuse konventionell mit Futter und Wasser.
3. Aufziehen der Mäuse im Tierlabor unter stabilen Bedingungen von Raumtemperatur (22 °C), Luftfeuchtigkeit (50-60%), Hell-Dunkel-Zyklus (12 h-12 h) und Raumlichtintensität (350-400 Lux).
4. Vorbereitung der experimentellen Ausrüstung: optische Kohärenztomographie mit konfokalem Scanning-Laserophthalmoskop (cSLO) für Kleintiere (Abbildung 1A).
5. Bereiten Sie alle für das Experiment erforderlichen Materialien vor (Abbildung 1B) und wiegen Sie die Mäuse (Abbildung 1C).

2. Informationsunterlagen

1. Notieren Sie die Informationen: Gruppe, Code, Geburtsdatum, Alter, Geschlecht, Gewicht und Anästhesiedosierung.

3. Inbetriebnahme und Testen des Instruments

1. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Software.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Testprogramm, um das Testprogramm abzuschließen.
3. Schalten Sie den Thermostat ein und heizen Sie ihn auf die Temperatur von 37 °C vor.
4. Starten Sie das OAT-Modul nach dem Programmtest.
5. Erstellen Sie einen neuen Betreff und füllen Sie die Mausinformationen aus.
6. Heizen Sie die Heizdecke vor und decken Sie sie mit OP-Handtüchern ab.

4. Anästhesie

1. Verwenden Sie lyophilisiertes Anästhesiepulver, das Tiletamin und Zolazepam enthält, um die Anästhesiemischung herzustellen.
   HINWEIS: Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für die Auswahl, Dosierung und den Weg der Anästhesieverabreichung. Betäuben Sie das Tier mit einem Anästhetikum, das für mindestens 1 Stunde für Immobilität und Verlust der Schmerzwahrnehmung sorgt, wonach sich das Tier schnell erholt. Die Dosierung sollte auf der Länge der Experimentzeit, dem Tiergewicht und anderen Faktoren basieren.
2. Betäuben Sie das Tier mit der vorbereiteten Anästhesiemischung. Stellen Sie sicher, dass das Tier während des gesamten Verfahrens bis zur Genesung warm bleibt.

5. Anwendung von mydriatischen Tropfen

1. Erreichen Sie eine manuelle Zurückhaltung der Maus durch den Scruff, lassen Sie den Augapfel leicht hervorstehen und drehen Sie den Mauskopf mit einem Auge nach oben.
2. Tragen Sie die mydriatischen Tropfen auf, um die Pupillen zu erweitern (Abbildung 2A).
3. Überprüfen Sie die Pupillenerweiterung nach 10 min.

6. Platzierung der Maus

1. Legen Sie eine Maus auf eine Heizdecke.
2. Beschichten Sie beide Augen mit medizinischem Natriumhyaluronat-Gel (Abbildung 2B).
3. Schrauben Sie eine doppelte sphärische 60-D-Linse (voreingestellte Linse) auf das cSLO-Gerät (Abbildung 1A-5, 6).
4. Legen Sie eine 100 D Kontaktlinse auf die Maushornhaut, wobei die konkave Seite das Natriumhyaluronat-Gel auf der Hornhautoberfläche berührt (Abbildung 2C, D und Abbildung 3A-II).
5. Platzieren Sie die Maus auf der kleinen Tierplattform mit konstanter Temperatur, und halten Sie das Auge 1 bis 2 mm vom Objektiv des cSLO-Geräts entfernt (Abbildung 3A).
6. Stellen Sie den Winkel der Kontaktlinse mit einer Pinzette ein, um die Pupille in der Mitte der Linse zu halten.
7. Passen Sie die Einstellungen am Kopf an, damit das Auge geradeaus zeigt.

7. Konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop (cSLO)

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche OAT , wählen Sie das Mausmodul aus, und starten Sie das cSLO-Programm (Abbildung 4B).
2. Wählen Sie den IR-Modus (Lichtquelle: rotes Licht) und passen Sie den Parameter an (Bereich: 2047, Abbildung 4D).
3. Wählen Sie das zu untersuchende Auge aus (rechtes Auge: Abbildung 4C-1; linkes Auge: Abbildung 4C-2).
4. Steuern Sie den Hebel und bewegen Sie die voreingestellte Linse langsam in Richtung Kontaktlinse.
5. Stellen Sie den Dioptrienwert ein, bis die hintere Polbildgebung klar ist (Abbildung 4E).
6. Nehmen Sie weitere Anpassungen vor, um das Bild des retinalen hinteren Pols auszurichten und ihn am Sehnervenkopf zu zentrieren.

8. Optische Kohärenztomographie (OCT)

1. Starten Sie das OAT-Programm (Abbildung 4G).
2. Klicken Sie auf den Statusbalken nach oben und unten, bis das OAT-Bild angezeigt wird (Abbildung 4H).
3. Passen Sie die Parameter an: Bereich Min (Abbildung 4I) = 0-20, Bereich Max (Abbildung 4J) = 40-60.
4. Passen Sie den voreingestellten Objektivabstand und die Positionsrichtung an, bis ein ideales OAT-Bild erhalten wird.
5. Wählen Sie die Scanposition aus, indem Sie die Standardzeile im cSLO verschieben (Abbildung 4M).
6. Beginnen Sie mit dem Scannen vom Sehnervenkopf.
7. Sammeln Sie Bilder in der gleichen Reihenfolge für jedes Auge: horizontale Linie: Sehnervenkopf → überlegen → minderwertig; vertikale Linie: Sehnervenkopf → nasal → temporal.
8. Sammeln Sie Bilder aus vier Richtungen.
9. Klicken Sie auf Mittelwert, um die cSLO- und OAT-Bildsignale zu überlagern (Abbildung 4F und Abbildung 4O).
10. Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche , um das SLO-OCT-Bild aufzunehmen (Abbildung 4P).
11. Speichern und exportieren Sie alle Bilder (Abbildung 4Q, R).

9. Das Ende des Experiments (nach der OCT-Untersuchung)

1. Legen Sie die Maus auf die Heizdecke, um sie warm zu halten, bis sie aufwacht.
   HINWEIS: Die Maus sollte überwacht werden, bis sie wieder ein ausreichendes Bewusstsein erlangt, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Die postoperative Exposition gegenüber hellem Licht sollte minimiert werden.
2. Entfernen Sie die Kontaktlinse 100 D.
3. Tragen Sie das Levofloxacin-Augengel auf, um die Hornhaut zu schützen.
4. Setzen Sie die Maus nach dem Aufwachen wieder in den Käfig.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die untersuchte Maus nicht in die Gesellschaft anderer Mäuse zurückgebracht wird, bis sie vollständig genesen ist.
5. Schalten Sie die Software aus und schalten Sie den Computer aus.
6. Reinigen Sie die Kontaktlinse 100 D mit Wasser; Trocknen Sie die Linse.
7. Reinigen und desinfizieren Sie die Umgebung.

10. Bildanalyse

1. Vergleichen Sie die OCT-Bilder von Vldlr-Knockout-Mäusen mit denen von C57BL/6J-Mäusen.
2. Beobachten Sie mehrere Positionen: vertikale und horizontale Scans, die durch die optische Papille verlaufen; überlegene, minderwertige, nasale und zeitliche Scans; und abnormale Reflexionsstellenscans.
3. Beobachten Sie die Dicke, Form, Schichtung und abnormale Reflexionsläsionen der Netzhaut in jedem Bild sowie die Glaskörperschnittstelle der Netzhaut und des Glaskörpers.
4. Notieren Sie die Orte, Merkmale und Anzahl der Läsionen.

11. Korrektur der Netzhautschichtung

1. Klicken Sie auf der OAT-Benutzeroberfläche auf Load Examination (Prüfung laden) (Abbildung 5A).
2. Rufen Sie die OAT-Bilder einer Maus aus einem Popupfenster auf.
3. Bilder auswählen: Scannen von OAT-Bildern durch die optische Papille, horizontal oder vertikal.
4. Doppelklicken Sie auf das Bild im Mediencontainer , um es auf dem Bildschirm anzuzeigen (Abbildung 5C).
5. Klicken Sie auf Layer Detection (Ebenenerkennung ), um die automatische Schichtung auf der Netzhaut abzuschließen (Abbildung 5D).
6. Wählen Sie die Trennlinien auf beiden Seiten der für die Analyse vorbereiteten Schicht aus (Abbildung 6D-10).
7. Wählen Sie eine separate Trennlinie aus (Abbildung 6B-6), und klicken Sie auf Edit Layer (Layer bearbeiten) (Abbildung 6A-1), um die Linie zu aktivieren, wenn ein roter Kreis angezeigt wird (Abbildung 6B-7).
8. Passen Sie den Abstand (Abbildung 6A-4, z. B. 50) und den Grenzbereich (Abbildung 6A-5, z. B. 50) an.
9. Ändern Sie die Trennlinie, indem Sie den roten Kreis verschieben (vergleichen Sie die grüne Trennlinie in Abbildung 6B und Abbildung 6C; Abbildung 6C zeigt das modifizierte Ergebnis).

12. Netzhautlaminierungsdicke

1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Measure Marker (Marker messen) (Abbildung 6D-9).
2. Wählen Sie die Trennlinie der zu analysierenden Schicht aus (z. B. wählen Sie in der äußeren Kernschicht die 4. und 5^. Trennlinie in der Liste aus), um die Begrenzung der Schicht auf dem OCT-Bild anzuzeigen (Abbildung 6D-10).
3. Wählen Sie Connect with Layer (Mit Layer verbinden) (Abbildung 6D-11) und Stay Connected on Move (Bei Bewegung verbunden bleiben) (Abbildung 6D-12).
4. Wählen Sie den Bereich aus, in dem die Ergebnisse angezeigt werden sollen (die ausgewählte Spalte ist farbig, Abbildung 6D-13).
5. Klicken Sie auf die zu analysierende Position im OAT-Bild, damit die Messlinie angezeigt wird (senkrecht zur horizontalen Achse und konsistent mit der Farbe des resultierenden Bereichs) (Abbildung 6D-14).
6. Klicken Sie auf die nächste Spalte für die nächste Messung und zeigen Sie die vorherigen Daten an (Abbildung 6E-15).
7. Lesen Sie den Vert-Wert (Dicke der gemessenen Position) in der Zeile Länge in μm (Gewebe) ab (Abbildung 6E, rotes Rechteck).
8. Klicken Sie auf Delete Marker (Delete Marker (Abbildung 6E-16) und New Marker (Abbildung 6E-17), um erneut zu testen, damit die Ergebnisse die Originaldaten abdecken (falls eine erneute Messung erforderlich ist).
9. Drücken Sie Print Scr auf der Tastatur, um Screenshots zu speichern, oder klicken Sie auf Save Examination (Untersuchung speichern), um direkt zu speichern (Abbildung 5H).
10. Geben Sie die Daten zur statistischen Analyse in eine Tabellenkalkulation oder Statistiksoftware ein.

13. Messung der vollen Netzhautdicke

1. Wählen Sie Zeile 1 (ILM, innere Begrenzungsmembran, Abbildung 7B) und Zeile 7 (OS-RPE, OS: äußere Photorezeptorsegmente; RPE: retinale Pigmentepithelschicht, Abbildung 7C) in der Liste in der oberen rechten Ecke.
   HINWEIS: Die volle Netzhautdicke bedeutet die Dicke der retinalen Neurepithelschicht, die die Netzhaut zwischen ILM und OS-RPE auf OCT ist).
2. Messen Sie die Netzhautdicke auf beiden Seiten der optischen Papille in einem bestimmten Intervall.
   1. Zum Beispiel: Messen Sie aus dem Aussehen der Netzhautstruktur am Rand der optischen Papille 4 Werte mit einem Abstand von 200 μm des horizontalen Lineals (Abbildung 7G, H).
3. Notieren Sie alle Messwerte in einer Tabelle.
4. Verwenden Sie mehrere t-Tests (einen pro Zeile), um die Messwerte jeder entsprechenden Position in beiden Gruppen zu vergleichen.

Ergebnisse

Dank der hochauflösenden Scans von OCT können die Schichten der Netzhaut der Maus beobachtet und abnormale Reflexionen und deren genaue Positionen identifiziert werden. Die retinalen OCT-Bilder von Vldlr-Knockout-Mäusen und C57BL/6J-Mäusen wurden in dieser Studie verglichen. Die OCT-Bilder aller C57BL/6J-Mäuse zeigten verschiedene Netzhautschichten mit unterschiedlicher Reflektivität, und die Abgrenzung war klar (Abbildung 8D). Im Gegensatz dazu zeigten alle Vldlr-Knockout...

Diskussion

In dieser Studie wurde die OCT-Bildgebung mit einem kleintierischen Netzhautbildgebungssystem angewendet, um Netzhautveränderungen bei Vldlr-Knockout-Mäusen zu bewerten, die eine unvollständige hintere Glaskörperablösung, subretinale Neovaskularisation und Netzhautdickenverdünnung zeigen. OCT ist ein nichtinvasives bildgebendes Verfahren, um den Zustand der Netzhaut in vivo zu untersuchen. Die meisten OCT-Geräte sind für die Untersuchung des menschlichen Auges konzipiert. Die Größe der Hardwar...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg