Применение оптической когерентной томографии к мышиной модели ретинопатии

Резюме

Здесь мы описываем метод визуализации in vivo с использованием оптической когерентной томографии для облегчения диагностики и количественного измерения ретинопатии у мышей.

Аннотация

Оптическая когерентная томография (ОКТ) предлагает неинвазивный метод диагностики ретинопатии. Машина OCT может захватывать перекрестные изображения сетчатки, по которым можно рассчитать толщину сетчатки. Хотя ОКТ широко используется в клинической практике, его применение в фундаментальных исследованиях не так распространено, особенно у мелких животных, таких как мыши. Из-за небольшого размера их глазных яблок сложно проводить исследования глазного дна у мышей. Поэтому для размещения ОКТ-визуализации на мелких животных требуется специализированная система визуализации сетчатки. В этой статье демонстрируется специфическая для мелких животных система для процедур обследования OCT и подробный метод анализа изображений. Представлены результаты ОКТ-исследования сетчатки нокаутирующих мышей липопротеиновых рецепторов очень низкой плотности (Vldlr) и мышей C57BL/6J. Изображения OCT мышей C57BL/6J показали слои сетчатки, в то время как изображения нокаутированных мышей Vldlr показали субретинальную неоваскуляризацию и истончение сетчатки. Таким образом, исследование OCT может облегчить неинвазивное обнаружение и измерение ретинопатии на мышиных моделях.

Введение

Оптическая когерентная томография (ОКТ) - это метод визуализации, который может обеспечить in vivo высокое разрешение и перекрестную визуализацию для тканей ^{1,2,3,4,5,6,7,8}, особенно для неинвазивного исследования в сетчатке ^9,10,11,12 . Он также может быть использован для количественной оценки некоторых важных биомаркеров, таких как толщина сетчатки и толщина слоя нервных волокон сетчатки. Принцип ОКТ заключается в оптической когерентной рефлектометрии, которая получает кросссекционную тканевую информацию из когерентности света, отраженного от образца, и преобразует ее в графическую или цифровую форму через компьютерную систему⁷. OCT широко используется в офтальмологических клиниках в качестве важного инструмента для диагностики, последующего наблюдения и лечения пациентов с заболеваниями сетчатки. Это также может дать представление о патогенезе заболеваний сетчатки.

В дополнение к клиническим применениям, OCT также использовался в исследованиях на животных. Хотя патология является золотым стандартом морфологической характеристики, ОКТ имеет преимущество неинвазивной визуализации in vivo и продольного наблюдения. Кроме того, было показано, что ОКТ хорошо коррелирует с гистопатологией в моделях ретинопатии животных ^{11,13,14,15,16,17,18,19,20}. Мышь является наиболее часто используемым животным в биомедицинских исследованиях. Тем не менее, его небольшие глазные яблоки представляют собой техническую проблему для проведения ВИЗУАЛИЗАЦИИ OCT у мышей.

По сравнению с OCT, впервые использованным для визуализации сетчатки у мышей^21,22, OCT у мелких животных в настоящее время оптимизирован в отношении аппаратных и программных систем. Например, OCT в сочетании с трекером значительно снижает отношение сигнал/шум; Обновления программной системы OCT позволяют автоматически обнаруживать больше слоев сетчатки; а встроенный DLP-излучатель помогает уменьшить артефакты движения.

Рецептор липопротеинов очень низкой плотности (Vldlr) представляет собой трансмембранный белок в эндотелиальных клетках. Экспрессируется на эндотелиальных клетках сосудов сетчатки, пигментных эпителиальных клетках сетчатки и вокруг наружной ограничивающей мембраны^23,24. Субретинальная неоваскуляризация является фенотипом нокаутирующих мышей Vldlr ²³. Поэтому нокаутирующие мыши Vldlr используются для исследования патогенеза и потенциальной терапии субретинальной неоваскуляризации. Эта статья демонстрирует применение OCT-визуализации для обнаружения поражений сетчатки у нокаутированных мышей Vldlr, в надежде предоставить некоторый технический справочник для исследований ретинопатии на моделях мелких животных.

протокол

Операции были выполнены в соответствии с Заявлением об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях от Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии. Экспериментальный проект был одобрен институциональным Комитетом по этике животных (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). В этом исследовании использовались двухмесячные мыши C57BL/6J и нокаутирующие мыши Vldlr . В каждой группе было 7 мышей, все из которых были самками и весили от 20 г до 24 г.

1. Экспериментальные условия

1. Отнесите мышей к двум группам: экспериментальной группе, состоящей из нокаутированных мышей Vldlr , и контрольной группе, состоящей из мышей C57BL/6J.
2. Кормите мышей пищей и водой условно.
3. Выращивают мышей в лаборатории животных в стабильных условиях комнатной температуры (22 °C), влажности (50-60%), светло-темного цикла (12 ч-12 ч) и интенсивности света в помещении (350-400 люкс).
4. Подготовьте экспериментальное оборудование: оптическую когерентную томографию с конфокальным сканирующим лазерным офтальмоскопом (цСЛО) для мелких животных (рисунок 1А).
5. Подготовьте все материалы, необходимые для эксперимента (рисунок 1B) и взвесьте мышей (рисунок 1C).

2. Информационные записи

1. Запишите информацию: группу, код, дату рождения, возраст, пол, вес и дозировку анестетика.

3. Запуск и тестирование прибора

1. Включите компьютер и запустите программное обеспечение.
2. Нажмите кнопку Тестовая программа , чтобы завершить тестовую программу.
3. Включите термостат и разогрейте его до температуры 37 °C.
4. Запустите процедуру модуля центр развертывания Office после тестирования программы.
5. Создайте новую тему и заполните информацию о мыши.
6. Разогрейте электрическое одеяло и накройте его хирургическими полотенцами.

4. Анестезия

1. Используйте лиофилизированный анестетиковый порошок, содержащий тилетамин и золазепам, для приготовления анестезирующей смеси.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных по выбору, дозировке и способу введения анестезии. Обезболить животное анестетиком, который обеспечит неподвижность и потерю болевого восприятия не менее чем на 1 час, после чего животное быстро восстанавливается. Дозировка должна основываться на продолжительности эксперимента, весе животного и других факторах.
2. Обезболить животное с помощью приготовленной анестезирующей смеси. Следите за тем, чтобы животное согревалось в течение всей процедуры до выздоровления.

5. Применение мидриатических капель

1. Добейтесь ручного удержания мыши за шиворот, заставьте глазное яблоко слегка выступать и поверните головку мыши одним глазом вверх.
2. Нанесите мидриатические капли для расширения зрачков (рисунок 2А).
3. Проверьте наличие расширения зрачка через 10 мин.

6. Размещение мыши

1. Поместите мышь на электрическую платформу для одеяла.
2. Обложите оба глаза медицинским геалуронатовым гелем натрия (рисунок 2B).
3. Прикрутите двойную сферическую линзу 60 D (предустановленную линзу) на устройстве cSLO (рисунок 1A-5, 6).
4. Поместите контактную линзу 100 D на роговицу мыши с вогнутой стороной, касающейся геля гиалуроната натрия на поверхности роговицы (рисунок 2C, D и рисунок 3A-II).
5. Поместите мышь на маленькую платформу для животных с постоянной температурой и держите глаз на расстоянии 1-2 мм от объектива устройства cSLO (рисунок 3A).
6. Отрегулируйте угол наклона контактной линзы щипцами, чтобы удержать зрачок в центре линзы.
7. Тонкая настройка головы, чтобы сделать лицо глаза прямым впереди.

7. Конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп (cSLO)

1. Нажмите кнопку OCT , выберите модуль мыши и запустите программу cSLO (рисунок 4B).
2. Выберите ИК-режим (источник света: красный свет) и отрегулируйте параметр (диапазон: 2047, рисунок 4D).
3. Выберите глаз для осмотра (правый глаз: рисунок 4C-1; левый глаз: рисунок 4C-2).
4. Управляйте рычагом и медленно перемещайте предустановленную линзу к контактной линзе.
5. Отрегулируйте значение диоптрий до тех пор, пока изображение заднего полюса не станет четким (рисунок 4E).
6. Внесите дополнительные коррективы, чтобы выровнять изображение заднего полюса сетчатки, центрируя его на головке зрительного нерва.

8. Оптическая когерентная томография (ОКТ)

1. Запустите программу OCT (рисунок 4G).
2. Щелкайте индикатор выполнения вверх и вниз, пока не появится изображение центра развертывания Office (рисунок 4H).
3. Настройка параметров: Диапазон Min (Рисунок 4I) = 0-20, Диапазон Макс (Рисунок 4J) = 40-60.
4. Отрегулируйте заданное расстояние объектива и направление позиционирования до получения идеального изображения OCT.
5. Выберите положение сканирования, переместив стандартную линию в cSLO (рисунок 4M).
6. Начните сканирование с головки зрительного нерва.
7. Собирайте изображения в одинаковом порядке для каждого глаза: горизонтальная линия: головка зрительного нерва → верхняя → нижняя; вертикальная линия: головка зрительного нерва → носовой → височной.
8. Собирайте изображения с четырех направлений.
9. Щелкните Среднее значение, чтобы наложить сигналы изображения cSLO и OCT (рисунок 4F и рисунок 4O).
10. Нажмите кнопку снимка , чтобы получить изображение SLO-OCT (рисунок 4P).
11. Сохраните и экспортируйте все изображения (рисунок 4Q, R).

9. Окончание эксперимента (после ОКТ-экспертизы)

1. Положите мышь на электрическое одеяло, чтобы держать ее в тепле, пока она не проснется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна находиться под наблюдением до тех пор, пока она не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Послеоперационное воздействие яркого света должно быть сведено к минимуму.
2. Снимите контактную линзу 100 D.
3. Нанесите левофлоксациновый гель для глаз для защиты роговицы.
4. Поместите мышь обратно в клетку после того, как она проснется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исследуемая мышь не возвращена компании других мышей до полного выздоровления.
5. Выключите программное обеспечение и выключите компьютер.
6. Очистите контактную линзу 100 D водой; высушить хрусталик.
7. Очищайте и дезинфицируйте окружающую среду.

10. Анализ изображений

1. Сравните изображения OCT нокаутирующих мышей Vldlr с изображениями мышей C57BL/6J.
2. Соблюдайте несколько положений: вертикальное и горизонтальное сканирование, проходящее через зрительный сосочек; верхнее, нижнее, носовое и височное сканирование; и сканирование аномальных мест отражения.
3. Наблюдайте толщину, форму, слоистость и аномальные отражающие поражения сетчатки на каждом изображении, а также границу раздела стекловидного тела сетчатки и стекловидного тела.
4. Запишите местоположение, характеристики и количество поражений.

11. Коррекция стратификации сетчатки

1. Щелкните Проверка нагрузки на интерфейсе центра развертывания Office (рисунок 5A).
2. Вызовите изображения центра развертывания Office мыши из всплывающего окна.
3. Выбор изображений: сканирование изображений OCT через оптический сосочек, горизонтально или вертикально.
4. Дважды щелкните изображение в медиаконтейнере , чтобы отобразить его на экране (рисунок 5C).
5. Нажмите « Обнаружение слоев», чтобы завершить автоматическое наслоение сетчатки (рисунок 5D).
6. Выделите разделительные линии по обеим сторонам слоя, подготовленного к анализу (рисунок 6D-10).
7. Выберите отдельную разделительную линию (рисунок 6B-6) и нажмите «Редактировать слой» (рисунок 6A-1), чтобы активировать линию при появлении красного круга (рисунок 6B-7).
8. Отрегулируйте расстояние (рисунок 6А-4, например, 50) и диапазон пределов (рисунок 6А-5, например, 50).
9. Измените разделительную линию, переместив красный круг (сравните зеленую разделительную линию на рисунках 6B и 6C; На рисунке 6C показан измененный результат).

12. Толщина ламинирования сетчатки

1. Нажмите кнопку Измерить маркер (рисунок 6D-9).
2. Выберите разделительную линию анализируемого слоя (например, во внешнем ядерном слое выберите^4-ю и^5-ю разделительную линию в списке), чтобы отобразить границу слоя на изображении OCT (рисунок 6D-10).
3. Выберите Соединиться со слоем (рисунок 6D-11) и оставайтесь на связи на ходу (рисунок 6D-12).
4. Выберите область для отображения результатов (выбранный столбец окрашен, рисунок 6D-13).
5. Щелкните позицию для анализа на изображении центра развертывания Office, чтобы линия измерения отображалась (перпендикулярная горизонтальной оси и соответствующая цвету результирующей области) (рисунок 6D-14).
6. Нажмите на следующий столбец для следующего измерения и отобразите предыдущие данные (рисунок 6E-15).
7. Считайте значение Vert (толщина измеряемого положения) в строке Length in μm (ткань) (рисунок 6E, красный прямоугольник).
8. Щелкните Удалить маркер (рисунок 6E-16) и Новый маркер (рисунок 6E-17) для повторного тестирования, чтобы результаты охватывали исходные данные (если необходимо повторное измерение).
9. Нажмите Print Scr на клавиатуре, чтобы сохранить скриншоты, или нажмите Save Examination (Сохранить экзамен), чтобы сохранить напрямую (рисунок 5H).
10. Введите данные в электронную таблицу или статистическое программное обеспечение для статистического анализа.

13. Измерение полной толщины сетчатки

1. Выберите линию 1 (ILM, внутренняя ограничивающая мембрана, рисунок 7B) и строку 7 (OS-RPE, OS: внешние сегменты фоторецептора; РПЭ: пигментный эпителиальный слой сетчатки, рисунок 7С) в списке в правом верхнем углу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полная толщина сетчатки означает толщину слоя нейрепителия сетчатки, который является сетчаткой между ILM и OS-RPE на OCT).
2. Измерьте толщину сетчатки с обеих сторон зрительного сосочка через определенный интервал.
   1. Например: от внешнего вида структуры сетчатки на краю зрительного сосочки измерьте 4 значения с расстоянием 200 мкм от горизонтальной линейки (рисунок 7G, H).
3. Запишите все измеренные значения в электронную таблицу.
4. Используйте несколько t-тестов (по одному на строку) для сравнения измеренных значений каждой соответствующей позиции в обеих группах.

Результаты

Благодаря сканированию с высоким разрешением OCT можно наблюдать слои сетчатки мыши, а также идентифицировать аномальные отражения и их точное местоположение. В этом исследовании сравнивались изображения OCT сетчатки нокаутированных мышей Vldlr и мышей C57BL/6J. Изображения OCT всех мышей...

Обсуждение

В этом исследовании OCT-визуализация с использованием системы визуализации сетчатки мелких животных была применена для оценки изменений сетчатки у нокаутирующих мышей Vldlr , которые демонстрируют неполную заднюю отслойку стекловидного тела, субретинальную неоваскуляризацию и ист...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100-Dpt contact lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens	Volk Optical,Inc, Mentor, OH		Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket	POPOCOLA	CW-DRT-01	50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL)	Kaile		0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel	EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD		5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel	Alcon	16H01E
Microliter syringes	Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD	Q31/0113000236C001-2017	50 µL
Povidone iodine solution	Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD		100 mL
RETImap	ROLAND CONSULT	19-99_50-2.1_1.2E	cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs	OSMO POCKET OT110	INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	Santen Pharmaceutical Co.,LTD		5 mg/mL
Xylazin	Sigma	X1251-5G	5 g
Zoletil 50	Virbac.S.A	7FRPA	Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg